專利名稱：一種量子點(diǎn)免疫熒光探針的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種量子點(diǎn)免疫熒光探針的制備方法，屬于納米材料學(xué)、生物分析化 學(xué)、納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
量子點(diǎn)(quantum dots, QDs)，又稱半導(dǎo)體納米晶，其半徑小于或接近激子波爾半 徑，主要由II-VI族元素(如CdTe、CdSe)或III-V族元素(如GaAs、InP)構(gòu)成。量子點(diǎn)因 具有獨(dú)特的光學(xué)與電學(xué)特性近年來引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注，其在紫外-可見光范圍內(nèi)廣 泛而連續(xù)的吸收光譜，窄且對(duì)稱的熒光發(fā)射光譜使之具有單激發(fā)、多發(fā)射的多色標(biāo)記功能。 量子點(diǎn)還具有光穩(wěn)定性好、耐光漂白的獨(dú)特性質(zhì)，使其有望取代傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料，獲得 在生物醫(yī)學(xué)熒光標(biāo)記領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。量子點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)標(biāo)記領(lǐng)域的應(yīng)用，通常先需要與生物素/親和素、抗體、寡核苷 酸等生物分子結(jié)合，形成生物熒光探針，再加入樣品中結(jié)合欲標(biāo)記的相應(yīng)配體、抗原或者核 酸。量子點(diǎn)與抗體的結(jié)合可通過靜電吸附法直接與抗體結(jié)合，這種方法雖然簡單易行，但結(jié) 合不夠可靠，PH、溫度、離子強(qiáng)度等環(huán)境因素改變可使量子點(diǎn)-抗體復(fù)合物解偶聯(lián)。直接在 水相中制備的水溶性量子點(diǎn)在制備過程中在其表面引入了大量的氨基或者羧基，因此可以 通過這些功能集團(tuán)與抗體蛋白分子中的氨基或者羧基形成化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)，得到穩(wěn)定的量子 點(diǎn)-抗體熒光探針

發(fā)明內(nèi)容
為拓展量子點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用，本發(fā)明提供了一種將水溶性羧基化量子點(diǎn) 用于標(biāo)記具有生物活性的抗體蛋白進(jìn)而制備免疫熒光探針的方法，該方法可將羧基化量子 點(diǎn)有效地與抗體蛋白連接，并很好地保持抗體的生物活性，可應(yīng)用于基于抗原抗體特異性 結(jié)合的生物標(biāo)記分析領(lǐng)域，例如基于測量熒光強(qiáng)度的抗原/抗體定量分析、酶聯(lián)免疫吸附 分析、標(biāo)記細(xì)胞中特定蛋白的胞內(nèi)定位、研究核酸雜交等。本發(fā)明的量子點(diǎn)免疫熒光探針是在羧基化量子點(diǎn)末端連接特異性的抗體，通?？?連接一個(gè)或者一個(gè)以上抗體分子，數(shù)目可以通過控制量子點(diǎn)和抗體的比例進(jìn)行調(diào)整。其中羧基化量子點(diǎn)的核心為CdTe、CdSe、CdTe/ZnS、CdSe/ZnS中的任意一種，且為 水相中直接制備的，以巰基丙酸或者其他含羧基的巰基化合物修飾的水溶性量子點(diǎn)。所用 的抗體可以是針對(duì)一種蛋白或者某蛋白的一個(gè)結(jié)構(gòu)域，或者一段多肽的單克隆抗體，也可 以是針對(duì)來自不同物種蛋白的多克隆抗體?！N量子點(diǎn)免疫熒光探針的制備方法，其特征在于采用如下步驟A)用濃度為0. 2mol/L, pH值為7. 2-7. 