專利名稱：測量作為瘙癢的客觀量度的皮膚中的組胺的非侵入性方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測量皮膚樣品中的組胺量和組胺量的客觀聯(lián)系與關(guān)聯(lián)的方法，因為它與哺乳動物的瘙癢感直接相關(guān)聯(lián)。
背景技術(shù)：
過去已經(jīng)評估過瘙癢癥狀在頭皮皮炎中的嚴重性。與不健康的頭皮相關(guān)聯(lián)的最為頻繁描述的癥狀是瘙癢。這也是最令人煩惱的癥狀，其對患者的生活質(zhì)量具有最大的負面影響。關(guān)于瘙癢的一般生理學，瘙癢感代表在皮膚表面啟動的復(fù)雜生理學途徑的終止。 許多刺激能夠啟動最終導(dǎo)致瘙癢感的級聯(lián)事件。所述刺激與真皮中的特定受體細胞一起觸發(fā)組胺的釋放。組胺然后結(jié)合到神經(jīng)末梢，啟動沿神經(jīng)纖維的電傳導(dǎo)途徑，其沿脊柱被轉(zhuǎn)移直到被腦部接收并感到瘙癢。一般來講，雖然存在廣泛的潛在瘙癢介質(zhì)，但組胺被認為是典型的瘙癢生理化學介質(zhì)。組胺是一種小分子胺，其在1927年被證明是皮膚組織的天然組分(因此該名稱來自希臘語單詞“組織”，histos)。組胺對瘙癢的直接作用的關(guān)鍵證據(jù)是抗組胺劑能夠非常有效地減輕一些皮膚病癥中的瘙癢。支持組胺作用的另一個觀點是它能夠用于實驗性地引發(fā)瘙癢。就具體實例而言，已經(jīng)研究了多種特定皮膚病癥的組胺和瘙癢之間的關(guān)聯(lián)程度。 在組胺水平和病癥例如蕁麻疹和昆蟲叮咬的瘙癢嚴重性之間存在極大的關(guān)聯(lián)。與特應(yīng)性皮炎之間的關(guān)聯(lián)未被很好地確定。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)濕疹和牛皮癬患者皮膚中的組胺水平較高。甚至已發(fā)現(xiàn)干燥的皮膚導(dǎo)致較高的組胺水平。雖然先前未曾研究過頭皮屑和皮脂溢性皮炎中的組胺水平，但在瘙癢嚴重性和組胺水平之間可能存在極大的關(guān)聯(lián)。首先，牛皮癬和頭皮屑都具有許多共同的病因?qū)W特征，從而使得將對牛皮癬建立的組胺-瘙癢關(guān)聯(lián)應(yīng)用于頭皮屑也是可能的。它也已經(jīng)得到證明[Harding，C.，A. Moore, J. Rogers, H. Meldrum 等人，Dandrudruff :a condition characterized by decreased levels of intercellular lipids in scalp stratum corneum and impaired barrier function. Arch. Dermatol. Res. ,2002. 294 第 221-230 頁]，響應(yīng)于局部施用的組胺，頭皮屑患者的瘙癢發(fā)生率提高，從而證明了與頭皮屑相關(guān)聯(lián)的頭皮瘙癢與組胺的生理學關(guān)聯(lián)?？勺鳛轲W介質(zhì)的供選擇的生物標記物是P物質(zhì)(Substance P)和大麻素類。其它可能的介質(zhì)由 Neurophysiology of Pruritus ；Cutaneous Elicitation of Itch ；Arch Dermatol./第139卷，2003年11月提供，并且它們以引用方式并入本文。發(fā)明概述本發(fā)明的一個實施方案涉及測量表皮中的組胺的方法，所述方法包括將粘附制品施用到哺乳動物的上皮；使上皮細胞粘附到粘附制品；從哺乳動物的上皮移除粘附制品； 使用用于萃取的標準實驗室方法來制備粘附制品；從粘附到所述粘附制品的上皮細胞中萃取組胺；測量粘附到所述粘附制品的上皮細胞中的組胺；測定與基線樣品相比組胺在上皮細胞中的量。本發(fā)明的另一個實施方案是客觀地測量哺乳動物的瘙癢感的方法，所述方法包括以下步驟將粘附制品施用到哺乳動物的上皮；使粘附制品與上皮細胞粘附；從哺乳動物的上皮移除粘附制品；使用用于萃取的標準實驗室方法來制備粘附制品；從粘附到所述粘附制品的上皮細胞中萃取組胺；測量粘附到所述粘附制品的上皮細胞中的組胺；并且測定與基線樣品相比組胺在上皮細胞中的量。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來講，通過閱讀本說明書的公開內(nèi)容，本發(fā)明的這些和其它特征、方面和優(yōu)點將變得顯而易見。附圖概述

