專利名稱：一種用于檢測(cè)阿特拉津的金納米通道膜及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及材料領(lǐng)域和傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種基于納米通道膜材料上
的分子水平膜檢測(cè)技術(shù)。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米技術(shù)與當(dāng)前很多技術(shù)相互碰撞與結(jié)合，產(chǎn) 生了許多新興的課題與方向。納米通道膜技術(shù)將膜檢測(cè)的低能耗、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、無(wú) 污染并可回收再利用的優(yōu)點(diǎn)與納米技術(shù)的納米尺度操控相結(jié)合，能夠?qū)δ繕?biāo)物質(zhì)進(jìn)行分子 水平上的檢測(cè)。 在農(nóng)業(yè)的發(fā)展中，農(nóng)藥和除草劑發(fā)揮著重要的作用，據(jù)估計(jì)，全世界農(nóng)業(yè)由于病、 蟲(chóng)、草害每年糧食損失占產(chǎn)量的一半左右，使用農(nóng)藥和除草劑大概可以?shī)Z回其中的30%，而 農(nóng)藥和除草劑所帶來(lái)的收益大體為其費(fèi)用的4倍。但是，由于長(zhǎng)期使用農(nóng)藥和除草劑，給環(huán) 境帶來(lái)嚴(yán)重污染。 阿特拉津(Atrazine，縮寫為八11 ，又名莠去津，2-氯-4-乙胺-6-異丙胺-1，3， 5-三嗪，C8H14C1N5)屬均三氮苯類化合物，為三嗪類除草劑，水溶性適中(33iig/L，22°C )， 對(duì)大部分一年生雙子葉雜草具有很好的防治作用，是近50年來(lái)世界上最為廣泛使用的除 草劑。其主要問(wèn)題是具有淋溶性，易被雨水、灌溉水淋溶至較深土層，或是隨地表徑流進(jìn)入 河流、湖泊和水庫(kù)，對(duì)地下水和地表水造成污染，大量污染物將由顆粒物吸附而蓄存在沉積 物中，在適當(dāng)條件下重新釋放而成為二次污染源。它在土壤中殘留期長(zhǎng)，易對(duì)后茬敏感作物 如小麥、大豆、水稻等產(chǎn)生藥害。ATR生態(tài)毒性表明，O. 1 ii g/L的ATR水溶液就能導(dǎo)致青蛙 產(chǎn)生雌雄同體現(xiàn)象；濃度為25y g/L的ATR水中觀察，雄性青蛙體內(nèi)睪丸激素的濃度顯著下 降。長(zhǎng)期接觸ATR會(huì)導(dǎo)乳腺癌和卵巢癌的發(fā)生，ATR已被美國(guó)環(huán)保局列為致癌物。ATR會(huì)影 響人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)以及動(dòng)物的生殖繁衍，美國(guó)環(huán)保局的初步評(píng)價(jià)認(rèn)為，ATR屬于環(huán)境內(nèi)分 泌干擾物。德、法和比利時(shí)等國(guó)家已禁止使用ATR，美國(guó)限定一級(jí)飲用水中最大標(biāo)準(zhǔn)含量為 3. 0 ii g/L。加拿大飲用水中規(guī)定ATR及其代謝產(chǎn)物的最大濃度為5. 0 y g/L。我國(guó)ATR最 大殘留標(biāo)準(zhǔn)(GB16323-1996)中規(guī)定其在玉米、甘蔗中的含量《0. 05mg/kg，在地表水I、II、 III類水域中的特定項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)值《3. 0 ii g/L(GHZB 1-999)。但地下水中ATR殘留標(biāo)準(zhǔn)及地 表水/地下水中降解物殘留標(biāo)準(zhǔn)至今仍未制定。 由于ATR長(zhǎng)期使用殘留，及其它的有毒代謝物、降解物、轉(zhuǎn)化物的存在對(duì)人體的危 害是難以估量的。國(guó)際上對(duì)農(nóng)藥最大殘留量要求越來(lái)越嚴(yán)格，這些都給農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù) 提出了更高的要求。 