一株能降低黃酒中生物胺的釀酒酵母及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株能降低黃酒中生物胺的釀酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明提供的釀酒酵母菌，是敲除了釀酒酵母的PEP4前肽基因，獲得低蛋白酶A活力的釀酒酵母工程菌并將其應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)低生物胺含量的黃酒。該菌在其它發(fā)酵性能不受影響的情況下，轉(zhuǎn)化子菌株與親本菌株相比：模擬半固態(tài)發(fā)酵后，主要的生物胺含量都有所降低，其中酪胺、尸胺和組胺含量下降最多，較原菌分別降低了57.5%，24.6%，和54.3%；篩選得到的工程菌對(duì)發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般酒廠的設(shè)備和條件均可使用，因而有廣泛的應(yīng)用前景，能為黃酒的安全生產(chǎn)提供重要保障。
【專利說明】一株能降低黃酒中生物胺的釀酒酵母及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一株能降低黃酒發(fā)酵中生物胺含量的釀酒酵母基因工程菌及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
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[0002]生物胺是一類堿性含氮化合物，主要由微生物體內(nèi)的游離氨基酸脫羧而成。因?yàn)槠錆撛诘亩拘宰饔煤蛯?duì)生產(chǎn)衛(wèi)生條件的指示作用而受到消費(fèi)者、制造商和研究者的廣泛關(guān)注，是目前食品安全問題研究的主要對(duì)象之一。其中，酪胺，尸胺，腐胺在各種發(fā)酵食品中存在最為廣泛，含量也相對(duì)較高，危害較大。
[0003]—般來說，由微生物生產(chǎn)生物胺有三個(gè)條件:一、有可利用的自由氨基酸；二、氨基酸脫羧酶陽性微生物的存在；三、有適宜的環(huán)境條件，利于細(xì)菌的生長(zhǎng)、脫羧酶的合成和提高脫羧酶活性的條件。
[0004]酵母蛋白酶A(PrA)是蛋白酶中最主要的水解酶之一，它能催化細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解，特別在氮缺乏、孢子形成時(shí)，酵母通過PrA水解蛋白質(zhì)為孢子合成新蛋白提供氨基酸來源。PrA是一種天冬氨酸蛋白酶，由XVI號(hào)染色體上的PEP4基因編碼。改變PrA的前驅(qū)物Pro-PrA的氨基酸組成能降低PrA的酶活。在很多發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中，除了來源于原料中的氨基酸，PrA水解蛋白質(zhì)也是自由氨基酸產(chǎn)生的原因之一。
[0005]近年來，國內(nèi)已有一些資深企業(yè)、高校和科研機(jī)構(gòu)利用該手段對(duì)釀酒酵母的PrA編碼基因PEP4進(jìn)行了相關(guān)的研究和探討，并在降低純生啤酒PrA活力、提高泡持性方面取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。本發(fā)明同樣利用基因工程手段構(gòu)建低表達(dá)PrA的釀酒酵母工業(yè)菌株，但其目的與用途和上述研究成果截然不同。
[0006]有文獻(xiàn)報(bào)道，改變PrA的前驅(qū)物一proPrA的氨基酸組成能降低PrA的酶活，其理論依據(jù)是ProPrA含有從高爾基體定位至液泡的分選信號(hào)，該分選信號(hào)就包含在N-端由54個(gè)氨基酸組成的前肽中(圖1)。當(dāng)ProPrA進(jìn)入液泡之前，N-端的前肽將會(huì)在完成定位作用后被水解下來，從而使成熟的PrA進(jìn)入液泡。該54氨基酸組成的前肽除涉及PrA的抑制/活化的轉(zhuǎn)換作用外，對(duì)于形成成熟的活性PrA具有極其關(guān)鍵的作用。而且在PrA形成過程的前期，如果缺乏該54氨基酸的肽段，PrA進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中時(shí)將會(huì)被完全降解。因此，本發(fā)明基于這一理論，采用同源重組技術(shù)敲除該54個(gè)氨基酸組成的前肽編碼序列，即PEP4前肽基因，從而構(gòu)建一株P(guān)rA低表達(dá)的基因工程菌。