圖1是在用抗頭屑洗發(fā)劑處理后與基線相比組胺減少的測量結(jié)果。圖2是在用抗頭屑洗發(fā)劑處理后與基線相比組胺水平降低的測量結(jié)果。圖3是與無頭皮屑組和用抗頭屑洗發(fā)劑處理后相比較的組胺水平的測量結(jié)果。圖4是用抗頭屑洗發(fā)劑處理的測量結(jié)果，所述處理已經(jīng)導(dǎo)致組胺相對于無頭皮屑水平改善了 79%圖5是用抗頭屑洗發(fā)劑處理三周后測量瘙癢感的視覺類似物標度的測量結(jié)果。圖6和圖7是基線和用抗頭屑洗發(fā)劑處理三周后的組胺測量結(jié)果的并列型直接比較，其通過測量基線和用抗頭屑洗發(fā)劑處理三周后的瘙癢感測量結(jié)果進行。發(fā)明詳述雖然在說明書之后提供了特別指出和清楚地要求保護本發(fā)明的權(quán)利要求書，但是據(jù)信，通過下面的描述可以更好地理解本發(fā)明。本發(fā)明可包括、由或基本上由本文所述的本發(fā)明的基本成分和限制以及本文所述的任何另外的或任選的成分、組分或限制組成。除非另外指明，所有的百分比、份數(shù)和比率均按本發(fā)明組合物的總重量計。所有與所列成分相關(guān)的此類重量均基于活性物質(zhì)的含量計，并因此不包括可能包含在可商購獲得的原料中的載體或副產(chǎn)物。本發(fā)明的各個實施方案中的組分和/或步驟，包括可任選加入的那些，詳細描述于下文。所有引用文獻的相關(guān)部分均引入本文以供參考；任何文獻的引用不可解釋為是對其作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)的認可。除非另外特別說明，所有比率都是重量比。除非另外特別說明，所有溫度均以攝氏度為單位。除非另外指明，所有包括數(shù)量、百分比、分數(shù)和比例的量均被理解為由詞“約”所修飾，并且量并不旨在表示有效數(shù)字。除非另外說明，“一個”和“所述”是指“一個或多個”。本文中“包括”是指可加入不影響最終結(jié)果的其它步驟和成分。此術(shù)語包括術(shù)語 “由...組成”和“基本上由...組成”。本發(fā)明組合物和方法/過程可包括、由和基本上由本文所述的本發(fā)明基本元素和限制以及本文所述的任何附加的或任選的成分、組分、步驟或限制組成。本發(fā)明中，“有效”是指主題活性物質(zhì)的量足夠高以能夠向待治療的病癥提供積極有效的改善。主題活性物質(zhì)的有效量將隨待治療的具體病癥、病癥的嚴重程度、療程、同期聯(lián)合治療的特性等因素而變化。術(shù)語“皮膚”指脊椎動物的外皮，其由兩層細胞組成，分別是厚的內(nèi)層(真皮)和薄的外層(表皮)。表皮是皮膚外部的非血管層。它由從內(nèi)到外的五層上皮構(gòu)成(1)基底層(表皮基底層)；( 棘層(棘細胞層)；C3)顆粒層(表皮顆粒層)；(4)透明層(表皮透明層)；和(5)角質(zhì)層(表皮角質(zhì)層)。術(shù)語“樣品”指來自受試者皮膚或表皮的任何制備物。術(shù)語“非侵入性”指不需要將器械或裝置插入皮膚或身體孔口進行診斷或治療的方法。術(shù)語“粘合裝置”指通過在基底上使用粘合劑或粘附材料以移除皮膚的表皮層的裝置。例如可使用粘性膠帶如D-Squame (聚丙烯酸酯粘合劑；CuDerm Dallas TX)、 Durapor, Sebutape (丙烯酸類聚合物膜；CuDern ；Dallas, TX)、Tegaderm , Duct 膠帶 (333Duct Tape, Nashua 膠帶產(chǎn)品)、Scotch Tape (3M Scotch 810，St. Paul, Minn.)、 Diamond (The Sellotape Company ；Eindhoven, the Netherlands) > Sentega ( Μ ^ Μ^ 帶，Sentega Eiketten BV, Utrecht, The Netherlands)來給皮膚取樣。