為了控制和遏制這種危險(xiǎn)污染物，迫切需要一種快速檢測(cè)這種有機(jī)毒素的方法。 一些既定的分析法，如薄層色譜法，氣相色譜，高效液相色譜法，氣質(zhì)聯(lián)用，被廣泛用于在痕 量水平上檢測(cè)和定量分析農(nóng)藥。然而，這些方法檢測(cè)農(nóng)藥復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，儀器不易攜帶，需要試 樣量較多，在連續(xù)監(jiān)測(cè)及現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定中受到限制。因此，發(fā)展高靈敏、對(duì)ATR及其代謝物、降解 物、轉(zhuǎn)化物有特異性響應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)對(duì)國(guó)民健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展無(wú)疑具有重要意義。
本專利嘗試基于金納米通道膜技術(shù)，實(shí)現(xiàn)阿特拉津的檢測(cè)，為分析檢測(cè)三嗪類除草劑提出了一個(gè)新的途徑，也為檢測(cè)其他類除草劑提供一個(gè)新的思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種用于檢測(cè)阿特拉津的金納米通道膜。 本方法的目的在于，將上述金納米通道膜技術(shù)用于分離檢測(cè)阿特拉津，可以更好的應(yīng)用于農(nóng)藥的分析檢測(cè)中。 技術(shù)方案為， 一種用于檢測(cè)阿特拉津的氯修飾的金納米通道膜，其特征在于，制備方法如下 (a)以多孔聚碳酸酯膜為基膜，采用化學(xué)沉積法在孔徑為80nm 150nm的多孔聚碳酸酯膜(PC膜)上沉積金將PC膜洗滌后在O. 01M 0. 05M SnCl2溶液浸泡30 120min，使Sn2+均勻地吸附在基膜及膜孔表面；取出清洗后在N2氣保護(hù)下將膜在0. 01M 0. 04MAg(NH3)2+溶液中浸沒(méi)5 30min，洗滌后浸入pH = 9. 5 10.5的6 X 10—3M 9 X 10—3M亞硫酸金鈉沉積溶液中，在0 l(TC下化學(xué)鍍金4 10h ;洗滌并用HN03除去未反應(yīng)的Ag，即得到金納米通道陣列膜； (b)氯離子的修飾將所制得的金納米通道膜活化清洗后在含0. 005M 0. 02M
C1—的溶液中浸泡10 16h，通過(guò)金-氯鍵使氯離子共價(jià)鍵單層自組裝在金納米通道膜上。
步驟(b)中，利用體積濃度為60 % 80 %的硫酸雙氧水混合液浸泡5min對(duì)金納米通道膜進(jìn)行活化。 上述方法所制備的氯修飾的金納米通道膜，孔徑為20 50nm。 —種檢測(cè)阿特拉津的方法，將上述所制備的氯修飾的金納米通道膜置于U形池的
進(jìn)樣池和透過(guò)池之間，工作電極插入進(jìn)樣池，參比電極插入透過(guò)池；在進(jìn)樣池中加入含阿特
拉津抗體的緩沖液，在透過(guò)池中加入不含有阿特拉津抗體的緩沖液，維持兩池中的液面平
行，在參比電極和工作電極兩端施加電壓( 一般為0. 8 1. 5V)，測(cè)定基底電流；隨后向進(jìn)
樣池中加入含有待測(cè)樣品的緩沖液，通過(guò)電化學(xué)工作站進(jìn)行電流信號(hào)測(cè)試；發(fā)生電流突降
則說(shuō)明待測(cè)樣品中含有阿特拉津。所述的緩沖液為pH為7 8、濃度為0. 005M 0. 02M的PBS溶液。 在一定電場(chǎng)下，電解質(zhì)離子通過(guò)納米通道時(shí)，產(chǎn)生穩(wěn)定的電流。阿特拉津加入后，
與進(jìn)樣池中的抗體形成復(fù)合物，從而對(duì)電解質(zhì)的流動(dòng)產(chǎn)生一定的阻礙作用，引起相應(yīng)的電
流降。而其他除草劑，如百草枯、敵草隆等，不與抗體結(jié)合，不會(huì)形成比抗體更大的分子，無(wú)
