專利名稱：：呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：AOZ(化學名3-氨基-2-惡唑烷酮)是呋喃唑酮(FuranzoIidone，F(xiàn)Z)在生物體內(nèi)主要代謝殘留物，經(jīng)胃酸生成的分解物羥乙基胼為劇毒類物質(zhì)，對人類有致癌危險。呋喃唑酮又稱痢特靈，為硝基呋喃類藥物(呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林)中最具代表性的一種，是一種人工合成的抗菌藥，呈黃色粉末或結(jié)晶性粉末，分子量225.16，熔點245258°C，遇堿分解，在強光下顏色逐漸變深。最早發(fā)現(xiàn)5-硝基呋喃的抗菌活性為1944年在美國和德國進行的生物合成和微生物學試驗中，隨后呋喃唑酮等同系物相繼上市。并發(fā)現(xiàn)此類藥藥效穩(wěn)定，抑制或殺滅多種革蘭氏陽性和陰性細菌，對某些原蟲、真菌有一定作用。因其效高價廉，廣泛應用于醫(yī)藥、畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖中。近年來研究表明呋喃唑酮及其代謝物具有相當大的毒性和副作用，能誘導有機體基因突變、畸胎、癌癥，因而引起了人們的高度重視。目前國內(nèi)外都對呋喃類物質(zhì)的控制相當嚴格，各國對于測定的標準都有明確的規(guī)定。1995年，歐盟國家禁止呋喃唑酮用于食品動物，隨后美國、日本、澳大利亞等國均取消呋喃唑酮在畜、禽、水產(chǎn)生產(chǎn)上的使用。根據(jù)給動物喂飼帶有示蹤標記的呋喃唑酮代謝動力學實驗表明，呋喃唑酮在體內(nèi)代謝速度很快，而在組織中結(jié)合的代謝產(chǎn)物(AOZ)則能存留大約6周時間，結(jié)合殘留物總量與AOZ呈顯著相關(guān)關(guān)系，為最合適的呋喃唑酮殘留監(jiān)測的靶化合物。目前AOZ測定方法主要有液相色譜/紫外(LC/UV)分析和液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析法(LC/MS)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC/MS/MS)，但這些方法所需儀器價格昂貴，實驗過程繁瑣，不適用于現(xiàn)場快速檢測。目前，在藥物殘留快速檢測中得到廣泛應用的有微生物法和酶聯(lián)免疫法，但是，這兩種方法對于檢測禁用藥物在靈敏度上常常達不到要求。以化學發(fā)光免疫分析(Chemiluminescencelmmunoassay,CLIA)為代表的快速篩選法為免疫學主流技術(shù)，但目前國內(nèi)外尚無利用化學發(fā)光免疫分析(CLIA)方法檢測呋喃唑酮代謝物AOZ的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種呋喃唑酮代謝物AOZ的化學發(fā)光免疫分析(CLIA)試劑盒，該試劑盒不僅可以實現(xiàn)快速、大批量檢測，而且檢測特異性和靈敏度顯著提尚ο此外，還需要提供一種上述試劑盒的檢測方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，包括檢測板、試齊，所述試劑包括抗體、檢測目標物標準溶液，所述檢測目標物為呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的對硝基苯化衍生物4-ΝΡΑ0Ζ。該4-ΝΡΑ0Ζ通過在乙醇中加入AOZ和對硝基苯甲醛反應制得，其反應方程式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>優(yōu)選的，所述抗體是用呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮衍生化半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原制備出的單克隆抗體。免疫原采用AOZ衍生化半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，是因為抗體制備時，只有抗原分子量較大的化合物(>5000D)注射到動物體內(nèi)時才能誘導動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體。