專利名稱：檢測(cè)喹諾酮類藥物的磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種直接化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒及其測(cè)試方法，特別是檢測(cè)動(dòng)物組織、 雞蛋、蜂蜜等樣本中喹諾酮類藥物殘留量的磁顆粒競(jìng)爭(zhēng)直接化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
喹諾酮類藥物類抗菌藥(4-quinoloes)，又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類，是一類較新的合成抗菌藥，該類藥物的開(kāi)發(fā)始于1962年的萘啶酸，自1978年諾氟沙星的問(wèn)世以來(lái)，以開(kāi)發(fā)及正在開(kāi)發(fā)的超過(guò)五十種。喹諾酮類藥物類抗菌藥以細(xì)菌的脫氧核糖核酸(DNA)為靶，造成染色體的不可逆損害，而使細(xì)胞細(xì)菌不再分裂，主要作用于革蘭陰性菌的抗菌藥物，對(duì)格蘭陽(yáng)性菌的抗菌作用較弱(某些品種對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抗菌作用)。喹諾酮類藥物抗菌藥按發(fā)明先后及其抗菌性能的不同，分為一、二、三、四代，第一代喹諾酮類藥物類抗菌藥的品種有萘啶酸(Nalidixic acid)和吡咯酸(Piromidic acid)等，第二代喹諾酮類藥物類抗菌藥的品種有新惡酸(Cinoxacin)和甲氧噁喹酸 (Miloxacin)等，第三代喹諾酮類藥物類抗菌藥的品種有諾氟沙星(Norfloxaicin)、 氧氟沙星(Ofloxacin)、培氟沙星(Perfloxacin)、依諾沙星(Enoxacin)和環(huán)丙沙星 (Ciprofloxacin)等，第四代喹諾酮類藥物類抗菌藥的品種有加替沙星(Gatifloxacin)與莫西沙星(Moxifloxacin)等。喹諾酮類藥物類藥物可用于治療呼吸道感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染、消化系統(tǒng)感染及其它類的各種感染，還可用于抗腫瘤和抗病毒作用。除了被應(yīng)用于人體的疾病治療，還被應(yīng)用到水產(chǎn)業(yè)上。該類藥物易誘發(fā)細(xì)菌耐藥性，故對(duì)生產(chǎn)食品動(dòng)物使用的管理方式越來(lái)越嚴(yán)格，歐盟和北美等國(guó)家只批準(zhǔn)恩諾沙星作為動(dòng)物專用的抗菌藥，諾氟沙星和環(huán)丙沙星已禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用。同時(shí)我國(guó)及世界衛(wèi)生組織、日本等國(guó)家和組織都將喹諾酮類藥物類藥物列入限制使用的獸藥名單，并制訂出相應(yīng)的最高殘留限量根據(jù)不同動(dòng)物品種、組織和藥物種類，最高殘留限量在10-6000 μ g/kg之間。日本2006年5月開(kāi)始實(shí)施“肯定列表制度”后，對(duì)喹諾酮類藥物類藥物殘留的檢測(cè)要求進(jìn)一步提高目前，喹諾酮類藥物類藥物的檢測(cè)主要有微生物法(ΜΙΑ)、高效液相色譜法 (HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)等。1、微生物法(MIA)是利用抗菌藥物具有的抗微生物活性，在特定的培養(yǎng)基上接種已知微生物，再加入被測(cè)樣品或提取液，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的培養(yǎng)，根據(jù)對(duì)特異微生物的抑制作用觀察所含藥物的抑菌效果，利用抑菌差異篩選出殘留物質(zhì)的種類。微生物法是日本食肉衛(wèi)生檢查所和各個(gè)食品檢查機(jī)構(gòu)檢測(cè)肉食品中抗生素殘留的常規(guī)篩選方法。MIA方法的靈敏度與分析者所期望的水平和規(guī)定的最高殘留限量(MRL)顯示出滿意的結(jié)果，盡管如此， 在所期望的檢測(cè)水平下，陰性樣品的可靠性不被保證。2、高效液相色譜法(HPLC)具有檢測(cè)精度高、假陽(yáng)性率低的特點(diǎn)。HPLC法的主要缺點(diǎn)是儀器價(jià)格昂貴，操作比較繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)費(fèi)用昂貴，對(duì)檢測(cè)人員專業(yè)要求較高，樣本前處理較復(fù)雜。3、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MQ，樣品不需要衍生化處理，可對(duì)尿液、血液、肝臟、毛發(fā)和眼球樣品進(jìn)行檢測(cè)。該方法對(duì)喹諾酮類藥物的最低檢測(cè)限達(dá)到1.0yg/kg，LC-MS/MS 聯(lián)用，可進(jìn)一步提高信噪比，所以可用于對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的確認(rèn)手段。但是，無(wú)論LC-MS還是 LC-MS/MS，儀器檢測(cè)法未能解決儀器造價(jià)昂貴，操作步驟繁瑣，樣本前處理復(fù)雜，對(duì)操作人員專業(yè)素養(yǎng)要求高等問(wèn)題。