專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)環(huán)境水樣中鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析方法，特別涉及環(huán)境水樣中鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的簡(jiǎn)單、快速、選擇性好的檢測(cè)分析方法。
背景技術(shù)：
鄰苯二甲酸酯(又稱(chēng)酞酸酯)是環(huán)境激素類(lèi)物質(zhì)中一類(lèi)化合物。它主要用作增塑劑即作為塑料的一種添加劑以增大塑料的可塑性和強(qiáng)度，還用于涂料、印染、化妝品、香水和食品包裝材料等的生產(chǎn)。在塑料中，鄰苯二甲酸酯在分子間起“潤(rùn)滑劑”作用，以提高聚合物的柔韌性；在化妝品和香料中，他們能夠延長(zhǎng)香味的保持時(shí)間。近年來(lái)隨著工業(yè)生產(chǎn)和塑料制品的使用，塑料垃圾的大量增加，由于鄰苯二甲酸酯與聚烯烴類(lèi)塑料分子之間非化學(xué)反應(yīng)的結(jié)合方式，而是由氫鍵或范德華力連接，彼此保留各自相對(duì)獨(dú)立的化學(xué)性質(zhì)，因此隨時(shí)間的推移，可由塑料中遷移到外部環(huán)境，對(duì)人類(lèi)和環(huán)境造成很大的危害。塑化劑類(lèi)似于人工荷爾蒙，具有雌性激素的功能，對(duì)男性、幼兒的傷害尤為嚴(yán)重。研究表明長(zhǎng)期攝取塑化劑會(huì)干擾內(nèi)分泌使女孩性早熟，男性生殖器變短小、性征不明顯、精液量和精子數(shù)量減少等。 塑化劑還會(huì)增加肝腎負(fù)擔(dān)，對(duì)免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)在造成慢性傷害，嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致肝癌。 目前已在大氣、水體、土壤等，乃至人體中普遍發(fā)現(xiàn)了鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物的存在。而且在2011年4月，臺(tái)灣日前出現(xiàn)在食品添加物起云劑中加入有害健康的塑化劑〃鄰苯二甲酸 O-乙基己基)酯〃(DEHP)事件，在臺(tái)灣引起軒然大波。也讓鄰苯二甲酸酯成為全球性的最普遍的一類(lèi)污染物，引起了各國(guó)學(xué)者的廣泛關(guān)注，對(duì)鄰苯二甲酸酯開(kāi)展了一系列的研究。1997年世界野生動(dòng)物基金會(huì)(WffF)將八種鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丙酯(DnPP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二戊酯 (DAP)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP)、鄰苯二甲酸正己酯(DnHP)、鄰苯二甲酸丁基苯基酯 (BBP)、鄰苯二甲酸二乙基己基)酯(DEHP)列為環(huán)境激素類(lèi)物質(zhì)。鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP)是一種白色結(jié)晶粉末，具有芳香氣味，可溶于丙酮、 乙醚、正丁醇、甲苯等有機(jī)溶劑以及熱的汽油，難溶于水，與聚氯乙烯、聚苯乙烯、硝酸纖維素等樹(shù)脂相容。鄰苯二甲酸二環(huán)己酯一種固體增塑劑，應(yīng)用十分廣泛，主要行業(yè)有塑料加工，如與硝酸纖維素和一些天然樹(shù)脂可制造防潮材料。還有印刷油墨、涂料和粘合劑等。而對(duì)于這些鄰苯二甲酸酯的分析目前大多用氣相色譜(GC)，氣相色譜與質(zhì)譜 (MS)聯(lián)用和高效液相色譜(HPLC)來(lái)完成。雖然這些方法均能很好的分離多種鄰苯二甲酸酯，但是色譜技術(shù)的重點(diǎn)是環(huán)境樣品的前處理，其過(guò)程復(fù)雜、操作費(fèi)時(shí)、分析成本昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)并適用多樣品同時(shí)檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控的痕量分析方法。本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案為一種檢測(cè)環(huán)境水樣中鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的方法，包括以下步驟
a 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立步驟在建立鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線之前，先配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。DCHP標(biāo)準(zhǔn)液用l_2mL的無(wú)水乙醇溶解后，再用比例為1 6 1 9的PBS與無(wú)水乙醇混合液稀釋一系列的濃度，分別為 20ng/mL、10ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、aig/mL、lng/mL、0. 8ng/mL、 0. 4ng/mL、0. 2ng/mL,0. lng/mL、0. 025ng/mL、0. 0125ng/mL。