如果是小分子量的化合物(這類化合物叫半抗原)，不能直接誘導動物產(chǎn)生抗體，而為了制得抗體，需將該小分子化合物偶聯(lián)于大分子載體(如牛血清白蛋白，BSA)上制得抗原，再將其用于免疫動物，制備抗體。所述呋喃唑酮代謝物AOZ衍生化半抗原是呋喃唑酮代謝物AOZ與對醛基苯甲酸反應所得的衍生物4-CPA0Z，4-CPA0Z的化學結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>所述載體蛋白包括牛血清白蛋白、卵清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、人血纖維蛋白或血藍蛋白。優(yōu)選的，所述載體蛋白為牛血清白蛋白。優(yōu)選的，所述檢測板為化學發(fā)光板，適用于化學發(fā)光免疫分析檢測。所述檢測板的各孔包被有包被抗原，該包被抗原為呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮衍生化半抗原與卵清白蛋白的偶聯(lián)物，所述呋喃唑酮代謝物AOZ衍生化半抗原是上述呋喃唑酮代謝物AOZ與對醛基苯甲酸反應所得的衍生物4-CPA0Z。本發(fā)明采用呋喃唑酮代謝物AOZ衍生化半抗原與卵清白蛋白偶聯(lián)物作為抗原包被檢測板各孔，然后加入經(jīng)對硝基苯甲醛衍生化前處理過的待測樣品和抗呋喃唑酮代謝物AOZ衍生化半抗原單克隆抗體，讓包被抗原和待測樣品兩者競爭抗體以檢測樣品中的AOZ衍生物4-NPA0Z。優(yōu)選的，本發(fā)明試劑盒中的試劑還包括酶標二抗，該酶標二抗包括辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG濃縮液。優(yōu)選的，本發(fā)明試劑盒中的試劑還包括底物反應液，該底物反應液包含Tris-HCl緩沖液、魯米諾、對羥基苯丙烯酸和過氧化氫。優(yōu)選的，本發(fā)明試劑盒中的試劑還包括衍生劑，該衍生劑為對硝基苯甲醛，用于待測樣品的衍生化前處理。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種呋喃唑酮代謝物的檢測方法，包括以下步驟前處理待測樣品；用上述試劑盒檢測樣品；分析檢測結(jié)果。本發(fā)明呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，具有下列優(yōu)點(1)特異性強，敏感性高，安全性好。本發(fā)明檢測呋喃唑酮代謝物AOZ化學發(fā)光免疫分析(CLIA)試劑盒以4-NPA0Z為檢測目標物，該4-NPA0Z檢測目標物與半抗原4-CPA0Z的主體結(jié)構(gòu)一致，能與呋喃唑酮代謝物AOZ衍生物(4-CPA0Z-BSA)的單克隆抗體特異性結(jié)合，結(jié)合效率和靈敏度都比目前常用的2-NPA0Z檢測目標物更高。而且，本發(fā)明試劑盒中的單克隆抗體不含針對載體蛋白的抗體，只與相應呋喃唑酮代謝物AOZ衍生化檢測目標物4-NPA0Z結(jié)合或者同時與含AOZ及苯環(huán)結(jié)構(gòu)的相關(guān)修飾物極少量結(jié)合，不與動物其它抗生素藥物和消毒藥發(fā)生交叉反應。因此，本發(fā)明試劑盒具有很高的特異性和敏感性，檢測靈敏度達0.005ppbo(2)操作簡便快速。使用抗呋喃唑酮代謝物AOZ衍生化半抗原單克隆抗體化學發(fā)光免疫分析試劑盒檢測呋喃唑酮代謝物AOZ時，無需另配其它試劑，樣品無需無菌處理，按試劑盒說明在3-4小時內(nèi)即可判定檢測結(jié)果。(3)結(jié)果判定準確、可靠。本發(fā)明呋喃唑酮代謝物AOZ化學發(fā)光免疫分析檢測試劑盒以多功能酶標儀機讀數(shù)定量顯示檢測結(jié)果，減少主觀性，準確可靠。(4)成本低，投資少。本發(fā)明呋喃唑酮代謝物AOZ化學發(fā)光免疫分析檢測試劑盒可批量檢測，一步到位，成本低廉，投資少，見效快。下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細的說明。圖1是本發(fā)明實施例3檢測樣品的標準曲線圖；圖2是本發(fā)明實施例3中試劑盒變異系數(shù)的柱狀圖。具體實施例方式本發(fā)明檢測呋喃唑酮代謝物AOZ化學發(fā)光免疫分析(CLIA)試劑盒，包括檢測板、試劑，該試劑包括抗體、檢測目標物標準溶液，該檢測目標物為呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的對硝基苯化衍生物4-NPA0Z。