4、酶聯(lián)免疫法(ELISA)是20世紀(jì)70年代出現(xiàn)，用于微量物質(zhì)的檢測(cè)，最早應(yīng)用于傳染病、腫瘤標(biāo)志物、激素水平等臨床檢測(cè)，90年代開(kāi)始在我國(guó)食品安全檢測(cè)領(lǐng)域推廣應(yīng)用，目前依托ELISA技術(shù)的試劑盒、試紙條已經(jīng)成為食品安全快速檢測(cè)領(lǐng)域的主導(dǎo)產(chǎn)品，同時(shí)也是我公司研發(fā)和銷售的主要產(chǎn)品類型。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法基于抗原-抗體的特異性反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度較高、特異性較好，技術(shù)操作簡(jiǎn)易，容易掌握，確實(shí)解決了大量的以前難以解決的許多微量小分子物質(zhì)如抗生素、激素、農(nóng)藥殘留等的定性、定量分析工作，對(duì)食品安全快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展起到了積極的促進(jìn)作用。但是，ELISA方法存在許多自身無(wú)法克服的缺陷，主要表現(xiàn)在1)非均相反應(yīng)檢測(cè)過(guò)程中為分離游離物與結(jié)合物，需要多步洗板過(guò)程，耗時(shí)費(fèi)力，難以提高操作的自動(dòng)化程度。2)酶催化反應(yīng)借助酶催化底物顯色，測(cè)定反應(yīng)液吸光度值。反應(yīng)的時(shí)間與溫度對(duì)酶活力存在較大影響，試劑穩(wěn)定性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種喹諾酮類藥物檢測(cè)試劑盒，采用該試劑盒進(jìn)行喹諾酮類藥物的檢測(cè)時(shí)不僅具備較高的靈敏度，特異性，而且具有較高的反應(yīng)速度。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種喹諾酮類藥物的測(cè)試方法，該方法操作簡(jiǎn)單， 靈敏度高，特異性好。實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種喹諾酮類藥物檢測(cè)試劑盒，其包含的主要試劑有 發(fā)光標(biāo)記物、熒光素標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、分離試劑。所述的分離試劑是包被有羊抗FITC單克隆抗體的磁珠。所述的順磁性納米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基團(tuán)的微珠，用于包被羊抗FITC單克隆抗體，其內(nèi)芯是!^e3O4或Y -Fe2O3，使得微珠具有順磁性。所述的發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾衍生物標(biāo)記的喹諾酮類藥物半抗原。所述的異魯米諾衍生物是ABEI、AHEI或ABEN。所述的試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品和濃縮洗液。所述的熒光素標(biāo)記物是FITC標(biāo)記喹諾酮類藥物單克隆抗體。本發(fā)明還提供一種利用試劑盒檢測(cè)喹諾酮類藥物的方法，包括下列步驟1)分別吸取20 μ 1-100 μ 1標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ 1發(fā)光標(biāo)記物，再加20 μ 1-100 μ 1熒光素標(biāo)記物，充分混勻后，37°C溫育15min ；2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150 μ 1，混勻后在37°C 溫育5min ；3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500 μ 1沖洗復(fù)合物沉淀；
4)上述清洗步驟重復(fù)2-4次；5) 4)所得分離好的復(fù)合物直接放入測(cè)量暗箱，加入激發(fā)底物1和激發(fā)底物2，延遲 3-5s后檢測(cè)發(fā)出的相對(duì)光強(qiáng)度(RLU)，樣本中的含量與RLU成一定比例關(guān)系，可以通過(guò)RLU 集合標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算喹諾酮類藥物的濃度。所述的發(fā)光底物的主要成分是NaOH和H202。本發(fā)明中分析測(cè)試方法所用的分析儀是包括電源電路、自動(dòng)注射泵1和2、測(cè)量室、發(fā)光室、光電倍增管計(jì)數(shù)器和輸出系統(tǒng)，同時(shí)還配置有計(jì)算機(jī)與中文界面的Windows控制軟件，可進(jìn)行資料錄入、結(jié)果匯總、質(zhì)量控制、結(jié)果儲(chǔ)存和結(jié)果查詢等功能，可完成多種分析模式的編程，定量或定性報(bào)告結(jié)果，自動(dòng)生成并儲(chǔ)存、更新功能，兩點(diǎn)自動(dòng)修正標(biāo)準(zhǔn)曲線， 所采用的系統(tǒng)是CI-2008系統(tǒng)。本發(fā)明所述的分離試劑是包被羊抗FITC單克隆抗體，其表面基團(tuán)的含量是 0. 1-0. 3eqm/g,其保存于含有 ρΗ7· 1-7. 4，4-7 % 卵清蛋白，0. 2-0. 5 % 吐溫-20,0. 2-0. 4 % NaN3,0.2-0. 3mol/LPBS緩沖液中。所述的FITC是異硫氰酸熒光素。所述百分含量為質(zhì)量
