專利名稱：：He4單克隆抗體和它們的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及能夠結(jié)合人附睪蛋白4(HE4)的抗體和使用此類抗體的方法，特別地在用于診斷卵巢癌和用于鑒定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的方法中使用此類抗體的方法。
背景技術(shù)：
：卵巢癌代表了在全球范圍內(nèi)影響婦女的異質(zhì)疾病群。存在幾種形式的卵巢癌，包括卵巢的上皮癌、生殖系癌(germ-linecancer)和卵巢基質(zhì)癌(ovarianstromalcancer)。上皮卵巢癌代表了該疾病的最常見形式。大約5_10%的上皮卵巢癌代表了疾病的遺傳類型，3種常見模式得到公認(rèn)單獨(dú)的卵巢癌；與分別在染色體17q21和13ql2上的BRACl和BRCA2基因連鎖(geneticlinkage)有關(guān)的卵巢和乳腺癌；以及卵巢和結(jié)腸癌。卵巢癌的最重要的危險因素是患病的一級親屬(例如，患卵巢癌的母親、姊妹或女兒)。參見，例如，Patridge等人(1999)CA-ACancerJournalforClinicians49:297-320。在2005年，估計存在22，000例診斷為卵巢癌的新病例和16，000例卵巢癌引起的死亡。通常參見www,cancer,org上的美國癌癥學(xué)會網(wǎng)站；www.cancer,gov上的美國國立癌癥研究所網(wǎng)站。卵巢癌是主要影響具有63歲的中位診斷年齡的絕經(jīng)后婦女的疾病。然而，疾病可影響所有年齡組的婦女。www,seer,cancer,gov上的美國國立癌癥研究所的Surveillance，Epidemiology,andEndResults(SEER)計劃。卵巢癌分期的分類基于超出卵巢的疾病的定位對擴(kuò)散的程度。1期卵巢癌局限在1個或2個卵巢中。2期疾病牽涉1個或2個卵巢中的腫瘤，并且伴有盆腔蔓延。在3期卵巢癌中，腫瘤存在于1個或2個卵巢中，并有通過顯微鏡確認(rèn)的骨盆外腹膜轉(zhuǎn)移和/或局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。4期卵巢癌的特征在于超出腹膜腔的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。由于缺乏標(biāo)志小腫瘤存在的特異性臨床癥狀，因而通常在疾病的晚期診斷出卵巢癌。對于年齡低于50歲的婦女，低于40%的卵巢癌被檢測到，此時腫瘤定位至1個或2個卵巢，并且此時疾病的預(yù)后最好。對于年齡超過50歲的婦女，該數(shù)值下降至低于15%。大約68%的患卵巢癌的所有年齡組的婦女直至遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移出現(xiàn)才被診斷出來。通常參見w胃.seer,cancer,gov上的美國國立癌癥研究所的Surveillance,Epidemiology,andEndResults(SEER)計戈丨J。卵巢癌通過從卵巢上皮局部脫落入腹膜腔內(nèi)，然后植入腹膜和局部侵入腸和膀胱來進(jìn)行擴(kuò)散。參與卵巢癌的淋巴結(jié)的存在在被診斷的卵巢癌的所有分期中是明顯的。陽性淋巴結(jié)的百分?jǐn)?shù)隨疾病的發(fā)展而顯著增加(即，1期，24%；2期，50%；3期，74%；4期，73%)。Id.卵巢癌患者的存活率是疾病被診斷出時所處的分期的函數(shù)，對于晚期疾病，5年存活率減少。超過90%的經(jīng)診斷患有1期卵巢癌的婦女在診斷后存活至少5年。當(dāng)疾病直至4期(即，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移)才被診斷時，5年存活率下降至低于30%。Id.上皮卵巢癌是疾病的最常見形式。存在4個公認(rèn)的上皮卵巢癌的主要組織學(xué)分類，包括血清亞型、子宮內(nèi)膜樣(endometrioid)亞型、透明細(xì)胞(clearcell)亞型和粘蛋白(mucinous)亞型。卵巢癌發(fā)病機(jī)理知之甚少，但據(jù)認(rèn)為產(chǎn)生自卵巢表面上皮。參見Bell(2005)Mod.Pathol.18(Suppl2):S19_32。提供卵巢癌的危險的最大減少的生命因素(lifefactor)包括經(jīng)產(chǎn)(multiparity)、口服避孕藥的使用和母乳喂養(yǎng)，其全都阻止排卵。因?yàn)榕怕褜?dǎo)致上皮損傷，接著進(jìn)行修復(fù)和可能的炎癥反應(yīng)，該過程在整個婦女育齡中的無間斷重復(fù)導(dǎo)致細(xì)胞損傷和增加卵巢癌的危險。參見，例如，Ness等人(1999)J.Natl.CancerInst.91:1459-1467。然而，對于卵巢癌通過確定的前驅(qū)病變(precursorlesion)，例如對于子宮頸癌(cervicalcarcinoma)和結(jié)腸癌的公認(rèn)的那些進(jìn)行漸近演變，還未得到公認(rèn)。