競(jìng)爭(zhēng)時(shí)加入這一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定結(jié)果的平均值經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理后繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。(1)包被步驟用濃度為7yg/mL的鄰苯二甲酸二環(huán)己酯包被抗原包被96孔酶標(biāo)板，每孔 10(^1^，放置培養(yǎng)箱371溫育池后，取出酶標(biāo)板，將孔內(nèi)溶液倒掉，每一次加滿洗滌液，靜置3-5min，再將其甩干，總共三次。(2)封閉步驟在包被好的酶標(biāo)準(zhǔn)版中加入1 %卵清蛋白(OVA)溶液，每孔150 μ L，封閉沒(méi)有包被抗原的多余的部分，避免抗體的非特異吸附在酶標(biāo)板上。37°C溫育30min后，取出同上洗滌 3次；(3)競(jìng)爭(zhēng)步驟每孔加入50 μ L鄰苯二甲酸二環(huán)己酯標(biāo)準(zhǔn)溶液和50 μ L酶標(biāo)記的鄰苯二甲酸二環(huán)己酯抗體使之發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。37°C下溫育池后，使待測(cè)物質(zhì)和固相抗原同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)抗體上的結(jié)合位點(diǎn)。加樣使應(yīng)將所加物加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出， 不可產(chǎn)生氣泡。然后同上洗滌。(4)檢測(cè)步驟加入底物液，并與酶發(fā)生反應(yīng)顯示顏色，每孔100 μ L，37°C下溫育30min后，用 2mol/L硫酸溶液的終止液停止反應(yīng)。用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490nm時(shí)的吸光強(qiáng)度。b:樣品的檢測(cè)步驟除C3)競(jìng)爭(zhēng)步驟每孔加入50 μ L不同水樣樣品和50 μ L鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的酶標(biāo)抗體，37°C下溫育池后，使待測(cè)物質(zhì)和固相抗原同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)抗體上的結(jié)合位點(diǎn)。然后同上洗滌，其余與a 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立步驟相同。為了建立方法的重復(fù)性好，以及檢測(cè)的準(zhǔn)確度，需要在樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。除C3)競(jìng)爭(zhēng)步驟每孔加入25 μ L水樣和25 μ L鄰苯二甲酸二環(huán)己酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入50 μ L鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的酶標(biāo)抗體，37°C下溫育池后，然后同上洗滌。其余與a 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立步驟相同。所述的包被抗原通過(guò)以下方法制備稱(chēng)取4-氨基鄰苯二甲酸二環(huán)己酯0.0138g先與0. ImL濃鹽酸(12mol/L)，再加 0. 75mL蒸餾水混合，溶解后，置冰浴中冷至4°C以下，3_8°C下均勻攪拌，滴入ImL 0. Imol/ L NaNO2溶液，加完后繼續(xù)攪拌30分鐘，加l_3mg尿素除去未反應(yīng)的NaNO2,此時(shí)即為反應(yīng)液 1 ；將含40mg卵清蛋白(OVA)溶于IOmL硼酸納緩沖液(pH9. 2)，然后逐滴加入上述的反應(yīng)液1中，并用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)到pH8-9，溶液顏色變成橙紅色即可，再繼續(xù)攪拌4h，得到抗原粗品；
將反應(yīng)液裝入透析袋(MD36，8，000 14，000)中，置蒸餾水透析5天，每天換水2 次，得到鄰苯二甲酸二環(huán)己酯包被抗原0VA-DCHP。所述的酶標(biāo)記的鄰苯二甲酸二環(huán)己酯抗體，通過(guò)以下方法制備免疫抗原的制備步驟稱(chēng)取4-氨基鄰苯二甲酸二環(huán)己酯0.055 先與0. ImL濃鹽酸(12mol/L)，再加3mL 蒸餾水混合，溶解后，置冰浴中冷至4°C以下，3-8°C下均勻攪拌，滴入4mL 0. lmol/L NaNO2 溶液；滴完后，繼續(xù)攪拌30分鐘，加6-12mg尿素除去未反應(yīng)的NaNO2，此時(shí)即為反應(yīng)液1 ；將含160mg牛血清蛋白(BSA)溶于40mL硼酸納緩沖液(pH9. 2)，然后逐滴加入上述的反應(yīng)液1中，并用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)到pH8-9，溶液顏色變成橙紅色即可，再繼續(xù)攪拌 4h，得到抗原粗品；將反應(yīng)液裝入透析袋(MD36 8, 000 14，000)中，置蒸餾水透析5天，每天換水2 次，得到鄰苯二甲酸二環(huán)己酯免疫抗原?？贵w的制備步驟取ImL鄰苯二甲酸二環(huán)己酯免疫抗原加入3mL0. 