專利名稱：一種在液相中原位制備脂雙分子層膜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于膜制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及固體表面支撐的脂雙分子層膜的制備方法，具 體涉及一種在液相中原位制備脂雙分子層膜的方法。
背景技術(shù)：
固體表面支撐的平面脂雙分子層膜(Supported Lipid Bilayer, SLB)，是模型生 物膜的主要形式之一。通過控制脂雙分子層的組成比例以及膜周圍的介質(zhì)性質(zhì)等影響因 素，人們可以借助原子力顯微鏡(AFM)定性及定量地研究生物膜對外部環(huán)境變化的響應(yīng)及 特定生理過程的內(nèi)在機制。常用的制備平面支持膜的方法有旋涂法、LB膜轉(zhuǎn)移法和囊泡融 合法三大類。其中，旋涂法是借助旋涂儀在云母表面直接旋涂脂類的有機溶液得到多層脂 類干膜；LB膜轉(zhuǎn)移法是借助LB膜儀，將液槽中的單分子層膜鍍覆到云母等固體表面得到單 層脂類干膜。該兩種方法方便快捷，但是制得的脂膜不具備生物流動性，即使長時間浸泡于 溶液中也無法得到具有二維流動性的分子層膜，因而應(yīng)用范圍有限。所述的囊泡融合法是 最近提出的一種制備脂雙分子層膜的方法，利用脂類囊泡能自發(fā)在云母等固體表面自發(fā)融 合調(diào)整的特點，促使脂類在固體表面形成規(guī)整的單層雙分子層脂膜，同時整個制備過程是 發(fā)生在液相環(huán)境中，因而能保證脂膜的二維流動性，能促進對模型膜的研究。但是目前提出 的各種囊泡融合法均存在如下一些缺點(1)囊泡在固體表面上自發(fā)融合成膜所需的時間 很長，約4 12小時；(2)得到效果較好雙分子層膜的幾率不夠高；(3)在沖洗表面多余囊 泡的過程中常常會造成膜的損壞；(4)在具體實施過程中，尤其是在轉(zhuǎn)移到AFM樣品臺上觀 測時，膜表面常應(yīng)接觸空氣而失去流動性。此外，目前各種制備方法均存在如下兩個共同的 問題在操作及轉(zhuǎn)移過程中難以保持所需的溫度，尤其對于多組分體系，可能導(dǎo)致不可消除 的分相及相變痕跡；不可能實現(xiàn)對膜表面的任何進一步的修飾或改性，從而不能用于原位 改性和相應(yīng)的動力學(xué)研究。因此，研究一種便捷制備均勻穩(wěn)定的固體表面支撐脂雙分子層膜的方法，并實現(xiàn) 用AFM實時監(jiān)測溶液環(huán)境中溫度及分子離子種類等對膜結(jié)構(gòu)的影響與作用，是一個能更大 促進生物膜研究并具有實際應(yīng)用價值的課題。與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有1.楊福愉主編.生物膜[M].北京科技出版社，2005.2. W. Binder, V. Barragan, F. Menger. Domains and Rafts in Lipid Membranes [J]. Angew. Chem. Int. Ed. 2003 (42) :5802-5827.3. S. Connel1,D. Smith. The atomic force microscope as a tool for studying phaseseparation in lipid membranes. Molecular Membrane Biology,2006 (23) :17-28.4. E. Sackmann. Supported membrane s : Sc i ent i fi c and practical applications[J], Science 1996(271) :43_48.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種固體表面支撐的脂雙分子層膜的新制備方法，具體涉 及一種在液相中原位制備脂雙分子層膜的方法。本發(fā)明通過在原子力顯微鏡(AFM)的可控溫樣品臺上原位制備脂雙分子層膜，借 助高溫條件加速囊泡融合，實現(xiàn)快速制樣。該方法同時還能靈活有效控制雙層膜所處的溫 度、周圍液體介質(zhì)的性質(zhì)等影響膜形貌的因素。