因此，大量的研究一直以來關(guān)注于理解卵巢癌的分子基礎(chǔ)和理解卵巢癌的不同組織學(xué)亞型之間的基本差異。這些研究已利用基因表達(dá)分析來提供該理解并且已鑒定了系列在診斷應(yīng)用中用于評估的潛在生物標(biāo)記。參見例如Ono等人(2000)CancerRes.605007-11；Welsh等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA981176-1181；Donninger等人(2004)Oncogene238065-8077；和Lee等人(2004)Int.J.Oncol.24(4):847_851。卵巢癌通常根據(jù)明顯的臨床癥狀的存在，最明顯地腹痛、附件腫塊(adnexalmass)、腹部氣脹和尿急的存在來檢測。這樣，通常在晚期檢測到卵巢癌，此時預(yù)后和臨床結(jié)果不良。卵巢癌的早期(即，1期)檢測導(dǎo)致大約90%的治愈率(使用標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)和化學(xué)療法)；因此存在對在早期(此時治療將最有效)檢測卵巢癌的臨床需要。不幸的是，目前檢測早期卵巢癌的篩查方法不足。目前卵巢癌篩查的實(shí)踐利用CA125和經(jīng)陰道超聲(超聲檢查)。CA125的升高的血清水平與卵巢癌相關(guān)，經(jīng)陰道超聲的隨后使用幫助檢測卵巢癌的存在。卵巢疾病的確認(rèn)基于侵入性方法例如剖腹手術(shù)(laparotomy)。然而，由于有限的靈敏度、有限的特異性和小于3%的弱陽性預(yù)測值的問題，CA125的使用對于一般群體篩查是無效的。Bast(2003)JClinOncol.21(lOSuppl):200_205。因此，對于無癥狀患者群體中卵巢癌的一般篩查的推薦存在爭議。參見www,cancer,rov上的國立癌癥研究所網(wǎng)站。對于高?；颊撸糜诼殉舶┑臋z測的一般可接受的方法包括骨盆檢查的使用、CA125血清測試的使用以及經(jīng)陰道超聲(超聲檢查).Patridge等人(1999)CA-ACancerJournalforClinicians49:297_320。CA125是通常在上皮細(xì)胞表面上表達(dá)的良好表征的腫瘤標(biāo)記，并且通常在正?；颊叩难逯袡z測為35U/mL。通常在大約85%的卵巢癌患者中檢測到提高的CA125血清水平(>35U/mL)；剩余的15%的卵巢癌患者具有正常的CA125血清水平。此外，CA125只在50%的1期卵巢癌患者中提高，從而限制了其在卵巢癌的早期檢測中的臨床應(yīng)用。然而，提高的CA125血清水平用于監(jiān)測治療性干預(yù)后疾病的復(fù)發(fā)，這代表了目前由FDA批準(zhǔn)的CA125的用途。此外，提高的CA125血清水平預(yù)示著進(jìn)一步可檢測的卵巢癌。一般群體中卵巢癌的低流行率對可促進(jìn)疾病的早期檢測的篩查測試的發(fā)展產(chǎn)生了重大的挑戰(zhàn)。用于具有低流行率的疾病例如卵巢癌的篩查方法通常導(dǎo)致高比例的假陽性比真陽性，這限制了此類篩查程序的臨床應(yīng)用。假定顯著的危險與可能的卵巢癌的手術(shù)探查(surgicalexploration)相關(guān)，那么臨床上有用的篩查測試應(yīng)當(dāng)指對于每一個確實(shí)患有卵巢癌的婦女的查出進(jìn)行不超過10個婦女(S卩，至少10%的陽性預(yù)測值(PPV))的手術(shù)。Skates等人(2004)J.Clin.Oncol.22:4059_4066。PPV高度依賴于特定疾病或病狀的流行率并且由于疾病患病率的不同將發(fā)生顯著的變化。因此，對于低患病率疾病，例如卵巢癌，具有相對低的PPV的篩查診斷測試仍然具有顯著的臨床功用。潛在的卵巢癌篩查程序必須就卵巢癌的低患病率進(jìn)行調(diào)整，并且就生物標(biāo)記的表現(xiàn)和臨床需要對其進(jìn)行評估。參見，例如，Skates等人(2004)J.Clin.Oncol.224059-4066；Bast等人(2005)Int.J.Gynecol.Cancer15:274_281；和Rosen等人(2005)Gyn.Oncol.99:267_277。盡管進(jìn)行了鑒定用于卵巢癌的檢測，特別地早期檢測的生物標(biāo)記或成組的生物標(biāo)記的努力，但目前還不存在足夠的滿足臨床需要的篩查或診斷測試。目前可獲得的方法例如CA125的檢測展示了不可接受的高假陽性率。來自美國國立癌癥研究所的當(dāng)前推薦指出“沒有足夠的證據(jù)證實(shí)使用血清標(biāo)記例如CA125、經(jīng)陰道超聲或骨盆檢查進(jìn)行的卵巢癌的篩查可導(dǎo)致卵巢癌引起的死亡率的減少”(NCISummaryofEvidence(Level4,5)；標(biāo)明日期2005年2月)。鑒于目前可獲得的篩查技術(shù)的假陽性的嚴(yán)重危險，NCI不支持卵巢癌的一般篩查方法的建立。這樣，對于卵巢癌不存在標(biāo)準(zhǔn)化的篩查測試。