專利名稱：：檢測自身免疫疾病相關(guān)抗核抗體譜的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種診斷疾病的試劑盒，尤其涉及一種檢測自身免疫疾病相關(guān)抗核抗體(anti-nucleicantibody,ANA)譜的試劑盒，本發(fā)明還涉及該診斷試劑盒的制備方法及其使用方法，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：自身免疫疾病是免疫系統(tǒng)對自身機(jī)體的成份發(fā)生免疫反應(yīng)，造成損害而引發(fā)疾病。常見的自身免疫疾病有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、青少年糖尿病、原發(fā)性血小板紫癜、自身免疫性溶血性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎以及許多種皮膚病、慢性肝病等。正常情況下免疫系統(tǒng)只對侵入機(jī)體的外來物，如細(xì)菌、病毒、寄生蟲以及移植物等產(chǎn)生反應(yīng)，消滅或排斥這些異物。在某些因素影響下，機(jī)體的組織成份或免疫系統(tǒng)本身出現(xiàn)了某些異常，致使免疫系統(tǒng)誤將自身成份當(dāng)成外來物來攻擊。這時(shí)候免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生針對機(jī)體自身一些成份的抗體及活性淋巴細(xì)胞，損害破壞自身組織臟器，導(dǎo)致疾病。如果不加以及時(shí)有效的控制，其后果十分嚴(yán)重，最終甚至危害生命。在目前自身免疫疾病發(fā)病機(jī)理不清楚的情況下，最好辦法就是早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷與早期治療，這是提高自身免疫疾病療效的關(guān)鍵。雖然不同的自身免疫疾病各有其特殊的臨床表現(xiàn)和診斷標(biāo)準(zhǔn)，但其常具有一個(gè)共同特征就是患者的血清中?？梢詸z測出高滴度的自身抗體或能與自身組織成分起反應(yīng)的致敏淋巴細(xì)胞，其中常通過檢測血清中抗核抗體(anti-nucleicantibody,ANA)來診斷自身免疫疾病?？购丝贵w是以真核細(xì)胞的核成分為靶抗原的自身抗體的總稱。所用混合抗原中，nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、Jo-l、核小體、dsDNA、組蛋白、核糖體P蛋白、AMA-M2;PM-Scl、CENPB及PCNA等是常見抗核抗體的靶成分，目前國內(nèi)外還沒有同時(shí)檢測十五種抗核抗體的診斷試劑。對于自身免疫疾病診斷方法多采用間接免疫熒光分析法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或免疫印跡，但各有其不足。間接免疫熒光分析法是檢測自身抗體的常用技術(shù)。其實(shí)驗(yàn)基質(zhì)為H印-2細(xì)胞或不同靈長類肝臟組織冰凍切片，含有完整的抗原譜。許多組織經(jīng)間接免疫熒光分析法著染可提示自身抗體的存在，但是不能對自身抗體的種類進(jìn)行具體客觀的評價(jià)，因此其特異性的證實(shí)需要其他技術(shù)如免疫印跡法、ELISA等進(jìn)行二級確認(rèn)試驗(yàn)。并且對間接免疫熒光分析法著染的鑒定有一定的主觀性，因而對結(jié)果的解釋可能在不同時(shí)間點(diǎn)、不同觀察者之間、新老組織切片之間存在差異。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有成熟度高、靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作方法簡便快速、無放射性污染且檢測結(jié)果排除了認(rèn)為的主觀判斷，以及應(yīng)用范圍廣等很多優(yōu)點(diǎn)，但一次試驗(yàn)只能檢測單一指標(biāo)，通量低，檢測成本較高，在自身免疫疾病的診斷應(yīng)用推廣方面存在著極大的局限性。免疫印跡診斷試劑是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種免疫生化技術(shù)，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性的優(yōu)點(diǎn)。但是在SDS-PAGE的過程中，許多抗原決定簇的構(gòu)像可能遭到破壞，不能與特異性抗體發(fā)生或者發(fā)生非特異性結(jié)合，造成結(jié)果判斷錯(cuò)誤。所以，目前對于自身免疫疾病的診斷方法還需進(jìn)一步的改進(jìn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種新的檢測自身免疫疾病相關(guān)ANA譜的試劑盒，該試劑盒可以聯(lián)合檢測常用于診斷自身免疫疾病的十五種抗核抗體(ANA)，不僅大大提高了檢測效率，而且相對于單檢試劑更具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種檢測自身免疫疾病相關(guān)ANA譜的試劑盒，該試劑盒包括反應(yīng)卡、酶聯(lián)試劑、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液；其中，所述反應(yīng)卡由載片和固定在載片上的包被有15條平行的抗原檢測線的硝酸纖維素膜或尼龍膜所組成，該抗原檢測線分別由nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro_52、SS-B、Scl-70、Jo-1、核小體、dsDNA、組蛋白、核糖體P蛋白、AMA-M2、PM-Scl、CENPB、PCNA彼此獨(dú)立的劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上而形成。