專利名稱：檢測萊克多巴胺的磁顆?；瘜W發(fā)光試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種化學發(fā)光檢測試劑盒及其測試方法，特別是檢測飼料、組織、尿液等樣本中萊克多巴胺殘留量的磁顆粒化學發(fā)光檢測試劑盒。
背景技術：
萊克多巴胺(Ractopamin)屬于β -興奮劑。β -興奮劑是營養(yǎng)重分配劑的一種，是一類結構和功能類似腎上腺素而后去甲腎上腺素的苯乙醇胺類衍生物，它能改善脂肪型動物的肉與脂肪的比例，降低酮體脂肪含量，提高瘦肉率，并能加速動物生長，而被添加于動物飼料中。常見的β 2-興奮劑有克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇等。隨著我國對克倫特羅的監(jiān)管力度的加大，克倫特羅的使用逐漸減少，其他β 2-興奮劑的使用逐漸增加。由于萊克多巴胺有類似于克倫特羅的作用，在動物組織中殘留，從而對人體產生不利影響，所以我國禁止萊克多巴胺其作為飼料添加劑使用。 在萊克多巴胺的檢測方面，目前最常用的方法包括高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等方法，儀器方法操作繁瑣、耗時長、檢測費用昂貴，對檢測人員專業(yè)要求較高，樣本前處理方法復雜，儀器本身的價格也比較昂貴，不利于推廣應用，酶聯(lián)免疫吸附法是基于抗原-抗體的特異性反應，檢測靈敏度高，特異性較好，技術操作簡單，對食品安全快速檢測技術的發(fā)展起到了積極的促進作用，但是ELISA方法存在一些缺陷，如非均相反應，需要多步洗板過程，難以提高操作的自動化程度，酶催化反應，對溫度的要求較高，試劑盒的穩(wěn)定性較差。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種檢測萊克多巴胺的磁顆?；瘜W發(fā)光試劑盒，采用該試劑盒進行萊克多巴胺的檢測時不僅具備較高的靈敏度，特異性，而且反應速度較快。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種萊克多巴胺的測試方法，該方法操作簡單，靈敏度高，特異性好。實現上述目的，本發(fā)明提供一種萊克多巴胺檢測試劑盒，其包含的主要試劑有發(fā)光標記物、突光素標記物、標準品、質控品、分離試劑。所述的分離試劑是包被有羊抗FITC抗體的順磁性納米微珠。所述的順磁性納米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基團的微珠，用于包被羊抗FITC單克隆抗體，其內芯是Fe3O4或Y -Fe2O3,使得微珠具有順磁性。所述的發(fā)光標記物是異魯米諾衍生物標記的萊克多巴胺半抗原。所述的異魯米諾衍生物是ABEI、AHEI或ΑΒΕΝ。所述的試劑盒還包括標準品,質控品和濃縮洗液。所述的熒光素標記物是FITC標記萊克多巴胺單克隆抗體。本發(fā)明還提供一種利用試劑盒檢測萊克多巴胺的方法，包括下列步驟
I)分別吸取20 μ 1-100 μ I標準品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ I發(fā)光標記物，再加20 μ 1-100 μ I突光素標記物,充分混勻后,37°C溫育15min ；2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80_150μ 1，混勻后在37°C溫育5min ；3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500 μ I沖洗復合物沉淀；4)上述清洗步驟重復2-4次；5) 4)所得分離好的復合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測發(fā)出的相對光強度(RLU)，樣本中的含量與RLU成一定比例關系，可以通過RLU集合標準曲線法計算萊克多巴胺的濃度。所述的發(fā)光底物的主要成分是NaOH和Η202。 本發(fā)明中分析測試方法所用的分析儀是包括電源電路、自動注射泵I和2、測量室、發(fā)光室、光電倍增管計數器和輸出系統(tǒng)，同時還配置有計算機與中文界面的Windows控制軟件，可進行資料錄入、結果匯總、質量控制、結果儲存和結果查詢等功能，可完成多種分析模式的編程，定量或定性報告結果，自動生成并儲存、更新功能，兩點自動修正標準曲線，所采用的系統(tǒng)是CI-2008系統(tǒng)。本發(fā)明所述的分離試劑是包被羊抗FITC單克隆抗體，其表面基團的含量是O. 1-0. 3eqm/g，其保存于 pH7. 1-7. 5，含有 O. 1-0. 5 % 牛血清白蛋白，O. 2-0. 4% 吐溫-20，O. 2-0. 3%疊氮化鈉，O. 1-0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液中。所述的FITC是異硫氰酸熒光素。所