電流降的產(chǎn)生。 為提高靈敏度，可將待測(cè)樣品與BSA鍵合，使阿特拉津與BSA鍵合制成阿特拉津免疫原；制備方法為如下步驟 將阿特拉津與3-巰基丙酸在堿性條件下加熱回流，除去溶劑后酸化得到的沉淀為阿特拉津-巰基丙酸衍生物；再用雙環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺將阿特拉津_巰基丙酸衍生物連接到牛血清白蛋白，得到阿特拉津免疫原。 當(dāng)阿特拉津免疫原加入后，與進(jìn)樣池中的抗體形成MPAD_BSA\抗體復(fù)合體，它較單獨(dú)的抗體在體積上要大，從而對(duì)電解質(zhì)的流動(dòng)產(chǎn)生一定的阻礙作用，引起相應(yīng)的電流降。而其他除草劑，如百草枯、敵草隆等，不與抗體結(jié)合，不會(huì)形成比抗體更大的分子，無(wú)電流降的產(chǎn)生。這樣可以檢測(cè)阿特拉津含量較低的樣品。 本發(fā)明的方法檢測(cè)阿特拉津，檢測(cè)效率高，特異性強(qiáng)，可測(cè)定濃度下限為 1.7X10—"M的阿特拉津，具有較好的應(yīng)用前景。


圖1為阿特拉津免疫原制備路線圖 圖2為檢測(cè)裝置簡(jiǎn)圖，修飾了氯離子的Au納米通道膜置于U形池中間，阿特拉津 免疫原或阿特拉津與抗體結(jié)合后，形成更大體積的大分子，對(duì)電解質(zhì)的流動(dòng)產(chǎn)生阻礙作用， 引起電流的降低。其他除草劑如百草枯、敵草隆不與抗體結(jié)合，不會(huì)形成比抗體更大的分 子，無(wú)電流降的產(chǎn)生。
圖3為實(shí)施例1產(chǎn)品場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡圖；(a)為聚碳酸酯膜化學(xué)鍍金7h后 的場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡圖；(b)為將膜用二氯甲烷溶解后的透射電子顯微鏡圖。
圖4為含有阿特拉津抗體的進(jìn)樣池中逐次加入阿特拉津免疫原后測(cè)得電流_時(shí)間 圖。插圖為阿特拉津免疫原加入前電流響應(yīng)，加入前電流可達(dá)到穩(wěn)定態(tài)，免疫原加入后引起 明顯的電流降低。 圖5為實(shí)施例4中阿特拉津免疫原(A)、阿特拉津(B)、百草枯(C)、敵草隆(D)分 別加入時(shí)電流-時(shí)間的比較。加入阿特拉津免疫原及阿特拉津時(shí)電流即出現(xiàn)突然降低，并 且，加入阿特拉津免疫原時(shí)產(chǎn)生比加入單獨(dú)的阿特拉津大的電流降；而加入的百草枯、敵草 隆不與阿特拉津抗體結(jié)合，無(wú)更大體積分子形成，故不會(huì)出現(xiàn)電流的突降。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)該指出的是，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā) 明而不限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明描述的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的 范圍。 下列實(shí)例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如操作手冊(cè)，或按照
制造廠商所建議的條件。 實(shí)施例1金納米通道膜的制備 以多孔聚碳酸酯膜為基膜，采用化學(xué)沉積法在100nm的多孔聚碳酸酯(PC)膜上沉 積金。將PC膜浸入無(wú)水甲醇中，超聲震蕩5min，洗去基膜上吸附的雜質(zhì)；然后將清洗后的 PC膜浸入0. 025M SnCl2溶液45min，不斷輕微搖動(dòng)溶液使Sn2+均勻地吸附在基膜及膜孔表 面，取出用甲醇漂洗2次；在^氣保護(hù)下將膜浸入0. 029MAg(NH》/溶液中15min，取出用甲 醇洗3次，然后再水洗3次，浸入濃度為7. 9 X 10—3M亞硫酸金鈉沉積溶液(pH = 10. 00)中。 在fC下化學(xué)鍍金7h后取出用水洗4次，再用25% HN03浸12h除去未反應(yīng)的Ag，即得到Au 納米通道陣列膜。 圖3(a)為化學(xué)鍍金7h后的場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡圖，可見(jiàn)其內(nèi)徑約為35nm;圖 3(b)為將膜Au納米通道陣列用二氯甲烷溶解后的透射電子顯微鏡圖，表明化學(xué)鍍金7h后， 可以得到形狀良好的金納米通道。