卵巢癌例如上皮卵巢癌(EOC)的5年存活率很大程度上取決于診斷時疾病的分期；增加的存活率與早期檢測(即，1或2期)相關(guān)。然而，絕大部分卵巢癌直至3或4期才被診斷出來，此時預(yù)后不良。因此，需要在早期鑒定更多的卵巢癌。允許卵巢癌的早期鑒定的生物標(biāo)記的表征具有改善許多患者的臨床結(jié)果的潛能。一個這樣的候選生物標(biāo)記是人附睪蛋白4(HE4)。HE4是首先在人附睪組織中觀察到的并且在某些癌癥(包括卵巢和乳腺癌)中過表達(dá)的分泌型和糖基化蛋白。隨后的研究已顯示HE4蛋白也存在于女性生殖道和其他上皮組織中。HE4基因存在于人染色體20ql2_13.1上，并且已發(fā)現(xiàn)20ql2染色體區(qū)域在卵巢癌癥中頻繁擴(kuò)增。參見,例如，Bouchard等人(2006)于oncology,thelancet.com7167-174中；Galagono等人(2006)Mod.Patholo.19:847_583；Drapin等人(2005)CancerResearch65(6):2162_9；Lu等人(2004)Clin.CancerRes.103291-3300；HellstrOm等人(2003)CancerResearch63:3695-3700;和Bingle等人(2002)Oncogene21:2768-2773，其全部以其全文通過引用合并入本文。因此，卵巢癌細(xì)胞中HE4的過表達(dá)表明該蛋白可在用于檢測卵巢癌或用于鑒定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的方法中用作生物標(biāo)記。根據(jù)上述內(nèi)容，在本領(lǐng)域內(nèi)存在對能夠檢測生物標(biāo)記例如HE4的表達(dá)的抗體的需要，所述生物標(biāo)記的過表達(dá)可表示卵巢癌或增加的患者患卵巢癌的可能性。此類抗體可用于診斷卵巢癌或鑒定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的方法中。發(fā)明概述提供了用于診斷卵巢癌和鑒定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的組合物和方法。組合物包括能夠結(jié)合人附睪蛋白4(HE4)的單克隆抗體。本文還包括此類單克隆抗體的抗原結(jié)合片段和變體、能夠產(chǎn)生此類抗體的雜交瘤細(xì)胞系以及包含本發(fā)明的單克隆抗體的試劑盒。本發(fā)明的組合物用于診斷癌癥的方法和用于鑒定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的篩查方法。用于在患者中診斷卵巢癌的方法通常包括通過兩抗體(two-antibody)或“夾心”ELISA技術(shù)檢測HE4蛋白在患者身體樣品中的過表達(dá)，如本文中所描述的。用于鑒定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的篩查方法通常包括在患者身體樣品中檢測多個在卵巢癌中選擇性過表達(dá)的生物標(biāo)記的表達(dá)。生物標(biāo)記的過表達(dá)表示增加的患者患卵巢癌的可能性。本發(fā)明的方法可包括例如“兩步驟”分析法，其中進(jìn)行第一測定步驟來檢測第一生物標(biāo)記(例如，HE4)或第一組生物標(biāo)記的表達(dá)。如果第一生物標(biāo)記或第一組生物標(biāo)記過表達(dá)，則進(jìn)行第二測定步驟來檢測第二生物標(biāo)記或第二組生物標(biāo)記的表達(dá)。第一和第二生物標(biāo)記或組生物標(biāo)記的過表達(dá)表示增加的患者患卵巢癌的可能性。本發(fā)明的方法可利用公開的HE4抗體來檢測患者樣品中HE4的表達(dá)。本發(fā)明的組合物和方法還可用于其他類型的癌癥包括但不限于乳腺癌的診斷或檢測。本發(fā)明的組合物還包括分離的多肽，所述多肽包含能夠結(jié)合HE4單克隆抗體的表位。此類多肽用于產(chǎn)生HE4抗體的方法。還提供了編碼HE4表位的氨基酸序列的分離的核酸分子。附圖概述圖1提供了在下文描述的夾心ELISA測定中使用稱為363A90.1和363A71.1的HE4單克隆抗體獲得的HE4(使用來自55歲以上的患者的樣品(A)和不同年齡的患者樣品(B))的接受者操作特性(ReceiverOperatingCharacteristic)(ROC)曲線。發(fā)明詳述提供了用于在患者中診斷卵巢癌和用于鑒定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的組合物和方法。組合物包括能夠結(jié)合HE4(已顯示在卵巢癌細(xì)胞中過表達(dá)的蛋白質(zhì))的單克隆抗體。還公開了產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。還提供了包含本文中描述的單克隆抗體的試劑盒。本組合物特別地用于在患者中診斷卵巢癌的“夾心”ELISA法和用于鑒定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的篩查法，如下面詳細(xì)描述的。