述百分含量為質量百分含量。所述的發(fā)光標記物是異魯米諾衍生物ABEI、AHEI或ABEN標記的萊克多巴胺半抗原，其保存于PH7. 2-7. 6，含有O. 2-0. 4%吐溫-20，O. 1-0. 2%疊氮化鈉，O. 1-0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖液中。所述百分含量是質量百分含量。所述的熒光素標記物是FITC標記的萊克多巴胺單克隆抗體，其保存于PH7. 2-7. 6，含4-8%卵清蛋白，O. 2-0. 3%疊氮化鈉，O. 2-0. 3mol/L的磷酸鹽緩沖液。所述百分含量為質量百分含量。萊克多巴胺標準品溶液(0ng/ml,0.lng/ml,0. 3ng/ml,0. 9ng/ml, 2. 7ng/ml,8. lng/ml)，標準品稀釋液為ρΗ7· 2-7. 6,0. 2_0. 4 %疊氮化鈉，O. 1-0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液。所述百分含量為質量百分含量。萊克多巴胺質控品溶液濃度分別為O. 2ng/ml，5ng/ml，質控品稀釋液pH7. 2-7. 6，O. 2-0. 4%疊氮化鈉,O. 1-0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液。所述百分含量為質量百分含量。所述的濃縮洗液為PH7. 2-7. 8,0. 2-0. 4 %吐溫-20，O. 2-0. 4 %疊氮化鈉，O. 1-0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液。所述百分含量為質量百分含量。本發(fā)明的有益效果如下I)本發(fā)明試劑盒可特異性檢測萊克多巴胺，對其他藥物無交叉。2)本發(fā)明試劑盒的靈敏度較高，對萊克多巴胺的檢測靈敏度可達O. lng/ml。3)本發(fā)明試劑盒的檢測快捷，檢測時間低于20min。
具體實施例方式實施例一試劑盒具體組分的制備
I)半抗原的合成將萊克多巴胺與氯乙酸鈉進行鹵代反應，取代萊克多巴胺分子上的羥基，合成含有2個碳的羧基間接臂制備成萊克多巴胺的半抗原。2)免疫原的制備將萊克多巴胺半抗原與牛血清白蛋白采用水溶性碳化二亞胺法進行偶聯(lián)得到免疫原。3)單克隆抗體的制備動物免疫以免疫原對Balb/c小鼠進行免疫，免疫劑量為100 μ g/只，使其產生抗
血清。 細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按9 I比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，得到單克隆抗體的雜交瘤細胞株。細胞凍存和復蘇將雜交瘤細胞用凍存液制成IX IO9個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)。單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油O. 5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細胞5X IO7個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，得到單克隆抗體。4)發(fā)光標記物的制備取4. 5mmol/L ABEI,溶于4ml蒸懼水中，5. Ommol/L N-輕基琥拍酰亞胺溶于O. 5mlN，N-二甲基甲酰胺中，二者充分混勻后室溫反應3-4h。取上述制備的萊克多巴胺半抗原15mg,用pH7. 4PBS調節(jié)體積到I. 5ml，然后加入上述活化的ABEI溶液，充分混勻后室溫反應過夜，過G-25凝膠柱純化。5)熒光標記物制備用O. 025mol/L, pH9. O的碳酸鹽緩沖液將萊克多巴胺單克隆抗體稀釋成1%質量百分比濃度；根據欲標記的蛋白質總量，按每毫克免疫球蛋白加O. Olmg FITC，用分析天平準確稱取所需的FITC粉末。用同一緩沖液將FITC配成O. lmg/ml的溶液，按上述抗體溶液體積的3-5倍，混入FITC稀釋液；在4 。C避光條件下電磁攪拌、標記30-48h ;將標記溶液3000r/min，室溫離心20min，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再pH7. 4的PBS緩沖液透析2-3天，期間至少更換透析液3次；取透析過夜的標記物,通過SephadexG-25或G_50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光標記物進行鑒定，分裝，貯存于4°C冰箱中。6)分離試劑制備a)磁珠活化表面-COOH基團的磁珠(購于DYNAL，粒徑為2. 8 μ m)，其含量是O. 20eq/g ;取100 μ I 磁珠,用 100 μ I 25mmol/L, pH5. 0,0. 05% Tween_20MES 溶液洗漆兩次,磁分離后移除上清；使用前，用4°C貯存的25mmol/L MES溶液分別配置50mmol/L的EDC、NHS溶液；分別加入50 μ I新配置的EDC和NHS溶液到裝有磁珠的離心管中，渦旋混勻，室溫活化30min ；離心管置于磁分離架上磁分離4min,移除上清,加入100 μ I, 25mmol/L,pH5. 0,MES清洗2_3次后即可得表面羧基活化的磁珠。b)磁珠偶聯(lián)羊抗FITC單克隆抗體