所述粘合劑可為任何常用的壓敏型粘合劑或那些在皮膚上快速固化的膠粘劑(例如氰基丙烯酸酯)。所述粘合劑可在柔性的或剛性的背襯上以使取樣更容易。恒壓裝置(例如Desquame Pressure Instrument, CuDerm ；Dallas, TX)可用于在取樣期間給粘合裝置施壓。來自組織的樣品可通過本領(lǐng)域熟知的任何數(shù)目的裝置來分離。用于分離樣品的侵入性方法包括使用針(例如在血液采樣期間)，以及不同組織的活組織檢查、起泡和激光穿孔。由于這些技術(shù)的侵入性本質(zhì)，存在增加的死亡率和發(fā)病率風險。此外，侵入性技術(shù)能夠非故意地影響皮膚狀態(tài)，這可能導(dǎo)致不精確的或虛假的結(jié)果。此外，侵入性技術(shù)難以對大種群實施。侵入性技術(shù)可能導(dǎo)致受試者不適并且可能導(dǎo)致感染的風險增大或其它副作用。本發(fā)明提供用于測量皮膚中組胺的非侵入性方法。術(shù)語“客觀地”指無成見的或無偏見的。作為另外一種選擇，任何專家或自我評估本質(zhì)上是“客觀的”。術(shù)語“正?；焙?或“正常的”指一組瘙癢患者接近無瘙癢狀態(tài)組或正常狀態(tài)組的程度。術(shù)語“標準化”和/或“標準化的”指相對于在對應(yīng)的粘合劑或粘附制品上測得的蛋白質(zhì)量的組胺值。非限制性實例將為ng組胺/ μ g可溶解蛋白。術(shù)語“基線”指在研究開始時收集的信息，從中測量研究中存在的變化。在本發(fā)明的另一個實施方案中，存在許多可使用的供選擇“非侵入性”取樣方法。Sebutape 這是一種非侵入性方法，其中Sebutape (丙烯酸類聚合物膜； CuDerm5Dallas, TX)僅有非常輕微的粘性，并且可被施用到甚至看得見紅腫的皮膚并從所述皮膚上移除而不會引起不適。通過這種技術(shù)回收/測定的生物標記物已經(jīng)包括蛋白質(zhì) (例如細胞因子)、肽(例如神經(jīng)肽)、和小分子(例如一氧化氮)介質(zhì)。在歷史上，制造并售賣這種膠帶用于皮脂收集并且因此能夠用于脂質(zhì)分析。D-Squame : D-Squame 膠帶是聚丙烯酸酯粘合劑，也由CuDerm制造。它可用
于回收相同的生物標記物，但也移除某些表皮結(jié)構(gòu)蛋白(例如角質(zhì)、包膜素)。它也已經(jīng)被用于回收作為全身炎癥標記的皮質(zhì)醇和血清白蛋白、小分子和角質(zhì)層脂質(zhì)。杯刮法(Cup Scrubs)杯刮法通常在緩沖液和非離子表面活性劑的存在下直接從皮膚表面提取蛋白質(zhì)。杯刮法主要用于回收可溶解的生物標記物例如細胞因子，但是也可用于回收小的有機分子。從杯刮法中能夠回收并定量比膠帶剝離法多得多的細胞因子。這可能是由于多個原因(a)由于存在洗滌劑并且它們是液體，杯刮法最可能地取樣與膠條法不同的蛋白質(zhì)組；(b)用杯刮法，不必在收集樣品后進一步提取細胞因子，因為它們已經(jīng)存在于溶液中。動物(即狗)收集方法D-Squame : D-Squame 膠帶樣品從狗皮膚上通過它們的毛皮(無需剃刮)來收集?？蓮哪z帶中分析與皮膚炎癥相關(guān)的多種生物標記物、分化和屏障完整性，其包括總蛋白、可溶解蛋白、皮膚多個分析物特征(皮膚MAP)、皮膚細胞因子和角質(zhì)層脂質(zhì)(神經(jīng)酰胺、膽固醇、脂肪酸)。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明提供非侵入地獲取用于分離組胺的樣品的方法和分析。在一個實施方案中，粘合裝置可用于完成此類取樣。在此類用于頭皮屑取樣的取樣研究中，在基線隨訪中定量篩分機將完成每個受試者的頭皮粘附鱗屑評分(ASFS)分級，并且最高的片狀剝落八分體將被鑒定成用于膠帶剝離取樣。最高的片狀剝落八分體將在第3周進行基線取樣。將在每個時間點上從每個受試者中收集膠帶剝離樣品(基線和第3周)。就每個受試者而言，將有兩個膠帶剝離取樣位點，它們都在相同八分體(即，在基線和第3周的最高片狀剝落八分體)內(nèi)并且通過合適的方法準備頭皮以進行取樣。