本發(fā)明的組合物包括特異性結(jié)合HE4或其變體或片段的單克隆抗體。特別地，提供了稱為363A90.1和363A71.1的HE4抗體。產(chǎn)生HE4單克隆抗體363A90.1和363A71.1的雜交瘤細(xì)胞系于2007年2月2日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Manassas,Virginia,20110-2209并且分別賦予專利保藏號PTA-8196和PTA-8195。在國際承認(rèn)用于專利程序的微生物菌種保藏布達(dá)佩斯條約的條款下維持這些保藏。這些保藏只是為了方便本領(lǐng)域技術(shù)人員而進(jìn)行的而不是在35U.S.C.§112下要求保藏的承認(rèn)。本文中還公開了具有單克隆抗體363A90.1和363A71.1的結(jié)合特征的抗體。此類抗體包括但不限于在競爭結(jié)合測定中與這些抗體競爭的抗體以及結(jié)合能夠結(jié)合單克隆抗體363A90.1或363A71.1的表位的抗體。還提供了單克隆抗體363A90.1和363A71.1的保持特異性結(jié)合HE4的能力的變體和片段。組合物還包括產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系和包含至少一種本文中公開的單克隆抗體的試劑盒?！翱贵w”和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。雖然抗體展示對抗原的結(jié)合特異性，但免疫球蛋白包括抗體和缺乏抗原特異性的其他抗體樣分子。后一種類型的多肽例如通過淋巴系統(tǒng)以低水平產(chǎn)生和通過骨髓瘤以增加的水平產(chǎn)生。術(shù)語“抗體”廣泛地包括抗體的天然發(fā)生形式和重組抗體例如單鏈抗體、嵌合和人源化抗體和多特異性抗體以及前述所有形式的片段和衍生物，所述片段和衍生物具有至少抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w衍生物可包括綴合至抗體的蛋白質(zhì)或化學(xué)部分。術(shù)語“抗體”以最廣泛的意義使用，其涵蓋完全裝配的抗體、可結(jié)合抗原的抗體片段(例如，F(xiàn)ab'、F'(ab)2、Fv、單鏈抗體、雙抗體(diabody))和包含前述的重組肽。如本文中所使用的，“HE4抗體”是指特異性結(jié)合任何HE4同種型，特別地HE4同種型Tl(SEQIDNO=D或其變體或片段的任何抗體，包括單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體和保持親本抗體的抗原結(jié)合功能的其片段。已知HE4蛋白的5個同種型，稱為T1-T5，如下面表1中所描述的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識至丨J，本發(fā)明的HE4單克隆抗體可結(jié)合多于一種HE4同種型，只要各同種型包含特定HE4抗體的相關(guān)表位序列。表1:HE4同種型<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本發(fā)明的HE4抗體最佳是單克隆抗體。本文中使用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從基本上均一的抗體的群體(即，包含個體抗體的群體除了可以以少量存在的可能的天然發(fā)生的突變外是同一的)獲得的抗體?！疤烊豢贵w”和“天然免疫球蛋白”通常是大約150，000道爾頓的由兩個相同的輕(L)鏈和兩個相同的重(H)鏈組成的異四聚體糖蛋白。各輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，然而二硫鍵的數(shù)目在不同的免疫球蛋白同種型(isotype)的重鏈中是變化的。各重鏈和輕鏈還具有有規(guī)律間隔的鏈內(nèi)二硫橋。各重鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(Vh)，之后是許多恒定結(jié)構(gòu)域。各輕鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域以及在其另一端具有恒定結(jié)構(gòu)域；輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域與重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域?qū)R，并且輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域?qū)R。特定的氨基酸殘基據(jù)認(rèn)為形成了輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的界面。