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種在液相中原位制備脂雙分子層膜的方法，其 特征在于，采用原位高溫囊泡融合法，結(jié)合原子力顯微鏡液池針架設(shè)計進樣裝置，于高溫條 件下融合囊泡，在液相中原位制備脂雙分子層膜。本發(fā)明中，溫度可控、AFM樣品臺上、液池中、原位生成固體表面的支撐膜，并可通 過置換不同液相溶液引發(fā)膜表面的各種物理化學(xué)反應(yīng)，用原子力顯微鏡實時監(jiān)測這些過程 中膜表面形貌的變化。本發(fā)明中，在原子力顯微鏡的可控冷熱掃描器的樣品臺上，建立以云母為襯底的 樣品液池裝置，插入微型溫度計與自動液體進樣器。樣品液池中，溶液的種類及沖洗置換液 的流速、用量精確可控，以保證液相的性質(zhì)及濃度的可靠性，同時不損壞膜的結(jié)構(gòu)。為了獲得穩(wěn)定的平整的固體支撐膜，目前的囊泡融合方法大多是在常溫下先用大 量的囊泡溶液(1-10毫升)將固體表面完全過量潤濕，進行4-12小時不等的融合得到較平 整的支撐膜。鑒于脂類囊泡是由一種或多種脂類形成的，每種脂類都有其特定的相變溫度；當(dāng) 處于該溫度之上時，脂類處于相對柔軟的液相。本發(fā)明中，通過加溫囊泡溶液，使得所有脂 類處于高于相變點的溫度環(huán)境中，使得脂類囊泡相對柔軟，剛性較小。所述的柔軟的囊泡在 接觸到固體表面后易于融合。同時高溫環(huán)境下，溶液中的囊泡與固體表面碰撞機率增加。這 兩種效應(yīng)必然會加速固體表面脂雙分子支撐膜的形成。本發(fā)明中所述的進樣裝置(如圖1圖2所示)，包括，可控溫樣品臺0，液池針架1， 液池內(nèi)腔2，液體進樣器3，溫度計4，軟管5和進樣器通道6-8。該裝置置于原子力顯微鏡的可控溫樣品臺0上，其中商用原子力顯微鏡的液池針 架1底部用于安裝原子力顯微鏡的探針，側(cè)面有三個連接口，方便外部溶液進入液池內(nèi)腔 2，或連接外部器件探測液池內(nèi)腔2中的溫度，此外，液池內(nèi)腔2周圍有0型圈保護，能減少 水分揮發(fā)和流動。本發(fā)明所述的進樣裝置，其中，液池針架1的右側(cè)連接口連接液體進樣器3，中間 連接口連接溫度計4，左側(cè)連接口連接普通軟管5作為廢液通道。液體進樣器有三個進樣器 通道6-8連接不同種類的液體或溶液，常用的液體或溶液有Milli-Q水、各種緩沖溶液、生 物小分子水溶液以及大分子水溶液等，并可以通過進樣器的閥門控制溶液的選擇、進樣速 度以及進樣量。進樣裝置、溫度計以及軟管都可自由裝卸。具體而言，本發(fā)明提供了一種在液相中原位制備脂雙分子層膜的方法，其特征在于， 采用上述裝置在高溫條件下制備雙分子層脂膜供原子力顯微鏡觀測，包括以下具體步驟(1)原位注入囊泡溶液在連接進樣裝置前，將有光滑表面的云母或蓋玻片等固 體置于原子力顯微鏡的可控溫樣品臺上，將液池針架置于固體表面上，在液池內(nèi)腔中注入 60-100 μ 1的脂類囊泡溶液；其中脂類囊泡溶液的脂濃度為0. 5-2. Omg/ml，囊泡尺寸小于300nmo(2)安裝進樣裝置將進樣裝置與液池針架連接，關(guān)閉進樣器總閥，進樣器的三個 通道6-8中連接裝有20-100ml實驗所需溶液的注射器；同時安裝好溫度計4和軟管5。(3)高溫融合打開樣品臺溫控電源，設(shè)定溫度，其中溫度范圍為30-60°C，具體溫 度設(shè)定取決于體系中所用脂類。以溫度計4讀數(shù)達到設(shè)定溫度時，開始計時，持續(xù)加熱囊泡 溶液30-60分鐘，在云母或蓋玻片表面，囊泡彼此融合形成雙分子膜。(4)原位去除多余囊泡，獲得平整的雙分子膜。關(guān)閉樣品臺溫控電源，冷卻至室溫。 打開進樣器總閥和溶液通道，10_20ml的溶液通過液池內(nèi)腔，帶走內(nèi)腔未融合的囊泡，廢液 由軟管導(dǎo)出液池內(nèi)腔。云母或蓋玻片表面形成平整的雙分子層膜。本發(fā)明的優(yōu)點是采用本發(fā)明公開的制備方法，與常用的融合方法相比，融合時間 短，低于2小時；在融合和除去多余囊泡的過程中徹底排除了空氣，保證了膜的平整性和流 動性；并且該方法具有更強的靈活性和應(yīng)用前景，在形成雙分子層膜后，還可通過進樣器的 其它通道改變液池內(nèi)腔的溶液種類和溶質(zhì)質(zhì)量，進一步觀測各種分子對脂雙分子層膜的影 響。