按需另外重復(fù)所述膠帶剝離取樣若干次，在之前的取樣區(qū)域頂部的相同位點放置每個D-Squame 膠帶盤。在收集樣品后將D-Squame 膠帶置于標記板中適當?shù)貥擞浀目變?nèi)。在取樣后進行萃取和定量程序。在本發(fā)明的一個實施方案中，可使用High Sensitivity Enzyme Immunoassay 進行 D-Squame Tape Samples 的提取物的組胺定量。(Histamine EIA 試劑盒(US Distributor, Cayman#589651/Histamine EIA kit Manufacture(France)，SPbio#A05890)在本發(fā)明的該實施方案中，在制備中使用Histamine Sensitivity Enyme測定法進行的樣品萃取是D-Squame Tape Samples板從_80°C冷凍機中移出，它們在樣品收集后被儲存在其中，并被置于干冰上。將膠帶插入預(yù)先標記的聚丙烯收集管中，粘合面朝內(nèi)。將合適的標準萃取緩沖液加入到每個收集管中，然后在冰上用超聲處理萃取30分鐘。從膠帶中分離每個萃取溶液并將每個樣品的等分試樣置于96孔聚丙烯板的指定位置。然后用常規(guī)試劑例如白蛋白補充D-Squame Tape樣品的萃取物等分試樣以幫助防止分析物在實驗室器具壁上的損失，將其轉(zhuǎn)移到96孔聚丙烯深孔板上并在-80°c溫度下凍存以用于組胺分析。另一份等分試樣不補充試劑并且用BCA Protein Assay Kit,Pierce catalog#23227分析可溶解的蛋白。在萃取過程后，可通過常規(guī)方法來制備組胺標準品和對照物。組胺將用購自 SPI-BI0、由Cayman Chemical Co.分裝的組胺酶免疫測定方法(EIA)試劑盒來定量?？赏ㄟ^常規(guī)方法來制備洗滌緩沖液、衍生試劑、Histamine ACHe示蹤劑和Ellman試劑。將標準品、對照物和樣品固定在深孔板內(nèi)。用緩沖液來清洗板并將標準品、空白、樣品和質(zhì)量控制物加到板中，并在4°C溫度下孵育M小時。然后在加入Elman試劑之前清洗板并在室溫下避光孵育?？赏ㄟ^標準分光光度法來讀板。通過標準統(tǒng)計方法和計算進行數(shù)據(jù)分析。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可使用反相梯度高效液相色譜法與串聯(lián)質(zhì)譜儀 (HPLC/MS/MS)從粘附制品、膠帶的萃取物中定量組胺。將得自人類受試者的頭皮的膠帶剝離物(單個或多個膠帶剝離物)置于單個聚丙烯小瓶中，在每個小瓶中加入穩(wěn)定的同位素標記的組胺(D4-組胺)內(nèi)標(ISTD)，然后在酸溶液中用超聲波萃取10分鐘。從膠帶剝離物中分離每個提取物溶液并將每個樣品的等分試樣置于96孔聚丙烯板的指定位置。在96-孔聚丙烯板中用加入ISTD的酸溶液來制備一組組胺標準品，其包括合適的校準范圍。使用反相梯度高效液相色譜法與串聯(lián)質(zhì)譜儀 (HPLC/MS/MS)來分析標準品和頭皮膠帶剝離物的提取物。通過陽離子電噴霧(ESI)，使用表1所示的選擇-反應(yīng)-監(jiān)測方案監(jiān)測組胺和ISTD。通過給信號繪圖構(gòu)建標準曲線，本文將其定義為每個標準品與對應(yīng)于標準品的組胺質(zhì)量的峰面積比率(峰面積組胺/峰面積 ISTD)。然后使用生成的回歸方程式來倒算在校準基準和人類頭皮提取物樣品中的組胺質(zhì)量?？蓪⒔Y(jié)果報告為組胺/膠帶剝離物的質(zhì)量，或者可通過除以也存在于膠帶剝離提取物中的蛋白質(zhì)的量將結(jié)果標準化。已經(jīng)分別描述了蛋白質(zhì)方法。表 權(quán)利要求
1.一種用于測量表皮中的組胺的方法，所述方法包括a)將粘附制品施用到哺乳動物的上皮；b)使上皮細胞粘附到所述粘附制品；c)從所述哺乳動物的上皮移除所述粘附制品；d)使用用于萃取的標準實驗室方法來制備所述粘附制品；e)從粘附到所述粘附制品的上皮細胞中萃取組胺；f)測量來自粘附到所述粘附制品的上皮細胞的組胺；g)測定與基線樣品相比組胺在所述上皮細胞中的量。