百分含量。所述的發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾衍生物ABEI、AHEI或ABEN標(biāo)記的喹諾酮類藥物半抗原，其保存于 PH6. 4-6. 8,0. 1-0. 3% 吐溫-20，0. 1-0. 3% NaN3 的 0. 1-0. 2mol/LPBS 緩沖液中。所述百分含量是質(zhì)量百分含量。所述的熒光素標(biāo)記物是FITC標(biāo)記的喹諾酮類藥物單克隆抗體，其保存于 pH7. 0-7. 4，含1-3%卵清蛋白，0. 2-0. 4% NaN3的0. 1-0. 2mol/LPBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液(Ong/ml，0.01ng/ml，0. 03ng/ml，0. 09ng/ml，0. 27ng/ ml，0. 81ng/ml)，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為 pH6. 4-6. 7,0. 3-0. 5% NaN3,0. 2-0. 3mol/LPBS 緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。喹諾酮類藥物質(zhì)控品溶液濃度分別為0. 02ng/ml，0. 5ng/ml，質(zhì)控品稀釋液 pH6. 4-6. 7,0. 3-0. 5% NaN3,0. 2-0. 3mol/LPBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。所述的濃縮洗液為PH7. 2-7. 6,0. 2-0. 4%吐溫-20,0. 2-0. 4% NaN3,0. 1-0. 2mol/ L PBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。本發(fā)明的有益效果如下1)本發(fā)明試劑盒可特異性檢測(cè)喹諾酮類藥物。2)本發(fā)明試劑盒的靈敏度較高，對(duì)喹諾酮類藥物的檢測(cè)靈敏度可達(dá)0. lng/ml。3)本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)快捷，檢測(cè)時(shí)間低于20min。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1試劑盒具體組分的制備1、發(fā)光標(biāo)記物的制備a)半抗原的合成將環(huán)丙沙星和丁二酸酐合成帶有羧基的喹諾酮半抗原，從而在分子中引入羧基。b)發(fā)光標(biāo)記物制備取4. 5mmol/L ABEI，溶于4ml蒸餾水中，5. Ommol/L N-羥基琥珀酰亞胺溶于0. 5mlN，N_ 二甲基甲酰胺中，二者充分混勻后室溫反應(yīng)3_4h。取上述制備的喹諾酮類藥物半抗原 15mg，用pH7. 4PBS調(diào)節(jié)體積到1. 5ml，然后加入上述活化的ABEI溶液，充分混勻后室溫反應(yīng)過(guò)夜，過(guò)G-25凝膠柱純化。2、熒光標(biāo)記物制備a)免疫原的制備將喹諾酮類藥物半抗原與牛血清白蛋白采用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。b)喹諾酮類藥物單克隆抗體的制備動(dòng)物免疫以氟喹諾酮類藥物免疫原對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，免疫劑量為 iooyg/只，使其產(chǎn)生抗血清。細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按9 1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，得到單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成IX IO9個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 4ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5X IO5個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，純化后的腹水放入_20°C環(huán)境保存。c)熒光標(biāo)記物制備用0. 025mol/L, pH9. 0的碳酸鹽緩沖液將喹諾酮類藥物單克隆抗體稀釋成質(zhì)量百分比濃度；根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克免疫球蛋白加 0. Olmg FITC，用分析天平準(zhǔn)確稱取所需的FITC粉末。用同一緩沖液將FITC配成0. lmg/ml 的溶液，按上述抗體溶液體積的3-5倍，混入FITC稀釋液；在4 。C避光條件下電磁攪拌、 標(biāo)記30-4 ；將標(biāo)記溶液3000r/min，室溫離心20min，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再PH7. 4的PBS緩沖液透析2-3天，期間至少更換透析液3次；取透析過(guò)夜的標(biāo)記物，通過(guò)kphadexG-25或G-50柱，分離游離熒光素，收集標(biāo)記的熒光標(biāo)記物進(jìn)行鑒定，分裝，貯存于4°C冰箱中。