本方法還可用于制備及改性其它兩親性分子膜，如高分子膜等，并同樣可以控制 膜所處介質(zhì)性質(zhì)。本方法改進了制備固體表面支撐膜常用的旋涂法、囊泡融合法和LB膜轉(zhuǎn)移法，不 僅使得膜的形成過程及膜的表面形貌處于原子力顯微鏡的實時監(jiān)測之下，還可通過微量進 樣器及循環(huán)泵，原位改變膜所處的液相環(huán)境，從而實現(xiàn)控制膜表面的化學(xué)及物理吸附、膜表 面的化學(xué)反應(yīng)及膜表面的晶體生長等等。本發(fā)明方法為液相環(huán)境下研究材料表面的各種物 理化學(xué)過程提供了一條可行可靠的途徑，具有非常重要的研究和應(yīng)用價值。下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為本發(fā)明中使用到的裝置側(cè)視圖，其中，0為可控溫樣品臺；1為液池針架；2 為液池內(nèi)腔；3為液體進樣器。圖2為本發(fā)明中使用到的裝置俯視圖，其中，1為液池針架；2為液池內(nèi)腔；3為液 體進樣器；4為溫度計，測量2中溫度；5為軟管；6-8 為進樣器通道，可連接不同液體。圖3為實施例1制得的三組分脂類(DOPC/ESM/Chol)膜的AFM形貌圖，其中相貌 尺寸為8μπιΧ8μπι ；圖的高度標(biāo)尺為20nm。圖4為實施例2制得的三組分脂類(DOPC/ESM/Chol)膜的AFM形貌圖，其中相貌 尺寸為8 μ mX8 μ m;圖的高度標(biāo)尺為10nm。圖5為實施例3制得的三組分脂類(DOPC/ESM/Chol)雙分子層膜的AFM形貌圖， 其中相貌尺寸為8 μ mX8 μ m;圖的高度標(biāo)尺為10nm。圖6為實施例4制得的三組分脂類(DOPC/ESM/Chol)雙分子層膜的AFM形貌圖， 其中相貌尺寸為IOymXlOym;圖的高度標(biāo)尺為lOnm。圖7為實施例5制得的兩組分脂類(P0PC/BSM/)雙分子層膜的AFM形貌圖，其中 相貌尺寸為10 μ mX 10 μ m ；圖的高度標(biāo)尺為10nm。圖8為實施例6制得的兩組分脂類(D0PC/GM1)雙分子層膜的AFM形貌圖，其中相貌尺寸為10 μ mX 10 μ m ；圖的高度標(biāo)尺為10nm。圖9為實施例7制得的雙分子層膜的AFM形貌圖。其中相貌尺寸為10 μ mX 10 μ m ； 圖的高度標(biāo)尺為lOnm。
具體實施例方式實施例1旋涂法制備三組分脂類(DOPC/ESM/Chol)的固體表面支撐脂膜。二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、蛋鞘脂(ESM)以及膽固醇(Chol)三種磷脂的氯仿溶 液按2 2 1的摩爾比混合得到脂類原液，其中脂類原液的濃度為1. Omg (脂類)/ml (氯 仿)溶液。用旋涂儀在云母表面以原液鍍膜，室溫置于AFM下觀察，得圖3。旋涂儀的參數(shù) 為轉(zhuǎn)速IOOOrpm，旋涂時間20s，在AFM掃描之前，樣品保持在45°C的真空烘箱中。從圖3 中可以看出，通過旋涂法得到的支持膜表面不平整，膜內(nèi)部分為數(shù)層，不利于觀測分析膜的 形貌和內(nèi)部分相。實施例2用水浸泡旋涂法制得的三組分脂類(DOPC/ESM/Chol)的固體表面支撐脂膜。將上述實施例1中制得到的脂膜浸泡在Milli-Q水中12小時。用Milli-Q水沖 洗后，置于AFM液池中在室溫下掃描得圖4。可以看出，干膜即使在水中充分溶脹后，也無法 得到平整的表面。實施例3普通囊泡融合法制備三組分脂類(DOPC/ESM/Chol)的固體表面支撐脂膜。取2ml實施例1中的原液，將其制備成1. Omg (脂類)/ml (Milli-Q水)的囊泡懸 浮溶液。其中囊泡的平均尺寸小于200nm。取Iml該囊泡懸浮液置于新鮮剝離的云母表面， 在30°C的烘箱中保溫4小時，然后小心地用Milli-Q水，沖去剩余的溶液，并反復(fù)沖洗10 次，期間盡量保持表面處于水相中。將沖洗后得到的支撐膜置于AFM液池中成像，得到圖5。 可以看出，相對實施例1，2中得到的支撐膜，用普通囊泡融合法制得的膜平整，相區(qū)邊界明 顯。但是，該方法花費的融合時間長，同時有序相區(qū)(圖中明亮色塊)形狀不規(guī)整。