9%的生理鹽水配成濃度為Img/ HiL的溶液；①第一次免疫用等體積的完全弗氏佐劑和lmg/mL的免疫原混勻，當(dāng)混合后的免疫抗原滴進(jìn)盛有冷水的燒杯中時(shí)，能以油滴狀態(tài)完整地停留在水面上，而不擴(kuò)散，說(shuō)明免疫抗原已經(jīng)完全乳化，可以進(jìn)行注射；②首次注射用含完全弗氏佐劑的免疫抗原進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，之后用不完全弗氏佐劑的免疫抗原加強(qiáng)免疫。用剪刀剪去兔背部，酒精消毒，采用背部皮下多點(diǎn)注射的方法，每次背部皮下免疫8 10點(diǎn)，每次注射ImL ；③三周后開(kāi)始用不完全弗氏佐劑的免疫抗原加強(qiáng)免疫，以后每隔2周再次加強(qiáng)免疫，從第二次加強(qiáng)免疫開(kāi)始，每次免疫后第7天耳靜脈采血，室溫放置Ih后放入4°C冰箱，Ih 后離心分離出血清后測(cè)血清效價(jià)；④當(dāng)效價(jià)不再變化時(shí)，頸動(dòng)脈采血，血清室溫靜置0. 5-lh，在4°C冰箱靜止池后吸取上層澄清的血清，作為鄰苯二甲酸二環(huán)己酯抗體；動(dòng)物免疫方案
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)環(huán)境水樣中鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的方法，包括以下步驟 a:標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立步驟在建立鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線之前，先配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。鄰苯二甲酸二環(huán)己酯標(biāo)準(zhǔn)液用l_2mL的無(wú)水乙醇溶解后，再用比例為1 6 9的稀釋液與無(wú)水乙醇混合液稀釋一系列的濃度，分別為 20ng/mL、10ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、lng/mL、0. 8ng/ mL、0. 4ng/mL、0. 2ng/mL,0. lng/mL、0. 025ng/mL、0. 0125ng/mL ；競(jìng)爭(zhēng)時(shí)加入這一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定結(jié)果的平均值經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理后繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線；(1)包被步驟用濃度為7μ g/mL的鄰苯二甲酸二環(huán)己酯包被抗原包被96孔酶標(biāo)板，每孔100 μ L，放置培養(yǎng)箱37°C溫育池后，取出酶標(biāo)板，將孔內(nèi)溶液倒掉，每一次加滿洗滌液，靜置3-5min， 再將其甩干，總共三次；(2)封閉步驟在包被好的酶標(biāo)準(zhǔn)版中加入卵清蛋白溶液，每孔150yL，37°C溫育30min后，取出同上洗滌3次；(3)競(jìng)爭(zhēng)步驟每孔加入50 μ L鄰苯二甲酸二環(huán)己酯標(biāo)準(zhǔn)溶液和50 μ L酶標(biāo)記的鄰苯二甲酸二環(huán)己酯抗體，37°C下溫育池后，然后同上洗滌；(4)檢測(cè)步驟加入底物液，并與酶發(fā)生反應(yīng)顯示顏色，每孔100μ ，37 下溫育30min后，用2mol/L 硫酸溶液的終止液停止反應(yīng)；用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490nm時(shí)的吸光強(qiáng)度； b 樣品的檢測(cè)步驟除(3)競(jìng)爭(zhēng)步驟每孔加入50 μ L不同水樣樣品和50 μ L鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的酶標(biāo)抗體，37°C下溫育池后，然后洗滌，其余與a:標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立步驟相同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)環(huán)境水樣中鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的方法，其特征在于除(3)競(jìng)爭(zhēng)步驟每孔加入25yL水樣和25yL鄰苯二甲酸二環(huán)己酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入 50 μ L鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的酶標(biāo)抗體，37°C下溫育池后，然后同上洗滌。其余與a 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立步驟相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)環(huán)境水樣中鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的方法，其特征在于所述的鄰苯二甲酸二環(huán)己酯包被抗原通過(guò)以下方法制備稱(chēng)取4-氨基鄰苯二甲酸二環(huán)己酯0. 0138g先與0. ImL濃鹽酸(12mol/L)，再加0. 