3、分離試劑制備a)磁珠活化表面-COOH基團(tuán)的磁珠(購(gòu)于DYNAL，粒徑為2. 8 μ m)，其含量是0. Meq/g;取 100 μ 1 磁珠，用 100 μ 1 25mmol/L, ρΗ5· 0,0. 05% Tween_20MES 溶液洗滌兩次，磁分離后移除上清；使用前，用4°C貯存的25mmol/L MES溶液分別配置50mmol/L的EDC、NHS溶液；分別加入50 μ 1新配置的EDC和NHS溶液到裝有磁珠的離心管中，渦旋混勻，室溫活化30min ； 離心管置于磁分離架上磁分離^iin,移除上清，加入100 μ l,25mmol/L,pH5. 0,MES清洗2_3 次后即可得表面羧基活化的磁珠。b)磁珠偶聯(lián)羊抗FITC單克隆抗體將50-100 μ g羊抗FITC單克隆抗體溶解到60 μ 1，25mmol/L, pH5. OMES中，用所述 MES溶液調(diào)節(jié)總體積至100 μ 1，輕柔混勻磁珠與抗體；室溫條件下至少偶聯(lián)30min或4。C偶聯(lián)2h，該期間可利用渦旋儀使磁珠保持混勻狀態(tài)；離心管置于磁分離架上磁分離3-5min， 移除上清；為了淬滅未反應(yīng)的-C00H，可加入100 μ 1，ρΗ7. 4，TRIS反應(yīng)15min或100μ 1， ρΗ8· 0，含有 50mmol/L 乙醇胺的 PBS 封閉磁珠；用 100 μ 1,0. 1-0. 3% BSA, 0. 1% Tween-20的PBS或TRIS清洗封閉好的磁珠3-5次；最后將磁珠復(fù)溶于含0. 1-0. 5% BSA, 0. 01-0. 1 % Tween-20,0. 02% NaN3 的 PBS 或 TRIS 緩沖液中，2_8°C保藏。實(shí)施例二試劑盒的組建組建檢測(cè)喹諾酮類藥物的磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，使其含有下列組分FITC標(biāo)記的喹諾酮類藥物單克隆抗體的熒光標(biāo)記物ABEI標(biāo)記的喹諾酮類藥物半抗原的發(fā)光標(biāo)記物表面包被羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠的分離試劑喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液(Ong/ml，0.01ng/ml，0. 03ng/ml，0. 09ng/ml，0. 27ng/ ml，0. 81ng/ml)，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為ρΗ6· 5，含有0. 4% NaN3,0. 3mol/L PBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。喹諾酮類藥物濃度質(zhì)控品溶液濃度分別為0. 02ng/ml,0. 5ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為 PH6. 5，含有0. 4% NaN3,0. 3mol/L PBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。濃縮洗液為PH7. 4,0. 4%吐溫-20,0. 3% NaN3,0. 2mol/L PBS緩沖液。所述百分
含量為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例三實(shí)際樣品中喹諾酮類藥物的檢測(cè)1、樣本前處理(一)雞肉樣本用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；稱取3. O士0. 05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中；加入9ml乙腈-0. IM氫氧化鈉溶液，充分上下振蕩混合10min，3000g以上，15°C 離心IOmin ；移取細(xì)1上清液至50ml聚苯乙烯離心管中，加入細(xì)1 0. 02M磷酸鹽緩沖液，再加入8ml 二氯甲烷，振蕩器振蕩10min，3000g以上，15°C離心lOmin，去上層，取下層有機(jī)相 6ml至IOml干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮?dú)饬飨麓蹈?；?. 5ml復(fù)溶工作液，用渦旋儀充分渦動(dòng)anin溶解干燥的殘留物，加入Iml正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)anin，3000g以上， 15°C離心5min ；輕吸掉上層正己烷及中間層雜質(zhì)，取下層50 μ 1用于分析，樣本稀釋倍數(shù) 1。( 二 )血清樣本前處理方法將采集的雞血樣本室溫放置，待析出血清；吸取0. 5ml血清樣本至IOml干凈的聚苯乙烯離心管中，加入細(xì)1乙腈-二氯甲烷溶液，用振蕩器劇烈振蕩5min，3000g以上，室溫 (20-25V )離心8min ；吸取上層有機(jī)相2ml至IOml干凈的玻璃試管中，于50 60°C水浴氮?dú)饬飨麓蹈?；加入Iml正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)10s，再加入Iml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動(dòng) lmin,3000g以上，室溫O0_25°C )離心5min ；除去上層有機(jī)相，取下層水相50 μ 1用于分析，樣本稀釋倍數(shù)4。(三)雞蛋前處理方法用均質(zhì)器低速均質(zhì)雞蛋樣本，使得蛋清和蛋黃充分混合；取2. O 士0. 05g雞蛋樣本至15ml聚苯乙烯離心管中，加入8ml乙腈，用振蕩器充分振蕩5min ；取2ml上清液至IOml 干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮?dú)饬飨麓蹈?；加入Iml正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)lmin;加入Iml復(fù)溶工作液，用渦旋儀充分渦動(dòng)1 aiiin，3000g以上，室溫O0_25°C )離心5min ； 去除上層有機(jī)相，取下層50 μ 1用于分析，樣本稀釋倍數(shù)2。(四)飼料前處理方法