運用本發(fā)明試劑盒檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物Α0Ζ，能顯著提高檢測靈敏度，其檢測分析原理是化學發(fā)光板上的每個孔均包被有相同量的呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮衍生化半抗原與卵清白蛋白偶聯(lián)物(4-CPA0Z-0VA)抗原，加入經(jīng)衍生化前處理的待測樣品和抗AOZ單克隆抗體后，包被抗原和待測樣品一起競爭AOZ抗體，由于每個孔中的固相抗原和加入的抗體含量均一致，所以當待測的4-NPA0Z濃度高時，則被結(jié)合在固相抗原上的抗體少，加入的酶標二抗與被固定抗體結(jié)合量少，用洗滌液洗滌后加入底物反應液，發(fā)光值低，表明抑制率高；反之，當待測的4-NPA0Z濃度低時，則所測的發(fā)光值高，表明抑制率低。根據(jù)用已知的4-NPA0Z濃度檢測所作的標準曲線，可以推算出待測樣品的AOZ濃度。實施例1單克隆抗體的制備(1)免疫抗原的制備將呋喃唑酮代謝物AOZ與對醛基苯甲酸反應，制得4-CPA0Z。再將4-CPA0Z與牛血清白蛋白進行偶聯(lián)，得4-CPA0Z-BSA偶聯(lián)物即為免疫抗原。(2)單克隆抗體制備1)動物免疫將上述合成的免疫抗原免疫小鼠，首免時將免疫抗原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔2-3周取相同劑量免疫抗原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，四免后腹腔加強免疫一次，3天后取脾細胞。2)細胞融合與克隆化取免疫小鼠脾細胞，按5-101比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔，利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株；3)單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，給小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射雜交瘤細胞5XIO5IO6個/只，7_14天后采集腹水，用辛酸_飽和硫酸銨法進行腹水純化，小瓶分裝，-20°C保存。4)將單克隆抗體制成工作液100xAOZ衍生化半抗原單抗(一抗)濃縮液為將2μ1提純的單抗和50μ1牛血清加入148μ1滅菌的50%甘油水中?？贵w稀釋緩沖液5%牛血清的0.05%吐溫-20的0.OlM磷酸鹽緩沖液(ρΗ7.4)。將單抗(一抗)濃縮液用抗體稀釋緩沖液稀釋100倍成單克隆抗體工作液。實施例2呋喃唑酮代謝物AOZ檢測試劑盒中檢測板和試劑的制備在該實施例2中，呋喃唑酮代謝物AOZ檢測試劑盒內(nèi)設有檢測板、檢測目標物4-ΝΡΑ0Ζ標準溶液、AOZ衍生化半抗原單抗、酶標二抗、底物反應液、衍生劑、樣品稀釋液和IOX濃縮洗滌液，其具體制備如下(1)呋喃唑酮代謝AOZ微孔檢測板的制備用ρΗ9.6的0.2Μ碳酸鹽緩沖液作包被液，將呋喃唑酮代謝物衍生化半抗原與卵清白蛋白偶聯(lián)物(4-CPA0Z-0VA)稀釋至200ng/ml，按100μ1/孔加入化學發(fā)光孔板中，4°C包被過夜。甩干，按200μ1/孔加入含明膠，ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液37°C封閉2小時，用疊氮鈉，PH7.4的磷酸鹽洗滌液洗3次，甩干，裝入含干燥劑的包裝袋中保存。(2)檢測目標物4-NPA0Z制備及其標準溶液的配制檢測目標物4-NPA0Z制備在IOml乙醇加入0.5gΑ0Ζ,0.375g對硝基苯甲醛，室溫反應2小時，過濾，得黃色沉淀，乙醇洗3次，即得4-NPA0Z。οοI0:丫、IHiIeXXr^uT]+-AOZ對硝基苯甲醛4-NPA0Z檢測目標物4-NPA0Z標準溶液的配制精確稱取4-NPAOZImg,先用2ml甲醇溶解，然后用含0.05%吐溫-20的0.OlM磷酸鹽緩沖液配制系列濃度為0,0.016,0.08,0.4、2、10ng/ml的標準4-NPA0Z溶液，即對應0、0·0072,0.0340,0.1702,0.8511,4.255ng/ml的AOZ濃度。(3)底物反應液及衍生劑的配制底物反應液配制成分及比例為0.IMpH8.5Tris-HCl緩沖液(Tris6.057g,pH8.5，定容500ml)lml，2mM魯米諾(0.1758g魯米諾溶于2mlDMSO中)4μ1，0.25mM增強劑對羥基苯丙烯酸(0.2g對羥基苯丙烯酸溶于3ml無水乙醇中)0.625μl，4mM過氧化氫1.6μ1；衍生劑為精確稱量對硝基苯甲醛0.3778g，用50ml甲醇溶解。