將50-100 μ g羊抗FITC單克隆抗體溶解到60 μ 1，25mmol/L，pH5. OMES中，用所述MES溶液調節(jié)總體積至100 μ 1，輕柔混勻磁珠與抗體；室溫條件下至少偶聯(lián)30min或4V偶聯(lián)2h，該期間可利用渦旋儀使磁珠保持混勻狀態(tài)；離心管置于磁分離架上磁分離3-5min，移除上清；為了淬滅未反應的-C00H，可加入100 μ 1，ρΗ7. 4，TRIS反應15min或100μ 1，ρΗ8· 0，含有 50mmol/L 乙醇胺的 PBS 封閉磁珠；用 100 μ 1,0. 1-0. 3% BSA, O. 1% Tween-20的PBS或TRIS清洗封閉好的磁珠3-5次；最后將磁珠復溶于含O. 1-0. 5% BSA, O. 01-0. I %Tween-20,0. 02%硫柳汞的PBS或TRIS緩沖液中，2_8°C保藏。實施例二試劑盒的組建組建檢測萊克多巴胺的磁顆?；瘜W發(fā)光檢測試劑盒，使其含有下列組分FITC標記的萊克多巴胺單克隆抗體的熒光標記物ABEI標記的萊克多巴胺半抗原的發(fā)光標記物 表面包被羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠的分離試劑萊克多巴胺標準品溶液(0ng/ml,0.lng/ml, O. 3ng/ml,0. 9ng/ml, 2. 7ng/ml,8. lng/ml)，標準品稀釋液為pH7. 4，含有0.3%疊氮化鈉，0. lmol/L磷酸鹽緩沖液。所述百分含量為質量百分含量。萊克多巴胺質控品溶液濃度分別為O. 2ng/ml，5ng/ml，質控品稀釋液pH7. 4，含有O. 3%疊氮化鈉，O. lmol/L磷酸鹽緩沖液。所述百分含量為質量百分含量。濃縮洗液為pH7. 6,0. 2%吐溫-20，0. 3%疊氮化鈉，O. 2mol/L磷酸鹽緩沖液。所述百分含量為質量百分含量。實施例三實際樣品中萊克多巴胺的檢測I、樣本前處理(一 )尿液前處理方法取50 μ I清亮尿樣直接測定(如尿樣渾濁必須通過過濾或3000g以上，15°C離心IOmin直至清亮)，暫不使用的樣本應冷凍保存，樣本稀釋倍數I。( 二)豬肉、豬肝前處理方法用均質器均質豬肉、豬肝樣本；稱取5. 0±0. 05g均質物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入IOml乙腈,用振蕩器劇烈振蕩IOmin, 3000g以上，15 離心5min ;取3ml上層清亮有機相至IOml干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己烷，用渦旋儀渦動30s ;加入Iml復溶工作液混合，用渦旋儀渦動lmin，3000g以上，15°C離心5min ;除去上層正已烷相，取下層50μ I用于分析，樣本稀釋倍數1。(三)飼料前處理方法用均質器均質飼料樣本；稱取3. 0±0. 05g均質樣本于50ml離心管中，加入9m乙腈，用振蕩器劇烈振蕩5min,3000g以上，15°C離心5min ;取Iml上層清亮有機相至IOml干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己烷，用渦旋儀渦動30s ;再加入Iml復溶工作液混合，用渦旋儀渦動lmin，3000g以上，15°C離心5min ;除去上層正已烷相，取下層50 μ I用于分析，樣本稀釋倍數4。2、用試劑盒檢測與結果分析分別吸取20 μ 1-100 μ I標準品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ I發(fā)光標記物，再加20 μ 1-100 μ I熒光素標記物，充分混勻后，37°C溫育15min ;加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150 μ I，混勻后在37°C溫育5min ;用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500 μ I沖洗復合物沉淀；所得分離好的復合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測發(fā)出的相對光強度(RLU)，樣本中萊克多巴胺的含量與RLU成一定比例關系，可以通過RLU結合標準曲線法計算萊克多巴胺的濃度。