實施例4用本方法制備三組分脂類(DOPC/ESM/Chol)的固體表面支撐脂膜。取60 μ 1實施例3中制得的囊泡懸浮溶液注入液池內(nèi)腔，裝上進樣器，其中進樣器 第一通道連接50ml Milli-Q水。將樣品臺溫度設(shè)為為45°C，保溫30分鐘后用Milli-Q水 沖洗，然后降溫至30°C，靜置10分鐘。用原子力顯微鏡掃描得到圖6所示的形貌圖。可以 看出，用本發(fā)明制得的支撐膜表面平整，相區(qū)清晰可辯。同時，在圖6中的有序相區(qū)都呈現(xiàn) 圓形和橢圓形，符合DOPC/ESM/Chol三組分在膜內(nèi)分相后的有序相區(qū)的形貌特征。實施例5用本方法制備兩組分脂類(P0PC/BSM)的固體表面支撐脂膜取油酰磷脂酰膽堿(POPC)和腦鞘脂(BSM)囊泡PBS溶液100 μ 1注入液池內(nèi)腔， 裝上進樣器，其中進樣器一通道連接100ml PBS緩沖液，POPC和BSM的摩爾比為1 1，囊 泡水溶液的濃度為1. Omg(脂類)/ml (PBS)溶液，囊泡尺寸小于150nm。將樣品臺溫度設(shè)定 為50°C，保溫40分鐘后用PBS緩沖液，然后降溫至室溫(25-28°C )，靜置20分鐘。用原子 力顯微鏡掃描得到圖7所示的形貌圖。可以看出，用本發(fā)明制得的兩組分支撐膜同樣表面 平整，相區(qū)邊界明顯，相區(qū)邊界不規(guī)則，有序相區(qū)彼此相連且尺寸較大，符合P0PC/BSM兩組 分在膜內(nèi)分相后的形貌特征。
實施例6用本方法制備兩組分脂類(D0PC/GM1)的固體表面支撐脂膜取DOPC和神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)囊泡水溶液80 μ 1注入液池內(nèi)腔，裝上進樣器，其中 進樣器第一通道連接IOOmL Milli-Q水，DOPC和GMl的摩爾比為4 1，囊泡水溶液的濃度 為？^！！^丨脂類丨/！^⑶^^水丨溶液，囊泡尺寸小于〗。。!!!!!。將樣品臺溫度設(shè)為為55 °C， 保溫35分鐘后用Milli-Q水沖洗，然后降溫至30°C，靜置15分鐘。用原子力顯微鏡掃描得 到圖8所示的形貌圖?？梢钥闯觯帽景l(fā)明制得的兩組分支撐膜同樣表面較平整，相區(qū)邊界 明顯。相區(qū)邊界不規(guī)則，相區(qū)內(nèi)部表面平整度低于周圍相區(qū)，但相區(qū)高度高(體現(xiàn)為相區(qū)顏 色更明亮)，符合D0PC/GM1兩組分在膜內(nèi)分相后的形貌特征。實施例7液相中GMl在三組分類脂(DOPC/ESM/Chol)支撐膜上的插入與分布在上述實施例5中的制得的支撐膜的基礎(chǔ)上，在進樣器的第三通道連接濃度為 0. 1 μ g/ml的GMl水溶液10ml，打開通道閥和總閥，注入GMl水溶液，使得液池內(nèi)腔中的 Milli-Q水被置換出內(nèi)腔，關(guān)閉GMl水溶液通道閥和總閥。靜置，讓注入的GMl水溶液與三 組分類脂(DOPC/ESM/Chol)支撐膜作用。30分鐘后，打開Milli-Q水的通道閥和總閥，向內(nèi) 腔注入Milli-Q水，置換出在內(nèi)腔中的GMl水溶液。然后再次掃描，AFM形貌圖見圖9。本實施例旨在說明本發(fā)明的靈活性和更廣泛的應(yīng)用前景(1)由于整個操作不涉及到AFM儀器和針尖的位移，因此圖7和圖5對應(yīng)的是同一 區(qū)域，即通過本發(fā)明中的進樣裝置，本發(fā)明實現(xiàn)了原位觀測，這對于膜形貌的動力學(xué)研究具 有十分重要的意義。而普通囊泡融合法是無法實現(xiàn)在原位觀察膜的變化及其過程的。(2)圖7中多處有亮色突起(如箭頭所示)，表明GMl分子進入了支持膜。這是由 于GMl分子較大，一旦插入支持膜后，將高于周圍的基膜表面。進一步對比，可發(fā)現(xiàn)這些突 起主要集中在相區(qū)邊界，表明了 GMl分子在多組分膜內(nèi)的分布情況。即通過本發(fā)明能實現(xiàn) 原位改變支持膜所處的物理環(huán)境，從而改變了支持膜的形貌；在不需重新制樣的前提下，增 加了支持膜的組分，并觀測到新組分所在區(qū)域。普通囊泡融合法則要求從制備囊泡溶液就 重新制樣，花費大量時間。
權(quán)利要求