6的磷酸鹽緩沖液溶解1_乙基_3_ (3- 二甲 氨丙基)碳二亞胺和N-羰基琥珀酸亞胺，配制成羧基活化劑，活化劑中1-乙基-3-(3-二甲 氨丙基)碳二亞胺和N-羰基琥珀酸亞胺的濃度均為50mg/mL，將該活化劑按體積比1 8 加入至濃度為lmg/mL市售羧基化量子點(diǎn)中，在室溫下輕微振蕩使羧基活化形成活潑酯，經(jīng)高速離心機(jī)分離使量子點(diǎn)沉降，棄去上清液；B)往步驟A)的量子點(diǎn)沉淀中加入A)中使用的磷酸鹽緩沖液，在渦旋振蕩器上輕 微振蕩使量子點(diǎn)重新懸浮至A)加入活化劑后的體積，再高速離心機(jī)分離及重懸，照此重復(fù) 2次，再次高速離心使量子點(diǎn)沉降；C)加入濃度為lmg/mL的抗體溶液，輕微振蕩使量子點(diǎn)在抗體溶液中重新懸浮至 步驟A)中加入活化劑后的體積，并使抗體與羧基活化的量子點(diǎn)充分接觸，發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)反 應(yīng)，在室溫下放置lh，每隔20min輕微振蕩一次，Ih后經(jīng)低速離心機(jī)分離使形成的量子點(diǎn)團(tuán) 塊沉降，所得上清液即為量子點(diǎn)免疫熒光探針。本發(fā)明是在近年來發(fā)展起來的水熱法直接制備水溶性量子點(diǎn)技術(shù)的基礎(chǔ)上，用巰 基丙酸作為穩(wěn)定劑修飾量子點(diǎn)表面，使之帶有大量的羧基功能基團(tuán)，利用EDC和NHS或者其 中之一作為羧基與氨基的偶聯(lián)劑，將抗體可靠地連接在量子點(diǎn)表面。該方法簡單易行、安全 可靠，無需特殊儀器試劑，在大多數(shù)生物、化學(xué)實(shí)驗(yàn)室均可完成，適合推廣應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué) 標(biāo)記分析領(lǐng)域。


圖1為為量子點(diǎn)免疫熒光探針的照片。圖2為量子點(diǎn)免疫熒光探針的TEM圖像。圖3為量子點(diǎn)免疫熒光探針結(jié)合了 ELISA板底部的抗原后的熒光顯微鏡照片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 將0. 4g的NaBH4和0. 08g碲粉加入50mL錐形瓶中，加入5mL去離子水，通氮?dú)?20min，立即塞緊軟膠塞，插入一個(gè)注射器針頭，磁力攪拌2h，得到乳白色新鮮制備的NaHTe 溶液。取0. 5mL濃度為200mmol/L的CdCl2水溶液，0. 5mL濃度為200mmol/L新鮮配制的巰 基丙酸水溶液，加入另一個(gè)50mL錐形瓶中，加入14ml去離子水，滴加濃度為lmol/L的NaOH 溶液，調(diào)整PH為12. 0，向上述溶液中通氮?dú)?0min，立即塞緊軟膠塞，插入一個(gè)注射器針頭， 用ImL注射器抽取新鮮制備的NaHTe溶液0. 2mL，快速注入裝有Cd前驅(qū)液的錐形瓶中，將錐 形瓶放入96°C水浴鍋中加熱lh，取出自然冷卻至室溫；打開裝有反應(yīng)混合物的錐形瓶的軟 膠塞，將溶液等分于兩只15mL離心管中，再分別向兩只離心管中加入與上清液等體積的無 水乙醇，待有絮狀物產(chǎn)生時(shí)，用3000rpm/min的速度離心分離lOmin，吸出上清液，重復(fù)無水 乙醇洗滌、離心分離步驟2次，最后一次將上清液除去后將離心管放置于恒溫恒濕柜中過 夜，得到CdTe量子點(diǎn)干粉。按如下方法取用水溶性量子點(diǎn)將用PBS復(fù)溶的量子點(diǎn)干粉用2%的優(yōu)級(jí)純硝酸 稀釋100，000倍，根據(jù)衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)WS-T 174-1999所述方法，用石墨爐原子吸收光譜法定量 量子點(diǎn)中Cd的濃度，并換算成CdTe的濃度。用pH值為7. 2-7. 6，0. 2M的PBS稀釋量子點(diǎn) 溶液至1. Omg/mL，在渦旋振蕩器上振蕩分散20s，取ImL備用。若抗體為自行純化得到，則應(yīng)避免添加疊氮鈉作為防腐劑，可使用prOClin300作 為防腐劑，終質(zhì)量百分濃度為0. 02% ；若抗體為商品化的產(chǎn)品，則應(yīng)在4°C條件下對(duì)PBS透 析過夜后使用，防止疊氮鈉與活化的羧基結(jié)合，進(jìn)而將其滅活，阻礙抗體的結(jié)合?？贵w的濃度可根據(jù)需要調(diào)整，優(yōu)選0. l_5mg/mL，更優(yōu)選0. 5-2mg/mL用于與量子點(diǎn)的偶聯(lián)。將EDC和NHS分別配制成濃度為50mg/mL的溶液，為保證偶聯(lián)的效率，偶聯(lián)劑溶液 應(yīng)新鮮配制。取2個(gè)1.5mL離心管，向每個(gè)離心管中依次加入100 μ L分散好的量子點(diǎn)、540 μ L 去離子水，240yL PBS以及60yL EDC和60yL NHS溶液。將離心管以錫紙包裹，放在搖床 上室溫下避光反應(yīng)30min。取出離心管，置于高速離心機(jī)中，室溫下12000rpm離心分離5min，使量子點(diǎn)沉降， 棄去上清液。加入1. OmL PBS，渦旋振蕩20s重懸量子點(diǎn)，之后再次高速離心分離，重復(fù)2 次，除去溶液中剩余的偶聯(lián)劑。加入200 μ L濃度為1. Omg/mL不含疊氮鈉的抗體溶液，加入裝有量子點(diǎn)的離心管