實(shí)施例2氯離子的修飾
將所制得的Au納米通道膜利用piranha溶液(Vh2o2:Vh2so4 - 3:7 )浸泡5min活化，取出用水沖洗三次，浸入0. 01M的KC1水溶液中12h，氯離子即通過(guò)金_氯鍵自組裝在Au納米通道膜上，修飾完畢后將膜取出用甲醇清洗三次，N2吹干，得到氯修飾的金納米通道。
實(shí)施例3阿特拉津免疫原的制備 首先制備阿特拉津-巰基丙酸衍生物(MPAD)，再進(jìn)一步制備阿特拉津免疫原，途徑見(jiàn)圖1。 將含有5. OmM阿特拉津的50ml乙醇在攪拌條件下慢慢加入含0. 48M 3_巰基丙酸和10. 8mM KOH的10mL乙醇中，ll(TC下加熱回流6h。溶劑進(jìn)行減壓蒸發(fā)，剩余物加入25mL含5 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaHC03的水溶液，用10mLCHCl3清洗三次，然后用6M鹽酸酸化至pH為2，以促使得到的衍生物立即沉淀。 傾出上清液，將經(jīng)真空干燥后的沉淀用lmL乙醇再次溶解，進(jìn)一步提純，然后37°C下真空干燥，得到MPAD晶體。將50 ii molMPAD、 125 y mol雙環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 、 125 y molN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和lmL二甲基亞砜(DMF)混合，室溫下反應(yīng)4h，然后10000r/pm離心5min。取150 ii L上清液加入到850 y L含1. 47X 10—4M牛血清白蛋白(BSA)硼酸液(pH=9. 00)中，4。C下反應(yīng)22h。然后將上述混合物裝入透析袋內(nèi)用PBS(pH = 7. 40)透析。
實(shí)施例4電流信號(hào)的測(cè)定 采用U形池作為阿特拉津分離測(cè)定的裝置，U形池分進(jìn)樣池、透過(guò)池兩部分，將Au納米通道膜置于進(jìn)樣池和透過(guò)池中間，膜的有效透過(guò)面積為1. 96cm、進(jìn)樣池和透過(guò)池容積分別為6mL。以鉑絲電極作為工作電極和參比電極，工作電極插入進(jìn)樣池，參比電極插入透過(guò)池，工作電極和參比電極連接到電化學(xué)工作站，并通過(guò)電化學(xué)工作站進(jìn)行電流信號(hào)測(cè)試。如圖2所示。 在U形連通池的進(jìn)樣池中加入0. OIM、 pH為7. 40的PBS溶液4. OmL、1. OmL含阿特拉津抗體的PBS(O. 585mg/L)，同時(shí)透過(guò)池中加入PBS溶液5mL，維持兩池中的液面平行，在參比電極和工作電極兩端施加l.OV電壓，室溫下測(cè)定基底電流。隨后加入阿特拉津免疫原，每60s向進(jìn)樣池中加入2. 5X 10—8mol阿特拉津免疫原(以阿特拉津含量計(jì))，測(cè)定電流_時(shí)間曲線；然后分別用除草劑阿特拉津、百草枯、敵草隆依次代替阿特拉津免疫原進(jìn)行試驗(yàn)，每次都加入量也是2. 5X 10—8mol，測(cè)定相應(yīng)的電流響應(yīng)情況。結(jié)果如圖4、5所示。
在一定電場(chǎng)下，電解質(zhì)離子通過(guò)納米通道時(shí)，產(chǎn)生穩(wěn)定的電流。逐步加入阿特拉津免疫原及阿特拉津時(shí)電流即出現(xiàn)突然降低，并且加入阿特拉津免疫原時(shí)產(chǎn)生比加入單獨(dú)的阿特拉津更大的電流降。 由圖4可見(jiàn)，加入阿特拉津免疫原后，由于阿特拉津免疫原\抗體復(fù)合體的形成，
產(chǎn)生更大體積的分子，對(duì)電解質(zhì)的流動(dòng)產(chǎn)生阻礙作用，與單獨(dú)加入阿特拉津相比，電流出現(xiàn)
明顯的降低。圖4中的插圖為阿特拉津免疫原加入前電流響應(yīng)，由此可見(jiàn)，阿特拉津免疫原
加入前電流可達(dá)到穩(wěn)定態(tài)，阿特拉津免疫原加入后引起明顯的電流降低。 由圖5可見(jiàn)，加入阿特拉津免疫原(A)和阿特拉津(B)引起明顯電流降，而加入的