(4)樣品稀釋液、洗滌液樣品稀釋液為含0.05%吐溫-20的0.OlM磷酸鹽緩沖液(KH2PO4O.2g，KCl0.2g，Na2HP0412H202.9g,NaCl8.0g，定容至1000ml，pH7.4，Tween-200.5mL)；IOX濃縮洗滌液為含0.05%吐溫-20的0.IM磷酸鹽緩沖液(KH2P042g，KCl2g，Na2HP0412H2029g，NaCl80g,定容至1000ml，pH7.4，Tween-205mL)。(5)酶標二抗為IOOx辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG濃縮液。實施例3運用本發(fā)明試劑盒檢測呋喃唑酮代謝物AOZ(1)樣品前處理動物組織(雞、豬)，蜂蜜、雞蛋、魚、蝦肉樣品的前處理①取Ig樣品置于離心管中，加入4ml水，在勻質(zhì)機下充分打碎；②然后加入IMHCl0.5ml,25mM對硝基苯甲醛25μ1，渦旋1分鐘后于37°C衍生16小時(或55°C衍生4小時)；③冷卻至室溫，加入0.lmol/LNa2HP045mL,lmol/LNaOH0.4mL，振蕩lmin，加入乙酸乙酯5mL，振蕩lmin,5000r/min離心6min；④吸取2.5mL乙酸乙酯層氮氣吹干，加入ImL正己烷溶解，并加入ImL樣品稀釋液，振蕩lmin,5000r/min離心IOmin；⑤取下層清液并注意pH值為中性，用樣品稀釋液稀釋待用。(2)試劑盒檢測步驟如下①將IOX濃縮洗滌液稀釋10倍即洗滌液，將一抗、二抗用抗體稀釋緩沖液進行10倍稀釋；②于適當微孔中分別加入50μ1/孔配好的系列4-ΝΡΑ0Ζ標準溶液(0、0.016、0.08、0.4、2、1013)，在另外的微孔中加入5(^1已完成前處理的樣品溶液，還在一孔中加入100μ1洗滌液作不加單抗的對照孔用于測定發(fā)光值時的對照孔。③除對照孔外，再于每一微孔中加入50μ1適當稀釋的抗呋喃唑酮代謝物AOZ衍生化半抗原單克隆抗體，37°C孵育90分鐘，甩干，每孔加洗滌液300μ1，洗滌3次，每次間隔2分鐘，拍干；④每孔加入100μ1的HRP酶標羊抗鼠(二抗)工作液，37°C孵育90分鐘，甩干，每孔加洗滌液300μ1，洗滌3次，每次間隔2分鐘，拍干；⑤每孔加入150μ1底物反應液2分鐘內(nèi)讀取化學發(fā)光數(shù)值。(3)結(jié)果判定標準先計算標準樣品抑制率(B/BJ，然后以抑制率為縱坐標，以標樣濃度的對數(shù)值為橫坐標，做標準曲線。根據(jù)每個樣品的BZiBci值就可從標準曲線上讀出相對應樣品的濃度。再乘以相應稀釋倍數(shù)。1)標準曲線與靈敏度以抑制率I為縱坐標，4-ΝΡΑ0Ζ標準溶液濃度的對數(shù)值為橫坐標，繪制出標準曲線(見圖1)。抑制率I=Β/Β0(Β為標準品化學發(fā)光值或樣品化學發(fā)光值，Btl為空白對照化學發(fā)光值)?；瘜W發(fā)光結(jié)果的相關(guān)參數(shù)見下表1。表1化學發(fā)光結(jié)果的相關(guān)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>圖1所示標準曲線的回歸曲線方程為Y=-0.3254χ+0.3479。從圖1可看到0.016-10ng/ml范圍內(nèi)，B/B0與4-NPA0Z濃度的對數(shù)值呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r=0.9949，用Bq-3SD外推法計算得本發(fā)明試劑盒的檢測靈敏度為0.005ppb(ng/ml)。2)結(jié)果再現(xiàn)性針對呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒的精密度測試，批間重復3次，所得不同濃度標準溶液的吸光值變異系數(shù)(CV%)圖2所示，圖2顯示本發(fā)明試劑盒的變異系數(shù)小于7.5%，具有很高的再現(xiàn)性。3)回收率計算取在Ig空白蝦肉中加入AOZ標樣，加入對硝基苯甲醛衍生后，提取液進行化學發(fā)光測定。根據(jù)OD值及BziBtl值從標準曲線查得AOZ含量后再乘以相應稀釋倍數(shù)即為樣品中呋喃唑酮代謝物AOZ的含量，然后計算回收率(見下表2)。表2蝦肉樣品的回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>其它種類樣品回收率見下表3。