中，在渦旋振蕩器上輕輕振蕩使量子點(diǎn)在抗體溶液中均勻分散。用錫箔紙包裹離心管，放置 在搖床上室溫下振蕩反應(yīng)Ih。取出離心管，置于低速離心機(jī)中，3000rpm離心5min，去除可能形成的沉淀，所得 上清即為水溶性量子點(diǎn)_抗體免疫熒光探針。將量子點(diǎn)免疫熒光探針通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察，可以看到所制備的探針 中量子點(diǎn)具有良好的單分散性(圖2)。用相應(yīng)的抗原包被ELISA板，加入量子點(diǎn)免疫熒光 探針與之結(jié)合，再分別用含有Tween-20的洗滌液以及PBS洗板3次，之后在熒光顯微鏡下 觀察，可清楚地看到探針的熒光(圖3)，表明探針具有良好的生物活性。進(jìn)一步采用ELISA 法測定探針中抗體的效價(jià)，結(jié)果可達(dá)106，證明抗體的生物活性在探針制備的偶聯(lián)反應(yīng)中得 到了很好的維持。
權(quán)利要求
一種量子點(diǎn)免疫熒光探針的制備方法，其特征在于采用如下步驟A)用濃度為0.2mol/L，pH值為7.2 7.6的磷酸鹽緩沖液溶解1 乙基 3 (3 二甲氨丙基)碳二亞胺和N 羰基琥珀酸亞胺，配制成羧基活化劑，活化劑中1 乙基 3 (3 二甲氨丙基)碳二亞胺和N 羰基琥珀酸亞胺的濃度均為50mg/mL，將該活化劑按體積比1∶8加入至濃度為1mg/mL市售羧基化量子點(diǎn)中，在室溫下輕微振蕩使羧基活化形成活潑酯，經(jīng)高速離心機(jī)分離使量子點(diǎn)沉降，棄去上清液；B)往步驟A)的量子點(diǎn)沉淀中加入A)中使用的磷酸鹽緩沖液，在渦旋振蕩器上輕微振蕩使量子點(diǎn)重新懸浮至A)加入活化劑后的體積，再高速離心機(jī)分離及重懸，照此重復(fù)2次，再次高速離心使量子點(diǎn)沉降；C)加入濃度為1mg/mL的抗體溶液，輕微振蕩使量子點(diǎn)在抗體溶液中重新懸浮至步驟A)中加入活化劑后的體積，并使抗體與羧基活化的量子點(diǎn)充分接觸，發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)，在室溫下放置1h，每隔20min輕微振蕩一次，1h后經(jīng)低速離心機(jī)分離使形成的量子點(diǎn)團(tuán)塊沉降，所得上清液即為量子點(diǎn)免疫熒光探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于抗體是針對(duì)不同蛋白，或者蛋白的一 個(gè)結(jié)構(gòu)域，或者一段多肽的單克隆抗體，或者是針對(duì)來自不同物種蛋白的多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種量子點(diǎn)免疫熒光探針的制備方法，水溶性量子點(diǎn)標(biāo)記的單克隆抗體熒光探針是在羧基化修飾的量子點(diǎn)末端共價(jià)連接單克隆抗體，通常每個(gè)量子點(diǎn)可以連接一個(gè)或者一個(gè)以上的抗體分子，其制備方法是先在水溶液中利用水熱法制得巰基丙酸修飾的量子點(diǎn)，再通過共價(jià)偶聯(lián)的方法使羧基修飾的量子點(diǎn)連接抗體蛋白，得到既有良好的熒光特性又有優(yōu)異的生物活性的量子點(diǎn)免疫熒光探針。同現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是該探針分散性好、特異性強(qiáng)、熒光強(qiáng)度大且耐光漂白，可應(yīng)用于與免疫檢測、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物細(xì)胞或組織的熒光成像技術(shù)等相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。該方法簡單易行，可在一般的生物、化學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。
文檔編號(hào)G01N33/536GK101907625SQ20101022027
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月8日
發(fā)明者張路遙, 潘敏, 牛婉婷, 陳裕泉 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)