激發(fā)底物I是NaOH，激發(fā)底物2是H2O2。底物裝載前，用蒸餾水清洗底物泵10_20遍，排空管道內殘存的水跡后，再將相應的底物直接放入儀器內，將泵管插入底物瓶中；用底物沖洗管道5次，并測定底物的RLU值，正常情況下，底物的RLU值不應超過1200。若超過1200，需重新用蒸餾水對管道和底物泵進行更多次清洗，直至空白值降至合理范圍內。若超過三天不做實驗，需卸載底物瓶，并蓋上蓋子，以防蒸發(fā)。隨后用蒸餾水清洗管道，并排空，以免強堿溶液腐蝕底物泵。 本發(fā)明采用6個萊克多巴胺標準品(0ng/ml,0. lng/ml,O. 3ng/ml,0. 9ng/ml,2. 7ng/ml，8. lng/ml)進行曲線測繪。儀器根據所述方法檢測得到一條RLU值與萊克多巴胺濃度相關的定標曲線，此后測量中，每一個樣本中的萊克多巴胺濃度與標準曲線相比較得出樣本中的萊克多巴胺含量。實施例四試劑盒質量的測定I、試劑盒的靈敏度試劑盒靈敏度的定義為測定20次零標準品，測定的平均值加上3倍標準差。該試劑盒的靈敏度為O. lng/ml ο2、樣本的準確度和精密度準確度是指測定值與真值間的符合程度，試劑盒準確度常用回收率表示。精密度又稱可重復性，常用變異系數表示。按照實施例三的樣本提取方法，以O. 2ng/g(ml)、0· 4ng/g(ml)兩個濃度的萊克多巴胺分別對豬尿、豬肝、豬肉進行添加，以lng/g、2ng/g兩個濃度的萊克多巴胺對飼料樣本進行添加回收，每種樣本每個濃度各4個平行，用三批試劑盒進行測定，計算樣本的平均回收率及精密度。實驗結果見下表。表I準確度和精密度測定ng/g (ml)
權利要求
1.一種檢測萊克多巴胺的磁顆?；瘜W發(fā)光試劑盒,包括的試劑有發(fā)光標記物、突光素標記物、標準品、質控品、分離試劑。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的分離試劑是包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的順磁性納米微珠是里面包覆有Fe3O4或Y -Fe2O3,表面含有_0H、-COOH或-NH2活性基團的微珠。
4.根據權利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于所述的發(fā)光標記物是異魯米諾衍生物標記的萊克多巴胺半抗原。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的異魯米諾發(fā)光標記物是ABEI、AHEI 或 AffiN。
6.根據權利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包括標準液、質控品和濃縮洗液。
7.根據權利要求1-3之一所述的試劑盒，其特征在于所述的熒光素標記物是FITC標記的萊克多巴胺單克隆抗體。
8.一種利用權利要求1-7任一項所述的試劑盒檢測萊克多巴胺的方法，包括下列步驟 1)分別吸取20μ 1-100 μ I標準品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ I發(fā)光標記物，再加.20 μ 1-100 μ I突光素標記物,充分混勻后,37°C溫育15min ； 2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150μ1，混勻后在37°C溫育5min ； 3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500μ I沖洗復合物沉淀； 4)上述清洗步驟重復2-4次； 5)所得分離好的復合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測發(fā)出的相對光強度(RLU)，樣本中萊克多巴胺的含量與RLU成一定比例關系，可以通過RLU集合標準曲線法計算萊克多巴胺的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測萊克多巴胺的磁顆?；瘜W發(fā)光試劑盒，包括的試劑有發(fā)光標記物、熒光素標記物、標準品、質控品、分離試劑。發(fā)光標記物是異魯米諾發(fā)光標記物標記的萊克多巴胺半抗原，熒光標記物是指熒光素或其衍生物標記的萊克多巴胺單克隆抗體，分離試劑是指包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。本發(fā)明還涉及一種采用所述的試劑盒檢測動物源性食品中萊克多巴胺的方法，本方法對萊克多巴胺檢測具備較高的靈敏度、特異性和較快的檢測速度。
文檔編號G01N33/577GK102928410SQ20111022738
公開日2013年2月13日 申請日期2011年8月9日 優(yōu)先權日2011年8月9日
發(fā)明者萬宇平, 周德剛, 楊昌松, 王鑫, 趙正苗, 王建霞 申請人:北京勤邦生物技術有限公司