術(shù)語“可變的”是指可變結(jié)構(gòu)域的某些部分在抗體間在序列上廣泛不同并且用于各特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性的事實(shí)。然而，可變性不是均勻分布在整個抗體的可變結(jié)構(gòu)域中。其集中在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或高變區(qū)的3個區(qū)段中。可變結(jié)構(gòu)域的更高度保守的部分稱為構(gòu)架(FR)區(qū)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包含4個FR區(qū)，主要采取通過3個CDR(其形成環(huán)形連接)連接的ρ-折疊(p-sheet)構(gòu)型，和15在一些情況下形成ρ-折疊結(jié)構(gòu)的部分。各鏈中的⑶R通過FR區(qū)與來自另一條鏈的CDR緊密地結(jié)合在一起，促成了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見Kabat等人，NIHPubl.No.91-3242，第I卷，第647-669頁(1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體對抗原的結(jié)合，但展示不同的效應(yīng)子功能，例如抗體在抗體依賴性細(xì)胞毒性中的參與。術(shù)語“高變區(qū)”，當(dāng)在本文中使用時，意指負(fù)責(zé)抗原-結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(即，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34(Li)、50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的31-35(Hl),50-65(H2)禾口95-102(H3)；Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5fiB.■PublicHealthService,NationalInstituteofHealth,25Bethesda,MD.[1991])和/或來自“高變環(huán)”的殘基(即，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(Li)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的2632(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Clothia和Lesk，J.Mol.Biol,196:901-917[1987])。“構(gòu)架區(qū)”或“FR”殘基是除了本文中認(rèn)為的高變區(qū)殘基外的可變結(jié)構(gòu)域殘基?！翱贵w片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體(Zapata等人(1995)ProteinEng.8(10)1057-1062)；單鏈抗體分子；和從抗體片段形成的多特異性抗體?？贵w的木瓜蛋白酶降解產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各自具有單個抗原結(jié)合位點(diǎn)，和殘留的“Fe”片段，其名稱反映了其容易結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)并且仍然能夠交聯(lián)抗原的F(ab')2片段。"Fv"是包含完整抗原識別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在兩鏈Fv類別中，該區(qū)域由緊密非共價結(jié)合的一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。在單鏈Fv類別中，一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域可通過易曲的肽連接體共價連接，這樣輕鏈和重鏈可以以類似于兩鏈Fv類別中的二聚體結(jié)構(gòu)的“二聚體”結(jié)構(gòu)結(jié)合。在該構(gòu)型中，各可變結(jié)構(gòu)域的3個CDR相互作用以確定二聚體的表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。共同地，6個⑶R賦予抗體抗原結(jié)合特異性。然而，甚至單個可變結(jié)構(gòu)域(或只包含3個對于抗原是特異性的CDR的Fv的一半)具有識別和結(jié)合抗原的能力，雖然以低于完整結(jié)合位點(diǎn)的親和力結(jié)合。Fab片段還包含輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(ChI)。