為了達(dá)到更好的檢測效果，優(yōu)選的所述的檢測膜條還可含有1條由抗羊IgG包被或劃線而成的對照線；檢測膜條上的每一檢測線對應(yīng)于或置于載片反應(yīng)區(qū)彼此分隔的反應(yīng)槽中，反應(yīng)槽為長4咖、寬2mm、高lmm的長方槽，使每一檢測線形成一獨(dú)立的檢測區(qū)域。所述的酶聯(lián)試劑優(yōu)選為堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG;所述的顯色劑優(yōu)選為5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸；所述的終止液優(yōu)選為1X磷酸鹽緩沖液；所述的濃縮洗滌液優(yōu)選為IOX磷酸鹽緩沖液；為了達(dá)到更好的檢測效果，所述的15種抗原優(yōu)選為天然抗原或真核表達(dá)重組抗原，可分別按照以下方法制備得到(1)天然抗原提取nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、Jo-1、dsDNA、核小體、組蛋白及核糖體P蛋白為利用丙酮法從犢牛胸腺組織提取的天然蛋白；AMA-M2從豬心組織提取的天然蛋白；其具體的提取方法如下犢牛胸腺和豬心凍存于-8(TC超低溫冰箱，首先，4'C下分別以磷酸鹽緩沖液(PBS)和Tris-HC1緩沖液為提取液提取ANA，用-2(TC預(yù)冷的丙酮沉淀提取ANA成干粉，與Sigma公司兔胸腺丙酮粉一起做聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和垂直轉(zhuǎn)印(Westernblot),轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上，ID和IBT檢測抗ANA抗體，其次，硫酸銨不同飽和濃度分步沉淀豬心丙酮粉抗原，PEG6000不同濃度分步沉淀犢牛胸腺及兔胸腺丙酮粉抗原。(2)重組抗原的真核表達(dá)Ro-52、PM-Scl、CENPB、PCNA利用BactoBac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白。具體方法如下分別參考SS-A、PM-Scl、CENPB、PCNA基因序列，設(shè)計(jì)相對應(yīng)的引物，PCR擴(kuò)增Ro-52、PM-Scl、CENPB、PCNA基因，將其克隆到pFastBacHTc中，通過轉(zhuǎn)化E.ColiDH10Ba，篩選克隆，抽提重組Bacmid/cystatin,后者經(jīng)Cellfectin介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲取重組病毒，擴(kuò)增病毒并感染Sf9細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，其中重組蛋白帶有5XHis標(biāo)簽。SDS-PAGE、Western-blot分析鑒定表達(dá)蛋白。優(yōu)化表達(dá)條件，并采用昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行抗原表達(dá)。(3)對十五種抗原的鑒定、純化分離用陽性標(biāo)準(zhǔn)血清(由美國亞特蘭大疾病控制中心提供CDC-ANA弁1至#11)鑒定抗原；硫酸銨鹽析一透析一離子交換柱一葡聚糖凝膠柱一免疫親和層析等方法分離純化十五種抗原(純度可達(dá)到90%以上)。本發(fā)明中，所述的自身免疫疾病可以是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，混合性結(jié)締組織病(MCTD)、干燥綜合癥(SS)、系統(tǒng)性硬皮病(PSS)、多發(fā)性肌炎/皮肌炎(PM/DM)或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。本發(fā)明在免疫印跡診斷方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，對所用抗原從動物組織中進(jìn)行提取或采用真核表達(dá)的方式得到重組蛋白，將它們進(jìn)行純化分離后，直接包被于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，彌補(bǔ)了免疫印跡診斷方法所用抗原不具有天然結(jié)構(gòu)的缺點(diǎn)，提高了自身免疫疾病診斷的敏感度、特異性和準(zhǔn)確性；并且檢測膜條固定在載片上，其中每一抗原對應(yīng)一分隔開來的反應(yīng)槽，形成獨(dú)立的檢測區(qū)域，操作更加簡便，樣品消耗少，結(jié)果判斷不受人為的主觀因素的影響。本發(fā)明試劑盒的使用方法樣品要求靜脈取血2-5ml，置試管待凝固后離心分離血清，血清標(biāo)本保存2-8'C，在24小時(shí)內(nèi)不能測試的標(biāo)本應(yīng)放-2CTC，嚴(yán)重溶血，有絮狀物或霉變的血清標(biāo)本會影響測試。