75mL 蒸餾水混合，溶解后，置冰浴中冷至4°C以下，3-8°C下均勻攪拌，滴入ImL 0. lmol/L NaNO2 溶液，加完后繼續(xù)攪拌30分鐘，加l_3mg尿素除去未反應(yīng)的NaNO2，此時(shí)即為反應(yīng)液1 ；將含40mg卵清蛋白溶于IOmL硼酸納緩沖液，然后逐滴加入上述的反應(yīng)液1中，并用 lmol/L NaOH調(diào)節(jié)到pH8-9，溶液顏色變成橙紅色即可，再繼續(xù)攪拌4h，得到抗原粗品；將反應(yīng)液裝入透析袋，置蒸餾水透析5天，每天換水2次，得到鄰苯二甲酸二環(huán)己酯包被抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)環(huán)境水樣中鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的方法，其特征在于所述的酶標(biāo)記的鄰苯二甲酸二環(huán)己酯抗體的制備工序，包括免疫抗原的制備步驟、抗體的制備步驟、酶標(biāo)抗體的制備步驟所述的酶標(biāo)抗體的制備步驟辣根過(guò)氧化物酶IOmg溶于0.4mL 0. 05mol/L pH9. 6碳酸鹽緩沖液，待溶解后加入25% 戊二醛0. lmL，然后37°C溫育濁；再加入0-4°C的無(wú)水乙醇2mL，2500r/min離心15min，傾去上清液；取沉淀以80%乙醇(v/v) 4mL混懸，2500r/min離心15min，傾去乙醇，將管倒置，使乙醇充分流出；沉淀用ImL 0. 05mol/L pH9. 6碳酸鹽緩沖液溶解，加入0. 5_lmL鄰苯二甲酸二環(huán)己酯抗體溶液，放在冰箱內(nèi)4°C過(guò)夜后，加入0. 5-aiigNaH2P04，調(diào)至溶液pH7-8即可，制備好的酶標(biāo)抗體放置在4°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測(cè)環(huán)境水樣中鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的方法，其特征在于所述的免疫抗原的制備步驟稱(chēng)取4-氨基鄰苯二甲酸二環(huán)己酯0. 0553g先與0. ImL濃鹽酸(12mol/L)，再加3mL蒸餾水混合，溶解后，置冰浴中冷至4°C以下，3-8°C下均勻攪拌，滴入4mL 0. lmol/L NaNO2溶液；滴完后，繼續(xù)攪拌30分鐘，加6-12mg尿素除去未反應(yīng)的NaNO2，此時(shí)即為反應(yīng)液1 ；將含160mg牛血清蛋白溶于40mL硼酸納緩沖液(pH9. 2)，然后逐滴加入上述的反應(yīng)液 1中，并用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)到pH8-9，溶液顏色變成橙紅色即可，再繼續(xù)攪拌4h，得到抗原粗品；將反應(yīng)液裝入透析袋中，置蒸餾水透析5天，每天換水2次，得到鄰苯二甲酸二環(huán)己酯免疫抗原。所述的抗體的制備步驟取ImL鄰苯二甲酸二環(huán)己酯免疫抗原加入3mL0. 9%的生理鹽水配成濃度為lmg/mL的溶液；①第一次免疫用等體積的完全弗氏佐劑和lmg/mL的免疫原混勻，當(dāng)混合后的免疫抗原滴進(jìn)盛有冷水的燒杯中時(shí)，能以油滴狀態(tài)完整地停留在水面上，而不擴(kuò)散，說(shuō)明免疫抗原已經(jīng)完全乳化，可以進(jìn)行注射；②首次注射用含完全弗氏佐劑的免疫抗原進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，之后用不完全弗氏佐劑的免疫抗原加強(qiáng)免疫。用剪刀剪去兔背部，酒精消毒，采用背部皮下多點(diǎn)注射的方法，每次背部皮下免疫8 10點(diǎn)，每次注射ImL ；③三周后開(kāi)始用不完全弗氏佐劑的免疫抗原加強(qiáng)免疫，以后每隔2周再次加強(qiáng)免疫， 從第二次加強(qiáng)免疫開(kāi)始，每次免疫后第7天耳靜脈采血，室溫放置Ih后放入4°C冰箱，Ih后離心分離出血清后測(cè)血清效價(jià)；④當(dāng)效價(jià)不再變化時(shí)，頸動(dòng)脈采血，血清室溫靜置0.5-lh，在4°C冰箱靜止池后吸取上層澄清的血清，作為鄰苯二甲酸二環(huán)己酯抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)環(huán)境水樣中鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的方法，包括以下步驟a標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立步驟、b樣品的檢測(cè)步驟。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，不僅具有鄰苯二甲酸二環(huán)己酯抗原抗體的選擇性，而且酶促反應(yīng)可以放大測(cè)定信號(hào)，提高靈敏度，同時(shí)辣根過(guò)氧化物酶在市場(chǎng)中很普遍，價(jià)廉適合推廣。所以如此簡(jiǎn)單、快速、成本低、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的分析方法在適合環(huán)境中鄰苯二甲酸二環(huán)己酯污染物的微量監(jiān)測(cè)提供了便利。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102539744SQ20111041971
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者張明翠, 王悅 申請(qǐng)人:安徽師范大學(xué)