Fab片段與Fab'片段的差異在于在重鏈(^1結(jié)構(gòu)域的羧基端數(shù)個殘基的添加，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的1個或多個半胱氨酸。Fab'-SH是本文中關(guān)于其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基具有游離巰基的Fab'的名稱。F(ab')2抗體片段最初產(chǎn)生為在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸的Fab‘片段對。本發(fā)明包括HE4抗體的片段，只要它們保持期望的全長抗體的親和力。因此，例如，HE4抗體的片段將保持結(jié)合HE4抗原的能力。此類片段的特征在于與相應(yīng)的全長抗體相似的特性，即，片段將特異性結(jié)合HE4。此類片段在本文中稱為“抗原結(jié)合”片段?？贵w的適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合片段包含全長抗體的一部分，通常為其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的實(shí)例包括但不限于Fab、F(ab')2和Fv片段以及單鏈抗體分子?！癋ab”意指由輕鏈和重鏈的一部分組成的免疫球蛋白的單價抗原結(jié)合片段。F(ab')2意指包含兩條輕鏈和兩條重鏈的一部分的免疫球蛋白的雙價抗原結(jié)合片段?！皢捂淔v”或“sFv”抗體片段意指包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域的片段，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個多肽鏈中。參見，例如，美國專利4，946，778,5,260，203,5,455，030和5，856，456，通過引用合并入本文。一般地，F(xiàn)v多肽還包含在Vh和\結(jié)構(gòu)域之間的使sFv能夠形成期望的結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)的多肽連接#。#fsFv的胃i$，#HPluckthun(1994)ThePh￡irm￡icologyofMonoclonalAntibodies,第113卷，ed.RosenburgandMoore(Springer-Verlag,NewYork),第269-315頁?？贵w或抗體片段可從使用例如McCafferty等人.(1990)Nature348552-554(1990)和美國專利5，514，548中描述的技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫分離。Clackson等人.(1991)Nature352:624_628和Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222581-597分別描述了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。隨后的公開物描述了通過鏈改組(Marks等人(1992)Bio/Technology10:779-783)以及作為用于構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略的組合感染和體內(nèi)重組(Waterhouse等人(1993)Nucleic.AcidsRes.212265-2266)進(jìn)行的高親和力(nM范圍)人抗體的產(chǎn)生。因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的常規(guī)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行的備選。已發(fā)展不同的技術(shù)用于產(chǎn)生抗體片段。常規(guī)地，通過完整抗體的蛋白水解降解來產(chǎn)生此類片段(參見，例如，Morimoto等人(1992)JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107_117(1992)和Brennan等人(1985)Science229:81)。然而，此類片段現(xiàn)在可通過重組宿主細(xì)胞來直接產(chǎn)生。例如，可從上面論述的抗體噬菌體文庫分離抗體片段。備選地，F(xiàn)ab'-SH片段可從大腸桿菌(E.coli)直接回收，然后經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)來形成F(ab')2片段(Carter等人(1992)Bio/Technology10163-167)。根據(jù)另一個方法，F(xiàn)(ab')2片段可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離。用于產(chǎn)生抗體片段的其他技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯然的。