專利名稱：檢測呋喃唑酮代謝物的磁顆粒化學發(fā)光試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化學發(fā)光檢測試劑盒及其測試方法，特別是檢測蜂蜜、雞蛋、水產(chǎn)、組織等樣本中呋喃唑酮代謝物殘留量的磁顆粒競爭直接化學發(fā)光檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
呋喃唑酮(Frazolidone)是一種人工合成的廣譜抗菌藥，藥效穩(wěn)定，能抑制或殺滅多種革蘭陽性和陰性菌，并對某些原蟲、真菌有一定作用，由于高效廉價，呋喃唑酮在畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到了廣泛的應(yīng)用。但呋喃唑酮在動物源性食品中的殘留可以通過食物鏈傳遞給人類，長期攝入會引起各種疾病，根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)食品添加劑聯(lián)合專家委員會的報告，呋喃唑酮及其代謝產(chǎn)物有致癌性，且易產(chǎn)生抗藥菌株，容易引起畸胎。我國在2002年3月有農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《食品動物禁用的首要及其他化合物清單》中將呋喃唑酮列為禁用藥，呋喃唑酮進入動物體內(nèi)很快會代謝成為呋喃唑酮代謝物且呋喃唑酮代謝物對人體有著與呋喃唑酮同樣的危害。因此建立一種有效地呋喃唑酮代謝物的檢測方法成為獸藥殘留分析領(lǐng)域中十分緊要的任務(wù)。目前，呋喃唑酮代謝物殘留量的常規(guī)檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)Jf 相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。1、高效液相色譜法(HPLC)具有檢測精度高、假陽性率低的特點。HPLC法的主要缺點是儀器價格昂貴，操作比較繁瑣，耗時長，檢測費用昂貴，對檢測人員專業(yè)要求較高，樣本前處理較復雜。2、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MQ，樣品不需要衍生化處理，可對尿液、血液、肝臟、毛發(fā)和眼球樣品進行檢測。LC-MS/MS聯(lián)用，可進一步提高信噪比，所以可用于對陽性結(jié)果的確認手段。但是，無論LC-MS還是LC-MS/MS，都未能解決儀器造價昂貴，操作步驟繁瑣，樣本前處理復雜，對操作人員專業(yè)素養(yǎng)要求高等問題。3、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是20世紀70年代出現(xiàn)，用于微量物質(zhì)的檢測，最早應(yīng)用于傳染病、腫瘤標志物、激素水平等臨床檢測，90年代開始在我國食品安全檢測領(lǐng)域推廣應(yīng)用，目前依托ELISA技術(shù)的試劑盒、試紙條已經(jīng)成為食品安全快速檢測領(lǐng)域的主導產(chǎn)品， 同時也是我公司研發(fā)和銷售的主要產(chǎn)品類型。酶聯(lián)免疫檢測法基于抗原-抗體的特異性反應(yīng)，檢測靈敏度較高、特異性較好，技術(shù)操作簡易，容易掌握，確實解決了大量的以前難以解決的許多微量小分子物質(zhì)如抗生素、激素、農(nóng)藥殘留等的定性、定量分析工作，對食品安全快速檢測技術(shù)的發(fā)展起到了積極的促進作用。但是，ELISA方法存在許多自身無法克服的缺陷，主要表現(xiàn)在1)均相反應(yīng)檢測過程中為分離游離物與結(jié)合物，需要多步洗板過程，耗時費力， 難以提高操作的自動化程度。2)酶催化反應(yīng)借助酶催化底物顯色，測定反應(yīng)液吸光度值。反應(yīng)的時間與溫度對酶活力存在較大影響，試劑穩(wěn)定性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，采用該試劑盒進行呋喃唑酮代謝物的檢測時不僅具備較高的靈敏度，特異性，而且具有較高的反應(yīng)速度。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種呋喃唑酮代謝物的測試方法，該方法操作簡單，靈敏度高，特異性好。實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，其包含的主要試劑有發(fā)光標記物、熒光素標記物、標準品、質(zhì)控品、分離試劑。所述的分離試劑是包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。所述的順磁性納米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基團的微珠，用于包被羊抗FITC單克隆抗體，其內(nèi)芯是!^e3O4或Y -Fe2O3，使得微珠具有順磁性。