百草枯(C)、敵草隆(D)因?yàn)椴慌c阿特拉津抗體結(jié)合，無(wú)更大體積分子形成，故不會(huì)出現(xiàn)電
流的突降。
權(quán)利要求
一種用于檢測(cè)阿特拉津的氯修飾的金納米通道膜，其特征在于，制備方法如下(a)以多孔聚碳酸酯膜為基膜，采用化學(xué)沉積法在孔徑為80nm～150nm的多孔聚碳酸酯膜上沉積金將多孔聚碳酸酯膜洗滌后在0.01M～0.05M SnCl2溶液浸泡30～120min，使Sn2+均勻地吸附在基膜及膜孔表面；取出清洗后在N2氣保護(hù)下將膜在0.01M～0.04M Ag(NH3)2+溶液中浸沒(méi)5～30min，洗滌后浸入pH＝9.5～10.5的6×10-3M～9×10-3M亞硫酸金鈉沉積溶液中，在0～10℃下化學(xué)鍍金4～10h；洗滌并用HNO3除去未反應(yīng)的Ag，即得到金納米通道陣列膜；(b)氯離子的修飾將所制得的金納米通道陣列膜活化清洗后在含0.005M～0.02M Cl-的溶液中浸泡10～16h，通過(guò)金-氯鍵使氯離子共價(jià)鍵單層自組裝在金納米通道陣列膜上，得到氯修飾的金納米通道膜。
2. 權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)阿特拉津的氯修飾的金納米通道膜，其特征在于， 其孔徑為20 50nm。
3. 權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)阿特拉津的氯修飾的金納米通道膜，其特征在于， 步驟(b)中，利用體積濃度為60% 80%的硫酸雙氧水混合液浸泡2 20min對(duì)金納米通 道陣列膜進(jìn)行活化。
4. 一種檢測(cè)阿特拉津的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述氯修飾的金納 米通道膜置于U形池的進(jìn)樣池和透過(guò)池之間，工作電極插入進(jìn)樣池，參比電極插入透過(guò)池；在進(jìn)樣池中加入含阿特拉津抗體的緩沖液，在透過(guò)池中加入不含有阿特拉津抗體的緩 沖液，維持兩池中的液面平行，在參比電極和工作電極兩端施加電壓，測(cè)定基底電流；隨后向進(jìn)樣池中加入含有待測(cè)樣品的緩沖液，通過(guò)電化學(xué)工作站進(jìn)行電流信號(hào)測(cè)試； 發(fā)生電流突降則說(shuō)明待測(cè)樣品中含有阿特拉津。
5. 權(quán)利要求4所述一種檢測(cè)阿特拉津的方法，其特征在于，所述的緩沖液為pH為7 8、濃度為0. 005M 0. 02M的PBS溶液。
6. 權(quán)利要求4所述一種檢測(cè)阿特拉津的方法，其特征在于，所述將待測(cè)樣品與BSA鍵合 得到阿特拉津免疫原。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)阿特拉津的氯修飾的金納米通道膜，及利用該金納米通道膜檢測(cè)阿特拉津的方法。以聚碳酸酯膜為基膜，采用化學(xué)沉積法制備直徑20～50nm的Au納米通道膜，氯離子通過(guò)金-氯共價(jià)鍵自組裝至金納米通道孔壁上。檢測(cè)方法為，將上述氯修飾的金納米通道膜置于進(jìn)樣池和透過(guò)池之間，進(jìn)樣池中加入含阿特拉津抗體的緩沖液，透過(guò)池中加入緩沖液，維持兩池液面平行，施加電壓，測(cè)定基底電流；向進(jìn)樣池中加入含待測(cè)樣品的緩沖液，通過(guò)電化學(xué)工作站進(jìn)行電流信號(hào)測(cè)試；發(fā)生電流突降則說(shuō)明待測(cè)樣品中含有阿特拉津。本發(fā)明檢測(cè)效率高，特異性強(qiáng)，可測(cè)定濃度下限為1.7×10-10M的阿特拉津，具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/531GK101718742SQ200910199159
公開(kāi)日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日
發(fā)明者岳增連, 彭斌, 趙國(guó)慶, 黃杉生 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)