優(yōu)選本發(fā)明的抗體是天然單克隆的。如上面所指出的，“單克隆抗體”意指從基本上均一的抗體的群體(即，包含個體抗體的群體除了可以以少量存在的可能的天然發(fā)生的突變外都是同一的)獲得的抗體。關(guān)于抗體的類別或來源，該術(shù)語不受限制。該術(shù)語包括完整的免疫球蛋白以及片段例如Fab、F(ab')2、Fv和保持抗體的抗原結(jié)合功能的其他片段。單克隆抗體是高度特異性的，其抗單個抗原位點(diǎn)，即如本文下面定義的，HE4蛋白內(nèi)的特定表位。此外，與通常包括抗不同決定子(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑不同，各單克隆抗體抗抗原上的單一決定子。修飾詞“單克隆”是指從基本上均一的抗體群體獲得的抗體的特征，并且不被解釋為需要通過任何特定方法產(chǎn)生抗體。例如，按照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過最早由Kohler等人(1975)Nature256:495描述的雜交瘤方法來制備，或可通過重組DNA方法(參見，例如美國專利4，816，567)來制備?！皢慰寺】贵w”還可通過使用例如Clackson等人(1991)Nature352:624_628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222581-597；和美國專利5，514，548中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫分離。單克隆抗體可使用Kohler等人(1975)Nature256:495_496的方法或其改進(jìn)方法來制備。一般地，用含有抗原的溶液免疫小鼠?？赏ㄟ^在鹽溶液，優(yōu)選地佐劑例如弗氏完全佐劑中混合或乳化含有抗原的溶液，然后胃腸外注射該混合物或乳狀液來進(jìn)行免疫。本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何免疫方法可用于獲得本發(fā)明的單克隆抗體。在免疫動物后，取出脾(和任選地，幾個大淋巴結(jié))，并且將其分離成單個細(xì)胞?？赏ㄟ^將細(xì)胞懸浮液應(yīng)用于用目的抗原涂鋪的板或孔來篩選脾細(xì)胞。表達(dá)對于抗原是特異性的膜結(jié)合免疫球蛋白的B細(xì)胞(即，產(chǎn)生抗體的細(xì)胞)結(jié)合板并且不被沖洗掉。然后誘導(dǎo)所得的B細(xì)胞或所有分離的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，從而形成產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，然后在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。通過連續(xù)稀釋將所得的細(xì)胞涂板并且就特異性結(jié)合目的抗原(并且不結(jié)合不相關(guān)抗原)的抗體的產(chǎn)生對其進(jìn)行測定。然后體外(例如，在組織培養(yǎng)瓶或空心纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(作為小鼠的腹水)培養(yǎng)選擇的分泌單克隆抗體(mAb)的雜交瘤。還可使用重復(fù)免疫多位點(diǎn)技術(shù)(ItepetitiveImmunizationsMultipleSitestechnology)(RIMMS)產(chǎn)生單克隆抗體。參見，例如，Kilpatrick等人(1997)Hybridoma16(4):381_389;Wring等人(1999)J.Pharm.Biomed.Anal.19(5):695_707；和Bynum等人(1999)Hybridomal8(5):407_411，其全部以其全文通過引用合并入本文。作為雜交瘤的使用的備選，可在細(xì)胞系例如CHO細(xì)胞系中產(chǎn)生抗體，如美國專利5，545，403,5,545，405和5，998，144中公開的；通過引用合并入本文。簡而言之，用分別能夠表達(dá)輕鏈和重鏈的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。通過轉(zhuǎn)染分開的載體上的兩個蛋白，可產(chǎn)生嵌合抗體。另一個有利方面是抗體的正確糖基化。還可通過用生物標(biāo)記蛋白篩查重組的組合免疫球蛋白文庫(例如，抗體噬菌體展示文庫)，從而分離結(jié)合生物標(biāo)記蛋白的免疫球蛋白文庫成員來鑒定和分離單克隆抗體。用于產(chǎn)生和篩查噬菌體展示文庫的試劑盒可商購獲得(例如，PharmaciaRecombinantPhageAntibodySystem,目錄號27-9400-01；禾口StratageneSurfZAPPhageDisplayKit,目錄號240612)。此外，可在例如美國專利5，223，409、PCT發(fā)明者J·W·格勒克,R·L·齊克,T·J·費(fèi)希爾申請人:三路影像公司