所述的發(fā)光標記物是異魯米諾衍生物標記的呋喃唑酮代謝物半抗原。所述的異魯米諾衍生物是ABEI、AHEI或ABEN。所述的試劑盒還包括標準品，質(zhì)控品和濃縮洗液。所述的熒光素標記物是FITC標記的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體。本發(fā)明還提供一種利用試劑盒檢測呋喃唑酮代謝物的方法，包括下列步驟1)分別吸取20 μ 1-100 μ 1標準品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ 1發(fā)光標記物，再加20 μ 1-100 μ 1熒光素標記物，充分混勻后，37°C溫育15min ；2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150 μ 1，混勻后在37°C 溫育5min ；3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500 μ 1沖洗復合物沉淀；4)上述清洗步驟重復2-4次；5) 4)所得分離好的復合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物1和激發(fā)底物2，延遲 3-5s后檢測發(fā)出的相對光強度(RLU)，樣本中的含量與RLU成一定比例關(guān)系，可以通過RLU 集合標準曲線法計算呋喃唑酮代謝物的濃度。所述的發(fā)光底物的主要成分是NaOH和Η202。本發(fā)明中分析測試方法所用的分析儀是包括電源電路、自動注射泵1和2、測量室、發(fā)光室、光電倍增管計數(shù)器和輸出系統(tǒng)，同時還配置有計算機與中文界面的Windows控制軟件，可進行資料錄入、結(jié)果匯總、質(zhì)量控制、結(jié)果儲存和結(jié)果查詢等功能，可完成多種分析模式的編程，定量或定性報告結(jié)果，自動生成并儲存、更新功能，兩點自動修正標準曲線， 所采用的系統(tǒng)是CI-2008系統(tǒng)。本發(fā)明所述的分離試劑是包被羊抗FITC單克隆抗體，其表面基團的含量是 0. 1-0. 3eqm/g,其保存于 pH7. 1-7. 5，含有 3-5 % 酪蛋白，0. 1-0. 3 % 吐溫-20,0. 02-0. 04 % 硫柳汞防腐劑，0. 03-0. 05mol/LTRIS緩沖液中。所述的FITC是異硫氰酸熒光素。所述百分
含量為質(zhì)量百分含量。所述的發(fā)光標記物是異魯米諾衍生物ABEI、AHEI或ABEN標記的呋喃唑酮代謝物半抗原，其保存于ρΗ7· 2-7. 6，含0. 1-0. 3%吐溫-20，0. 02-0. 04% NaN3的TRIS緩沖液中。 所述百分含量是質(zhì)量百分含量。
所述的熒光素標記物是FITC標記的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體，其保存于 ρΗ7· 2-7. 6，含8-10%卵清蛋白，0. 02-0. 04%硫柳汞防腐劑，0. 1-0. 2mol/LPBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。呋喃唑酮代謝物標準品溶液(Ong/ml，0.01ng/ml，0. 03ng/ml,0. 09ng/ml,0. 27ng/ ml，0. 81ng/ml)，標準品稀釋液為 ρΗ7· 2-7. 6,0. 03-0. 05%硫柳汞防腐劑，0. 05-0. lmol/L TRIS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。呋喃唑酮代謝物質(zhì)控品溶液濃度分別為0. 02ng/ml，0. 5ng/ml，質(zhì)控品稀釋液 PH7. 2-7. 4,0. 03-0. 05%硫柳汞防腐劑，0. 05-0. lmol/LTRIS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量
百分含量。所述的濃縮洗液為PH7. 0-7. 4，0. 2-0. 4 %吐溫-20,0. 2-0. 4 %疊氮化鈉， 0. 1-0. 2mol/L PBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。本發(fā)明的有益效果如下1)本發(fā)明試劑盒可特異性檢測呋喃唑酮代謝物，對其他藥物無交叉。2)本發(fā)明試劑盒的靈敏度較高，對呋喃唑酮代謝物的檢測靈敏度可達0. Olng/ ml ο3)本發(fā)明試劑盒的檢測快捷，檢測時間低于20min。