2.如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中通過將所述組胺除以所述粘附制品上的蛋白質(zhì)的量來標準化所述組胺。
3.如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述方法是非侵入性的。
4.如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述上皮包括角質(zhì)層。
5.如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中與組胺的基線水平相比，標準化的組胺水平降低了 46%。
6.如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述組胺水平降低了25%至100%。
7.如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中在施用抗真菌洗發(fā)劑、優(yōu)選抗頭屑洗發(fā)劑、 更優(yōu)選1-氧-2-巰基吡啶鋅洗發(fā)劑之后，標準化的組胺與所述施用前的組胺的基線水平相比降低了 46%。
8.如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中與正常人群相比，有79%的瘙癢改善。
9.如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中恢復(fù)至正常皮膚狀態(tài)的79%。
10.如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述哺乳動物是人類。
11.一種客觀地測量哺乳動物的瘙癢感的方法，所述方法包括以下步驟a)將粘附制品施用到哺乳動物的上皮；b)使上皮細胞粘附到所述粘附制品；c)從所述哺乳動物的上皮中移除所述粘附制品；d)使用用于萃取的標準實驗室方法來制備所述粘附制品；e)從粘附到所述粘附制品的上皮細胞中萃取組胺；f)測量來自粘附到所述粘附制品的上皮細胞的組胺； 以及g)測定與基線樣品相比組胺在所述上皮細胞中的量。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中組胺從基線水平降低，所述降低與瘙癢感的降低直接成比例。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中通過將所述組胺除以所述粘附制品上的蛋白質(zhì)的量來標準化所述組胺。
14.一種治療哺乳動物的瘙癢感的方法，所述方法包括以下步驟a)使用權(quán)利要求11中所述的方法來客觀地測定瘙癢感；b)施用安全且有效量的抗真菌化合物，優(yōu)選包含1-氧-2-巰基吡啶鋅的安全且有效量的抗真菌化合物。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述粘附制品施用到患有疾病、失調(diào)或炎性反應(yīng)的受試者的上皮，優(yōu)選地施用到患有皮炎的受試者的上皮，并且更優(yōu)選地施用到患有頭皮屑的受試者的上皮。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測量表皮中的組胺的方法，所述方法包括將粘附制品施用到哺乳動物的上皮；使上皮細胞粘附到所述粘附制品；從哺乳動物的上皮移除粘附制品；使用用于萃取的標準實驗室方法來制備粘附制品；從粘附到所述粘附制品的上皮細胞萃取組胺；測量粘附到所述粘附制品的上皮細胞中的組胺；測定與基線樣品相比組胺在上皮細胞中的量。此外，本發(fā)明還公開了客觀地測量哺乳動物的瘙癢感的方法，并且其中組胺從基線水平降低，所述降低與瘙癢感的降低直接成比例。
文檔編號G01N1/28GK102549437SQ201080041527
公開日2012年7月4日 申請日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月18日
發(fā)明者A.M.菲諾, G.M.法達耶爾, J.R.施瓦茲, K.M.科爾, K.R.韋邁耶, P.W.多伊爾, R.L.威瑪拉塞納, T.M.伯特 申請人:寶潔公司