[0007]目前報(bào)導(dǎo)最多的具有氨基酸脫羧酶活性的微生物主要是乳酸菌，腸桿菌，假單胞菌等細(xì)菌。許多屬的乳酸菌具有氨基酸脫羧能力，這一反應(yīng)有利于乳酸菌的在酸性環(huán)境中的生長(zhǎng)和存活，因?yàn)楫a(chǎn)生的生物胺可以使環(huán)境的PH上升。
[0008] 黃酒是我國的民族特產(chǎn)，也稱為米酒(rice wine)，屬于釀造酒，是世界三大最古老的酒種(黃酒、葡萄酒和啤酒)之一。黃酒是以稻米、黍米、小米、玉米、小麥等為主要釀造原料，由多種微生物(霉菌、酵母和細(xì)菌)共同參與，在開放式的環(huán)境中釀制而成的一種低酒精度發(fā)酵酒，一般酒精含量為14%~20%。
[0009]黃酒具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，黃酒中氨基酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他酒類，是啤酒的9.8倍和葡萄酒3.5倍，其種類超過21種，特別包含了人體必需的8種氨基酸。黃酒中氨基酸的來源主要是米飯和麥曲中所含蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶分解后產(chǎn)生的氨基酸和酵母等微生物自溶后內(nèi)容物釋放產(chǎn)生，有“液體蛋糕”之稱。
[0010]由于黃酒生產(chǎn)的開放式多菌種發(fā)酵，及大量豐富的氨基酸的存在，目前黃酒中普遍檢測(cè)到存在生物胺等潛在的有害物質(zhì)，因此降低黃酒中生物胺含量是黃酒工業(yè)急需解決的難題之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

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[0011]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)目前黃酒中普遍存在生物胺的缺陷，提供一株敲除PEP4前肽基因的釀酒酵母基因工程菌以及該菌株在降低黃酒中生物胺含量方面的應(yīng)用，其能減少在黃酒發(fā)酵后期由于酵母自溶PrA分泌到胞外分解菌體等蛋白質(zhì)產(chǎn)生自由氨基酸的量，從而降低生物胺的生成。
[0012]本發(fā)明的技術(shù)方案之一是:提供一株釀酒酵母基因工程菌，所述基因工程菌為用于黃酒生產(chǎn)的釀酒酵母中敲除酵母蛋白酶A編碼基因的前肽基因，即PEP4前肽基因所得；
[0013]所述PEP4前肽基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:1 ；
[0014]優(yōu)選的，所述基因工程菌的出發(fā)菌株為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)RYl，編號(hào) CGMCC No2.15 25。
[0015]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案之二是:一種用于基因敲除的重組質(zhì)粒，其依次含有酵母蛋白酶A編碼基因PEP4前肽基因的上、下游兩條同源臂以及標(biāo)記基因KanMX ；
[0016]所述PEP4前肽基因的同源重組上游同源臂片段長(zhǎng)311bp，其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID N0.2 ；
[0017]所述PEP4前肽基因的同源重組下游同源臂片段長(zhǎng)319bp，其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID N0.3 ；
[0018]所述標(biāo)記基因KanMX為帶有G418抗性的標(biāo)記基因；
[0019]所述重組質(zhì)粒的載體為pUC19質(zhì)粒。
[0020]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案之三是:一種構(gòu)建敲除PEP4前肽基因的釀酒酵母基因工程菌的方法，包括以下步驟:
[0021](I)將含有PEP4前肽基因同源臂的DNA分子及標(biāo)記基因KanMX插入質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒；
[0022]所述含有PEP4前肽基因同源臂的DNA分子為PEP4前肽基因上游同源臂基因片段和下游同源臂基因片段；
[0023](2)以重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出含有PEP4前肽基因同源臂及標(biāo)記基因KanMX的重組片段，將重組片段轉(zhuǎn)化入出發(fā)菌株的兩種單倍體菌株(a型和α型)中，得到重組后的基因工程單倍體菌株al和α I ;