具體實施例方式實施例1試劑盒具體組分的制備1、發(fā)光標記物的制備a)半抗原的合成將呋喃唑酮代謝物衍生化，得到呋喃唑酮衍生物半抗原。b)發(fā)光標記物制備取4. 5mmol/L ABEI，溶于4ml蒸餾水中，5. Ommol/L N-羥基琥珀酰亞胺溶于0. 5ml N，N-二甲基甲酰胺中，二者充分混勻后室溫反應(yīng)3-4h。取上述制備的呋喃唑酮代謝物半抗原15mg，用pH7. 4PBS調(diào)節(jié)體積到1. 5ml，然后加入上述活化的ABEI溶液，充分混勻后室溫反應(yīng)過夜，過G-25凝膠柱純化。2、熒光標記物制備a)免疫原的制備將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與牛血清白蛋白采用重氮化法進行偶聯(lián)得到免疫原。b)呋喃唑酮代謝物單克隆抗體的制備動物免疫以免疫原對Balb/c小鼠進行免疫，免疫劑量為150 μ g/只，使其產(chǎn)生抗血清。細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按9 1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，得到單克隆抗體的雜交瘤細胞株。細胞凍存和復蘇將雜交瘤細胞用凍存液制成IX IO9個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細胞5 X IO5個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，得到單克隆抗體。C)熒光標記物制備用0. 025mol/L, pH9. 0的碳酸鹽緩沖液將呋喃唑酮代謝物單克隆抗體稀釋成1 % 質(zhì)量百分比濃度；根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克免疫球蛋白加O.OlmgFITC，用分析天平準確稱取所需的FITC粉末。用同一緩沖液將FITC配成0. lmg/ml的溶液，按上述抗體溶液體積的3-5倍，混入FITC稀釋液；在4 。C避光條件下電磁攪拌、標記30-4 ；將標記溶液3000r/min，室溫離心20min，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再pH7. 4的PBS 緩沖液透析2-3天，期間至少更換透析液3次；取透析過夜的標記物，通過kphadexG-25或 G-50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光標記物進行鑒定，分裝，貯存于4°C冰箱中。3、分離試劑制備a)磁珠活化表面-COOH基團的磁珠(購于DYNAL，粒徑為2. 8 μ m)，其含量是0. 15eq/g;取 100 μ 1 磁珠，用 100 μ 1 25mmol/L, ρΗ5· 0,0. 05% Tween_20MES 溶液洗滌兩次，磁分離后移除上清；使用前，用4°C貯存的25mmol/L MES溶液分別配置50mmol/L的EDC、NHS溶液；分別加入50 μ 1新配置的EDC和NHS溶液到裝有磁珠的離心管中，渦旋混勻，室溫活化30min ； 離心管置于磁分離架上磁分離^iin,移除上清，加入100 μ l,25mmol/L,pH5. 0,MES清洗2_3 次后即可得表面羧基活化的磁珠。b)磁珠偶聯(lián)羊抗FITC單克隆抗體將50-100μ g羊抗FITC單克隆抗體溶解到60μ l，25mmol/L，pH5. OMES中，用所述MES溶液調(diào)節(jié)總體積至100 μ 1，輕柔混勻磁珠與羊抗FITC單克隆抗體；室溫條件下至少偶聯(lián)30min或4°C偶聯(lián)2h，該期間可利用渦旋儀使磁珠保持混勻狀態(tài)；離心管置于磁分離架上磁分離3-5min，移除上清；為了淬滅未反應(yīng)的-C00H，可加入100μ 1，ρΗ7. 4，TRIS反應(yīng) 15mir^l00y 1，ρΗ8. 0，含有 50mmol/L 乙醇胺的 PBS 封閉磁珠；用 100 μ 1,0. 1-0. 3% BSA, 0. 1% Tween-20的PBS或TRIS清洗封閉好的磁珠3_5次；最后將磁珠復溶于含0. 1-0. 5% BSA, 0. 01-0. 1% Tween-20,0. 02% NaN3 的 PBS 或 TRIS 緩沖液中，2_8°C保藏。實施例二試劑盒的組建組建檢測呋喃唑酮代謝物的磁顆粒化學發(fā)光檢測試劑盒，使其含有下列組分FITC標記的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體的熒光標記物ABEI標記的呋喃唑酮代謝物半抗原的發(fā)光標記物表面包被羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠的分離試劑呋喃唑酮代謝物標準品溶液(Ong/ml，0.01ng/ml，0. 03ng/ml,0. 09ng/ml,0. 27ng/ ml,0. 81ng/ml)，標準品稀釋液為pH7. 4，含有0. 05%硫柳汞防腐劑，0. lmol/LTRIS緩沖液。 所述百分含量為質(zhì)量百分含量。呋喃唑酮代謝物質(zhì)控品溶液濃度分別為0. 02ng/ml，0. 5ng/ml，質(zhì)控品稀釋為 pH7. 4，含有0.05%硫柳汞防腐劑，0. lmol/L TRIS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。濃縮洗液為pH7. 2,0. 4%吐溫-20，0. 3%疊氮化鈉，0. lmol/L PBS緩沖液。所述百