表3其它種類樣品回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4)結(jié)果特異性判斷試劑盒特異性的指標是交叉率，因此針對藥物進行特異性交叉反應測試，結(jié)果如下表4。表4目標檢測物4-NPA0Z與幾種結(jié)構(gòu)或作用類似藥物的交叉反應<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。權(quán)利要求一種呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，包括檢測板、試劑，所述試劑包括抗體、檢測目標物標準溶液，其特征在于，所述檢測目標物為呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的對硝基苯化衍生物4-NPAOZ。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述抗體是用呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮衍生化半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原制備出的單克隆抗體。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測板為化學發(fā)光板。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測板的各孔包被有包被抗原，該包被抗原為呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮衍生化半抗原與卵清白蛋白的偶聯(lián)物。5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的試劑盒，其特征在于，所述呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮衍生化半抗原是呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮與對醛基苯甲酸反應所得的衍生物4-CPA0Z。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述載體蛋白為牛血清白蛋白。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑還包括酶標二抗。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑還包括底物反應液，該底物反應液包含Tris-HCl緩沖液、魯米諾、對羥基苯丙烯酸和過氧化氫。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑還包括衍生劑，該衍生劑為對硝基苯甲醛。10.一種呋喃唑酮代謝物的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟前處理待測樣品；用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測樣品；分析檢測結(jié)果。全文摘要本發(fā)明公開一種呋喃唑酮代謝物化學發(fā)光檢測試劑盒，包括檢測板、試劑，所述試劑包括抗體、檢測目標物標準溶液，所述檢測目標物為呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的對硝基苯化衍生物4-NPAOZ。本發(fā)明呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，不僅可以實現(xiàn)快速、大批量檢測，而且具有很高的特異性和敏感性，檢測靈敏度達0.005ppb。文檔編號G01N21/76GK101806796SQ20101013277公開日2010年8月18日申請日期2010年3月25日優(yōu)先權(quán)日2010年3月25日發(fā)明者徐仙,李健,王權(quán),蔣蔚,趙新宇,陳永軍,陳沁,顧惠明申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所;中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局;上海大學