取1.0士0.05g飼料樣本于50ml聚苯乙烯離心管中，加入9ml 0. IM氫氧化鈉溶液，再加入Iml甲醇，充分振蕩5min，3000g以上，室溫(20-25°C )離心5min ；移取50 μ 1上清液至2ml聚苯乙烯離心管中，加入450 μ 1復(fù)溶工作液；取50 μ 1 用于分析，樣本稀釋倍數(shù)100。(五)水產(chǎn)前處理方法取2.0士0.05g均質(zhì)樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入Iml 0. IM氫氧化鈉溶液，再加入7ml乙腈，用振蕩器充分振蕩5min ；3000g以上離心IOmin ；取2ml上清液于IOml 玻璃試管中，于50 60°C水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑患尤隝ml正已烷用渦旋儀渦動(dòng)30s，再加入 Iml復(fù)溶工作液，渦動(dòng)30s，3000g以上，室溫O0_25°C )離心5min ；除去上層有機(jī)相，取下層50 μ 1用于分析，樣本稀釋倍數(shù)2。(六)蜂蜜前處理方法稱取1. 0士0. 05g樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入Iml去離子水，渦動(dòng)充分溶解，再加入7ml乙腈，振蕩混勻5min ；3000g以上，室溫O0_25°C )離心lOmin，取Iml上層清液，至IOml干燥玻璃管中，于50 60°C水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑患尤隝ml復(fù)溶工作液，渦動(dòng)lmin，取50μ 1用于分析，樣本稀釋倍數(shù)8。注有結(jié)晶析出的蜂蜜樣本在稱取之前請(qǐng)于60°C水浴30-60min，振蕩樣本充分混勻后再取樣。2、用試劑盒檢測(cè)與結(jié)果分析分別吸取20 μ 1-100 μ 1標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ 1發(fā)光標(biāo)記物，再加 20μ 1-100μ 1熒光素標(biāo)記物，充分混勻后，37°C溫育15min ；加入包被有抗羊FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150 μ 1，混勻后在37°C溫育5min ；用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500 μ 1沖洗復(fù)合物沉淀；所得分離好的復(fù)合物直接放入測(cè)量暗箱，加入激發(fā)底物1和激發(fā)底物2，延遲3- 后檢測(cè)發(fā)出的相對(duì)光強(qiáng)度(RLU)，樣本中喹諾酮類藥物的含量與RLU成一定比例關(guān)系，可以通過(guò)RLU結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算喹諾酮類藥物的濃度。激發(fā)底物1是NaOH，激發(fā)底物2是H202。底物裝載前，用蒸餾水清洗底物泵10_20 遍，排空管道內(nèi)殘存的水跡后，再將相應(yīng)的底物直接放入儀器內(nèi)，將泵管插入底物瓶中；用底物沖洗管道5次，并測(cè)定底物的RLU值，正常情況下，底物的RLU值不應(yīng)超過(guò)1200。若超過(guò)1200，需重新用蒸餾水對(duì)管道和底物泵進(jìn)行更多次清洗，直至空白值降至合理范圍內(nèi)。若超過(guò)三天不做實(shí)驗(yàn)，需卸載底物瓶，并蓋上蓋子，以防蒸發(fā)。隨后用蒸餾水清洗管道，并排空，以免強(qiáng)堿溶液腐蝕底物泵。本發(fā)明采用6個(gè)喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品(0ng/ml，0. 01ng/ml,0. 03ng/ml,0. 09ng/ ml,0. 27ng/ml,0.81ng/ml)進(jìn)行曲線測(cè)繪。儀器根據(jù)所述方法檢測(cè)得到一條RLU值與喹諾酮類藥物濃度成反比的定標(biāo)曲線，此后測(cè)量中，每一個(gè)樣本中的喹諾酮類藥物濃度與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較得出樣本中的喹諾酮類藥物含量。實(shí)施例四試劑盒質(zhì)量的測(cè)定1、試劑盒的靈敏度試劑盒靈敏度的定義為測(cè)定20次零標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差。該試劑盒的靈敏度為0. Olng/ml。2、樣本的準(zhǔn)確度和精密度