分含量為質(zhì)量百分含量。
實施例三實際樣品中呋喃唑酮代謝物的檢測1、樣本前處理(一 )肌肉、肝臟組織前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取1. 0士0. 05g均質(zhì)后的組織樣本(肝樣/肉樣)，加入的去離子水、0. 5ml IM鹽酸溶液和100 μ 1衍生化試劑，用振蕩器充分振蕩^iiin ；在37°C過夜孵育(大約16h)；分別加入5ml 0. IM磷酸氫二鉀溶液、0. ^illM氫氧化鈉溶液和5ml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s ；3000g以上，室溫Q0-25°C )離心IOmin ；取2. 5ml乙酸乙酯相至IOml干燥玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己烷(或正庚烷)，用渦旋儀渦動30s，再加入Iml復溶工作液，用渦旋儀渦動Imin充分混勻；3000g以上， 室溫Q0-25°C )離心IOmin ；除去上層有機相，取下層水相50 μ 1用于分析。樣本稀釋倍數(shù):2。( 二)水產(chǎn)前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取1. 0士0. 05g的均質(zhì)物(魚/蝦)至50ml聚苯乙烯離心管中，加入細1去離子水，0. 5ml IM鹽酸溶液和100 μ 1衍生化試劑，充分振蕩^iiin ；在37°C 過夜孵育(大約16h)；分別加入5ml 0. IM磷酸氫二鉀溶液，0. 4ml IM氫氧化鈉和5ml乙酸乙酯，劇烈振蕩30s ；3000g以上，室溫(20-250C )離心IOmin ；取出2. 5ml上層有機相至 IOml干凈玻璃試管中，50 60°C水浴氮氣流下吹干；用Iml正己烷(或正庚烷)溶解干燥物，用Iml復溶液工作液充分混合；(高脂肪樣本，可加大正己烷用量，用3ml正己烷溶解干燥物)在室溫下00-25°C )3000g以上離心IOmin ；除去上層有機相，取50 μ 1下層水相用于分析，樣本稀釋倍數(shù)2。(三)蜂蜜前處理方法稱取1.0士0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中；加入去離子水，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；加入o. 5ml IM鹽酸溶液和100 μ 1衍生化試劑，用振蕩器充分振蕩；在 37°C過夜孵育(大約16h)；分別加入5ml 0. IM磷酸氫二鉀溶液、0.細1 IM氫氧化鈉溶液和 5ml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s ；3000g以上，室溫O0_25°C )離心IOmin ；取2. 5ml 乙酸乙酯相至IOml干燥玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml正己烷(或正庚烷)，用渦旋儀渦動30s，再加入Iml復溶工作液，用渦旋儀渦動Imin充分混勻；3000g 以上，室溫O0-25°C)離心IOmin ；除去上層有機相，取下層水相50 μ 1用于分析，樣本稀釋倍數(shù)2。2、用試劑盒檢測與結(jié)果分析分別吸取20 μ 1-100 μ 1標準品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ 1發(fā)光標記物，再加 20μ 1-100μ 1熒光素標記物，充分混勻后，37°C溫育15min ；加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微球80-150 μ 1，混勻后在37°C溫育5min ；用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500 μ 1沖洗復合物沉淀；所得分離好的復合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物1和激發(fā)底物2，延遲3- 后檢測發(fā)出的相對光強度(RLU)，樣本中呋喃唑酮代謝物的含量與RLU成一定比例關(guān)系，可以通過RLU結(jié)合標準曲線法計算呋喃唑酮代謝物的濃度。激發(fā)底物1是NaOH，激發(fā)底物2是H202。底物裝載前，用蒸餾水清洗底物泵10_20 遍，排空管道內(nèi)殘存的水跡后，再將相應(yīng)的底物直接放入儀器內(nèi)，將泵管插入底物瓶中；用底物沖洗管道5次，并測定底物的RLU值，正常情況下，底物的RLU值不應(yīng)超過1200。若超過1200，需重新用蒸餾水對管道和底物泵進行更多次清洗，直至空白值降至合理范圍內(nèi)。