1.一種在液相中原位制備脂雙分子層膜的方法，其特征在于，采用原位高溫囊泡融合 法，結(jié)合原子力顯微鏡液池針架設(shè)計進樣裝置，于高溫條件下融合囊泡，在液相中原位制備 脂雙分子層膜。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的進樣裝置包括可控溫樣品臺(0)，液 池針架(1)，液池內(nèi)腔0)，液體進樣器(3)，溫度計，軟管( 和進樣器通道(6-8)，其 中，所述的進樣裝置置于可控溫樣品臺(0)上，液池針架(1)底部安裝原子力顯微鏡的探 針，側(cè)面有三個連接口，其右側(cè)連接口連接液體進樣器(3)，中間連接口連接溫度計，左 側(cè)連接口連接普通軟管(5)，液體進樣器C3)設(shè)有進樣器通道(6-8)連接不同種類的液體或 溶液。
3.按權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的液池內(nèi)腔( 周圍有0型圈。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟1)原位注入囊泡溶液在連接進樣裝置前，將有光滑表面的云母或蓋玻片固體置于原 子力顯微鏡的可控溫樣品臺上，將液池針架(1)置于固體表面，在液池內(nèi)腔( 中注入脂類 囊泡溶液；2)安裝進樣裝置將進樣裝置與液池針架(1)連接，關(guān)閉進樣器總閥，進樣器的通道 (6-8)中連接裝有所需溶液的注射器，同時安裝溫度計(4)和軟管(5)；3)高溫融合打開樣品臺溫控電源，根據(jù)體系中所用脂類設(shè)定溫度，以溫度計⑷讀數(shù) 達到設(shè)定溫度時，開始計時，持續(xù)加熱囊泡溶液，在云母或蓋玻片表面，囊泡彼此融合形成 雙分子膜；4)原位去除多余囊泡，獲得平整的雙分子膜。
5.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步驟1)中，在液池內(nèi)腔O)中注 入的脂類囊泡溶液為60-100 μ 1，脂類囊泡溶液的脂濃度為0. 5-2. Omg/ml，囊泡尺寸小于 300nmo
6.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步驟2)中，連接裝有20-100ml所需 溶液的注射器。
7.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步驟幻中，所述設(shè)定的溫度范圍為 30-60oC。
8.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步驟；3)中，所述持續(xù)加熱囊泡溶液的 時間為30-60分鐘。
9.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步驟4)中，通過關(guān)閉樣品臺溫控電 源，冷卻至室溫，打開進樣器總閥和溶液通道，10-20ml的溶液通過液池內(nèi)腔0)，帶走內(nèi)腔 未融合的囊泡，廢液由軟管(5)導(dǎo)出液池內(nèi)腔O)。
全文摘要
本發(fā)明屬膜制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種在液相中原位制備脂雙分子層膜的方法，形成的雙分子層膜可供原子力顯微鏡觀測研究。該方法改進了現(xiàn)有技術(shù)制備方法，使得膜的形成過程及膜的表面形貌處于原子力顯微鏡的實時監(jiān)測之下，還可通過微量進樣器及循環(huán)泵，原位改變膜所處的液相環(huán)境，實現(xiàn)控制膜表面的化學(xué)及物理吸附、膜表面的化學(xué)反應(yīng)及膜表面的晶體生長等，本方法還可用于制備及改性其它兩親性分子膜，控制膜所處介質(zhì)性質(zhì)。本方法為從分子分辨的尺度原位實時地研究生理環(huán)境下生物膜表面及液相環(huán)境下材料表面的各種物理化學(xué)過程提供了一條可行可靠的途徑，具有非常重要的研究和應(yīng)用價值。
文檔編號G01N1/44GK102072971SQ20091019923
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日
發(fā)明者李莉, 楊玉良, 邱楓, 鮑稔 申請人:復(fù)旦大學(xué)