[0024](3)將pGAPza質(zhì)粒導(dǎo)入所述重組后的基因工程單倍體菌株al和α I中，純化并融合后得到所述基因工程菌。
[0025]具體如下:
[0026](I)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0027]將含有PEP4前肽基因同源臂的DNA分子及標(biāo)記基因KanMX插入質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒;
[0028]所述含有PEP4前肽基因同源臂的DNA分子為PEP4前肽基因上游同源臂基因片段和下游同源臂基因片段；
[0029](2) PEP4前肽基因的敲除
[0030]①以步驟(1)中的重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出含有PEP4前肽基因同源臂及標(biāo)記基因KanMX的重組片段；
[0031]②用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將①中的重組片段轉(zhuǎn)化入出發(fā)菌株的a型和α型菌株中，得到重組后的基因工程單倍體菌株；
[0032](3) KanMX抗性基因的去除
[0033]①利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pGAPza質(zhì)粒轉(zhuǎn)入步驟(2)-②中的基因工程單倍體菌株中，
[0034]②用Zeocin抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，挑選在YEI3D平板上生長(zhǎng)而在G418平板上不生長(zhǎng)的基因工程單倍體菌株，包括a型和α型。
[0035](4) pGAPza 質(zhì)粒丟失
[0036]將步驟(3)-②中挑選的a型和α型基因工程單倍體菌株于YETO液體培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選取第一代及第八代以后各培養(yǎng)物提取酵母質(zhì)粒并以此為模板，用引物Zeocin-up與Zeocin-down進(jìn)行PCR擴(kuò)增,驗(yàn)證pGAPza質(zhì)粒是否丟失。
[0037](5)獲得基因工程菌
[0038]將步驟(4)中驗(yàn)證得到的pGAPza質(zhì)粒丟失的a型和α型單倍體酵母突變株經(jīng)純化后進(jìn)行融合，篩選雙倍體即得到所述基因工程菌。
[0039]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案之四是:提供一種所述基因工程菌應(yīng)用于黃酒發(fā)酵中的生產(chǎn)方法。
[0040]取所述基因工程菌一環(huán)，接種于5mL麥芽汁培養(yǎng)基中，30°C，150r/min，搖瓶發(fā)酵12h后全部轉(zhuǎn)接于相同麥芽汁的50mL三角瓶中，30°C，150r/min，繼續(xù)搖瓶發(fā)酵24h后按10%的接種量接種到大米固體培養(yǎng)基中，30°C恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行前酵實(shí)驗(yàn)，5天后，調(diào)整恒溫培養(yǎng)箱溫度至30°C進(jìn)行后酵實(shí)驗(yàn)15天。
[0041]所述麥芽汁培養(yǎng)基的制備:
[0042]大麥芽lOOOg，粉碎成粉，將粉好的麥芽粉加入4倍體積水(水溫60°C )至于小鍋中糖化，小鍋至于55°C -60°C的恒溫水浴中糖化5-6h，期間不斷攪拌。糖化液紗布靜置過濾，過濾后的糖化液煮沸l(wèi)h，冷卻，雙層紗布過濾一次，即得到澄清麥芽汁，麥芽汁糖度在12-13Bixo 115°C，15min 滅菌。
[0043]所述大米固體培養(yǎng)基的制備:
[0044]浸米:25-30V，浸潰 72h ；
[0045]洗米:洗米時(shí)保留部分的浸米水，剛洗米的三道水倒掉，保留米漿水的乳酸味同時(shí)不要味道太重；
[0046]蒸煮:浸好的大米常壓蒸50min左右，直到顆粒均勻、內(nèi)心無白，冷卻；
[0047]配料:粳米:100g ;熟麥曲:10g ;水:105ml (清水60ml、漿水45ml，不包括浸米吸水和蒸飯吸水)接種量:10% (30mL)。
[0048]有益效果:
[0049]1、本發(fā)明敲除了黃酒酵母中PEP4前肽基因，得到PrA活力顯著降低的釀酒酵母基因工程菌，并首次以降低黃酒發(fā)酵過程中的生物胺含量為目的將該類基因工程菌用于黃酒發(fā)酵生產(chǎn)中，獲得低生物胺含量的產(chǎn)品。