準(zhǔn)確度是指測(cè)定值與真值間的符合程度，試劑盒準(zhǔn)確度常用回收率表示。精密度又稱可重復(fù)性，常用變異系數(shù)表示。按照實(shí)施例三的樣本提取方法，以0. 05ng/g(ml)、0. lng/g(ml)兩個(gè)濃度的喹諾酮類藥物分別對(duì)雞肉、雞蛋、水產(chǎn)樣本進(jìn)行添加，以0. 2ng/g(ml)、0. 4ng/g(ml)兩個(gè)濃度的喹諾酮類藥物分別對(duì)血清、蜂蜜樣本進(jìn)行添加，以2ng/g3ng/g兩個(gè)濃度的喹諾酮類藥物分別對(duì)飼料樣本進(jìn)行添加，每種樣本每個(gè)濃度各4個(gè)平行，用三批試劑盒進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣本的平均回收率及精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表。表1準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定ng/g (ml)
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)喹諾酮類藥物的磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒，包括的試劑有發(fā)光標(biāo)記物、熒光素標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、分離試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的分離試劑是包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的順磁性納米微珠是里面包覆有 Fe3O4或γ -Fe2O3，表面含有_0H、-COOH或-NH2活性基團(tuán)的微珠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述的發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾衍生物標(biāo)記的喹諾酮類藥物半抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的異魯米諾發(fā)光標(biāo)記物是ABEI、 AHEI 或 ABEN。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)液、 質(zhì)控品和濃縮洗液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的試劑盒，其特征在于所述的熒光素標(biāo)記物是FITC標(biāo)記的喹諾酮類藥物單克隆抗體。
8.一種利用權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測(cè)喹諾酮類藥物的方法，包括下列步驟1)分別吸取20μ 1-100 μ 1標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ 1發(fā)光標(biāo)記物，再加 20 μ 1-100 μ 1熒光素標(biāo)記物，充分混勻后，37°C溫育15min ；2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150μ1，混勻后在37°C溫育 5min ；3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500μ 1沖洗復(fù)合物沉淀；4)上述清洗步驟重復(fù)2-4次；5)4)所得分離好的復(fù)合物直接放入測(cè)量暗箱，加入激發(fā)底物1和激發(fā)底物2，延遲3- 后檢測(cè)發(fā)出的相對(duì)光強(qiáng)度(RLU)，樣本中喹諾酮類藥物的含量與RLU成一定比例關(guān)系，可以通過(guò)RLU集合標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算喹諾酮類藥物的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)喹諾酮類藥物的磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒，包括的試劑有發(fā)光標(biāo)記物、熒光素標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、分離試劑。發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的喹諾酮類藥物半抗原，熒光標(biāo)記物是指熒光素或其衍生物標(biāo)記的喹諾酮類藥物單克隆抗體，分離試劑是指包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。本發(fā)明還涉及一種采用所述的試劑盒檢測(cè)動(dòng)物源性食品中喹諾酮類藥物的方法，本方法對(duì)喹諾酮類藥物檢測(cè)具備較高的靈敏度、特異性和較快的檢測(cè)速度。
文檔編號(hào)G01N33/52GK102565401SQ20101059110
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者萬(wàn)宇平, 何方洋, 馮才偉, 劉福林, 徐念琴, 石潔, 羅曉琴, 羅貴昆 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司