若超過三天不做實驗，需卸載底物瓶，并蓋上蓋子，以防蒸發(fā)。隨后用蒸餾水清洗管道，并排空，以免強堿溶液腐蝕底物泵。本發(fā)明采用6個呋喃唑酮代謝物標準品(Ong/ml，0. 01ng/ml，0. 03ng/ml,0. 09ng/ ml，0. 27ng/ml，0. 81ng/ml)，進行曲線測繪。儀器根據(jù)所述方法檢測得到一條RLU值與呋喃唑酮代謝物濃度相關(guān)的定標曲線，此后測量中，每一個樣本中的呋喃唑酮代謝物濃度與標準曲線相比較得出樣本中的呋喃唑酮代謝物含量。實施例四試劑盒質(zhì)量的測定1、試劑盒的靈敏度試劑盒靈敏度的定義為測定20次零標準品，測定的平均值加上3倍標準差。該試劑盒的靈敏度為0. Olng/ml。2、樣本的準確度和精密度準確度是指測定值與真值間的符合程度，試劑盒準確度常用回收率表示。精密度又稱可重復性，常用變異系數(shù)表示。按照實施例三的樣本提取方法，以0. 03ng/g(ml)、0. 06ng/g(ml)兩個濃度的呋喃唑酮代謝物對雞肉、蝦、蜂蜜樣本進行添加回收，每種樣本每個濃度各4個平行，用三批試劑盒進行測定，計算樣本的平均回收率及精密度。實驗結(jié)果見下表。表1準確度和精密度測定ng/g (ml)
權(quán)利要求
1.一種檢測呋喃唑酮代謝物的磁顆?；瘜W發(fā)光試劑盒，包括的試劑有發(fā)光標記物、 熒光素標記物、標準品、質(zhì)控品、分離試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的分離試劑是包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的順磁性納米微珠是里面包覆有 Fe3O4或γ -Fe2O3，表面含有_0H、-COOH或-NH2活性基團的微珠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于所述的發(fā)光標記物是異魯米諾衍生物標記的呋喃唑酮代謝物半抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的異魯米諾發(fā)光標記物是ABEI、 AHEI 或 ABEN。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包括標準液、 質(zhì)控品和濃縮洗液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的試劑盒，其特征在于所述的熒光素標記物是FITC標記的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體。
8.一種利用權(quán)利要求1-7任一項所述的試劑盒檢測呋喃唑酮代謝物的方法，包括下列步驟1)分別吸取20μ 1-100 μ 1標準品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ 1發(fā)光標記物，再加 20 μ 1-100 μ 1熒光素標記物，充分混勻后，37°C溫育15min ；2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150μ1，混勻后在37°C溫育 5min ；3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500μ 1沖洗復合物沉淀；4)上述清洗步驟重復2-4次；5)4)所得分離好的復合物直接放入測量暗箱，加入激發(fā)底物1和激發(fā)底物2，延遲3- 后檢測發(fā)出的相對光強度(RLU)，樣本中呋喃唑酮代謝物的含量與RLU成一定比例關(guān)系，可以通過RLU集合標準曲線法計算呋喃唑酮代謝物的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測呋喃唑酮代謝物的磁顆粒化學發(fā)光試劑盒，包括的試劑有發(fā)光標記物、熒光素標記物、標準品、質(zhì)控品、分離試劑。發(fā)光標記物是異魯米諾發(fā)光標記物標記的呋喃唑酮代謝物半抗原，熒光標記物是指熒光素或其衍生物標記的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體，分離試劑是指包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。本發(fā)明還涉及一種采用所述的試劑盒檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物的方法，本方法對呋喃唑酮代謝物檢測具備較高的靈敏度、特異性和較快的檢測速度。
文檔編號G01N21/76GK102539413SQ20101059292
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者萬宇平, 何方洋, 余厚美, 馮才偉, 張麗杰, 徐恩寧, 汪善良, 郭旭 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司