[0050]2、本發(fā)明獲得的黃酒酵母基因工程菌與初始出發(fā)菌株釀酒酵母相比:模擬半固態(tài)發(fā)酵后，主要的生物胺含量都有所降低，其中酪胺、尸胺和組胺含量下降最多，較原菌分別降低了 57.5%, 24.6%,和54.3% ;篩選得到的工程菌對(duì)發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般酒廠的設(shè)備和條件均可使用，因而有廣泛的應(yīng)用前景，能為黃酒的安全生產(chǎn)提供重要保障。

【專利附圖】

【附圖說明】
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[0051]圖1是PEP4基因編碼蛋白酶A的示范性結(jié)構(gòu)
[0052]圖2是重組質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖
[0053]圖3是重組質(zhì)粒質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證圖
[0054]圖4是同源重組過程
[0055]圖5是重組黃酒酵母單倍體的驗(yàn)證
[0056]其中(a)為a型重組單倍體驗(yàn)證；(b)為α型重組單倍體驗(yàn)證
[0057]圖6是KanMX抗性基因剔除PCR驗(yàn)證
[0058]其中㈧為a型重組單倍體驗(yàn)證；(B)為α型重組單倍體驗(yàn)證
[0059]圖7是單倍體pGAPza質(zhì)粒丟失PCR驗(yàn)證
[0060]其中1，2泳道為a型重組單倍體驗(yàn)證；3，4泳道為α型重組單倍體驗(yàn)證。

【具體實(shí)施方式】
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[0061]本發(fā)明所使用的出發(fā)菌株是可以采用任何來源的釀酒酵母雙倍體菌株。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0062]實(shí)施例1:
[0063]根據(jù)Genebank中的酵母基因組數(shù)據(jù)和整合質(zhì)粒序列，設(shè)計(jì)了下述實(shí)施例中各引物。
[0064] 表1.本實(shí)施例中所用到的引物
[0065]

【權(quán)利要求】
1.一種基因工程菌，是對(duì)生產(chǎn)黃酒的釀酒酵母進(jìn)行基因工程改造獲得的菌；所述基因工程改造為敲除所述生產(chǎn)黃酒的釀酒酵母中酵母蛋白酶A編碼基因的前肽基因，即PEP4前妝基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于:所述生產(chǎn)黃酒的釀酒酵母為釀酒酵母RYl,保藏編號(hào)CGMCC No2.1525。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于:所述PEP4前肽基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: I所示。
4.一種構(gòu)建權(quán)利要求1或2中任一所述的基因工程菌的方法，包括如下步驟: (1)將含有PEP4前肽基因同源臂的DNA分子及標(biāo)記基因KanMX插入質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒; 所述含有PEP4前肽基因同源臂的DNA分子分別為含有PEP4前肽基因上、下游同源臂的基因片段； (2)以重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出含有PEP4前肽基因同源臂及標(biāo)記基因KanMX的重組片段，將重組片段轉(zhuǎn)化入出發(fā)菌株的兩種單倍體菌株一a型和α型中，得到重組后的a型和α型基因工程單倍體菌株； (3)將pGAPza質(zhì)粒導(dǎo)入所述重組后的a型和α型基因工程單倍體菌株中，純化并融合后得到所述基因工程菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟: Cl)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將含有ΡΕΡ4前肽基因同源臂的DNA分子及標(biāo)記基因KanMX插入質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒; 所述含有ΡΕΡ4前肽基因同源臂的DNA分子分別為含有ΡΕΡ4前肽基因上、下游同源臂的基因片段； (2)ΡΕΡ4前肽基因的敲除 ①以步驟(1)中的重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出含有ΡΕΡ4前肽基因同源臂及標(biāo)記基因KanMX的重組片段； ②用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將①中的重組片段轉(zhuǎn)化入出發(fā)菌株的a型和α型菌株中，得到重組后的基因工程單倍體菌株； (3)KanMX抗性基因的去除 ①利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將PGAPza質(zhì)粒轉(zhuǎn)入步驟(2)-②中的基因工程單倍體菌株中， ②用Zeocin抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，挑選在YEH)平板上生長(zhǎng)而在G418平板上不生長(zhǎng)的基因工程單倍體菌株，包括a型和α型； (4)pGAPza質(zhì)粒丟失 將步驟(3)-②中挑選的a型和α型基因工程單倍體菌株于YEH)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選取第一代及第八代以后各培養(yǎng)物提取酵母質(zhì)粒并以此為模板，用引物Zeocin-up與Zeocin-down進(jìn)行PCR擴(kuò)增,驗(yàn)證pGAPza質(zhì)粒是否丟失； (5)獲得基因工程菌 將步驟(4)中驗(yàn)證得到的pGAPza質(zhì)粒丟失的a型和α型單倍體酵母突變株經(jīng)純化后進(jìn)行融合，篩選雙倍體即得到所述基因工程菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述PEP4前肽基因上游同源臂的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；所述PEP4前肽基因下游同源臂的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO:3所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述重組質(zhì)粒的載體為PUC19質(zhì)粒。
8.權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌在生產(chǎn)低含量生物胺的黃酒中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基因工程菌在生產(chǎn)低含量生物胺的黃酒中的應(yīng)用，其特征在于:使用所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)黃酒的方法如下: 取權(quán)利要求1所述的基因工程菌一環(huán)，接種于5mL麥芽汁培養(yǎng)基中，300C，150r/min,搖瓶發(fā)酵12h后全部轉(zhuǎn)接于相同麥芽汁的50mL三角瓶中，30°C，150r/min，繼續(xù)搖瓶發(fā)酵24h后按10%的接種量接種到大米固體培養(yǎng)基中，30°C恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行前酵實(shí)驗(yàn)，5天后，調(diào)整恒溫培養(yǎng)箱溫度至30°C進(jìn)行后酵實(shí)驗(yàn)15天。
10.如權(quán)利要求9所述的基因工程菌在生產(chǎn)低含量生物胺的黃酒中的應(yīng)用，其特征在于: 所述麥芽汁培養(yǎng)基的制備如下: 大麥芽lOOOg，粉碎成粉，將粉好的麥芽粉加入4倍體積水(水溫60°C)置于小鍋中糖化，小鍋置于55°C -60°C的恒溫水浴中糖化5-6h，期間不斷攪拌，糖化液紗布靜置過濾，過濾后的糖化液煮沸l(wèi)h，冷卻，雙層紗布過濾一次，即得到澄清麥芽汁，麥芽汁糖度在12-13Bix, 115°C, 15min 滅菌； 所述大米固體培養(yǎng)基的制備: 浸米:25-30°C，浸潰 72h ； 洗米:洗米時(shí)保留部分的浸米水，剛洗米的三道水倒掉，適度保留米漿水的乳酸味； 蒸煮:浸好的大米常壓蒸50min左右，直到顆粒均勻、內(nèi)心無白，冷卻；
配料:粳米:100g ;熟麥曲:10g ;水:105ml (清水60ml、漿水45ml，不包括浸米吸水和蒸飯吸水)接種量:10% (30mL)。
【文檔編號(hào)】C12N1/18GK104046572SQ201410106846
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】肖冬光, 郭學(xué)武, 陳葉福, 杜麗平, 張翠英, 董健, 李立娜, 吳德光 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)