1、加樣用樣品稀釋液(磷酸鹽緩沖液)按照h100稀釋待檢樣本，反應(yīng)卡的每一反應(yīng)槽中加入100ul稀釋待檢樣本，放入孵育震蕩器。37'C反應(yīng)30分鐘。2、洗板樣本反應(yīng)結(jié)束后，棄去反應(yīng)液，振蕩洗滌3X5min。3、加入酶標(biāo)二抗堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG的抗體10倍稀釋，向每一反應(yīng)槽中加入100ul，放入孵育振蕩器，37'C反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后洗膜。4、檢測每一反應(yīng)槽加入配置好的顯色液100ul，室溫10min觀察結(jié)果。如有一條或一條以上的檢測條帶顯色，即患有自身免疫疾病。圖l本發(fā)明試劑盒中的反應(yīng)卡示意圖。具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1本發(fā)明試劑盒的制備1、天然抗原的制備(1)天然抗原提取nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、Jo-1、dsDNA、核小體、組蛋白及核糖體P蛋白為利用丙酮法從犢牛胸腺組織提取的天然蛋白；AMA-M2從豬心組織提取的天然蛋白。具體方法如下犢牛胸腺和豬心凍存于-8(TC超低溫冰箱，首先，4t:下分別以磷酸鹽緩沖液(PBS)和Tris-HC1緩沖液為提取液提取ANA，用-2(TC預(yù)冷的丙酮沉淀提取ANA成干粉，與Sigma公司兔胸腺丙酮粉一起做聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和垂直轉(zhuǎn)印(Westernblot)，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上，ID和IBT檢測抗ANA抗體，其次，硫酸銨不同飽和濃度分步沉淀豬心丙酮粉抗原，PEG6000不同濃度分步沉淀犢牛胸腺及兔胸腺丙酮粉抗原。(2)重組抗原的真核表達(dá)Ro-52、PM-Scl、CENPB、PCNA利用BactoBac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白。具體方法如下分別參考Ro-52、PM-Scl、CENPB、PCNA基因序列，設(shè)計(jì)相對應(yīng)的引物，PCR擴(kuò)增Ro-52、PM-Scl、CENPB、PCNA基因，將其克隆到pFastBacHTc中，通過轉(zhuǎn)化E.ColiDH10Bac篩選克隆，抽提重組Bacmid/cystatin，后者經(jīng)Cellfectin介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲取重組病毒，擴(kuò)增病毒并感染Sf9細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，其中重組蛋白帶有5XHis。SDS-PAGE、Western-blot分析鑒定表達(dá)蛋白。優(yōu)化表達(dá)條件，并采用昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行抗原表達(dá)。(3)對十五種抗原的鑒定、純化分離用陽性標(biāo)準(zhǔn)血清(由美國亞特蘭大疾病控制中心提供CDC-ANA#1至#11)鑒定抗原；硫酸銨鹽析一透析一離子交換柱一葡聚糖凝膠柱一免疫親和層析等方法分離純化十五種抗原。2、包被將0.l-lul的含有1-100ng的上述十五種相關(guān)疾病特異性抗原及抗羊IgG的0.01-0.1M的磷酸鹽緩沖液用全自動點(diǎn)樣儀劃線于硝酸纖維素膜上，4'C包被16-24個(gè)小時(shí)。具體的，如圖1所示，其中用于劃線的形式不局限于所表示的形式，各種抗原的排列順序可以進(jìn)行任意調(diào)整。3、封閉用50-200ul的含0.05-0.5%Tween20，1-5%BSA，5-10%的脫脂奶粉，5-10%的蔗糖的0.01-0.1M的磷酸鹽緩沖液或者Tris緩沖液，37。C封閉0.5-3小時(shí)，用含有經(jīng)10倍稀釋的濃縮洗液洗滌。晾干后，于2-『C保存?zhèn)溆谩?、固定載片將所制備的檢測膜條固定在載片上，其中每一抗原或檢測線對應(yīng)或放置于載片反應(yīng)區(qū)中一個(gè)彼此分隔的反應(yīng)槽中，形成獨(dú)立的檢測區(qū)域，得到反應(yīng)卡。5、試劑盒的組裝反應(yīng)卡1個(gè)，標(biāo)準(zhǔn)品1X0.02ml、酶聯(lián)試劑1X3ml、樣品稀釋液1X100ml、濃縮洗滌液lX50ml、顯色液1X30ml。實(shí)施例2本發(fā)明試劑盒的使用方法樣品要求靜脈取血2-5ml，置試管待凝固后離心分離血清，血清標(biāo)本保存2-8°C，在24小時(shí)內(nèi)不能測試的標(biāo)本應(yīng)放-20'C，嚴(yán)重溶血，有絮狀物或霉變的血清標(biāo)本會影響測試。1、加樣用樣品稀釋液按照l:IOO稀釋待檢樣本，如上述實(shí)施1所制備檢測試劑的反應(yīng)槽中加入100ul，放入孵育震蕩器。37'C反應(yīng)30分鐘。2、洗板樣本反應(yīng)結(jié)束后，棄去反應(yīng)液，振蕩洗滌3X5min。3、加入酶標(biāo)二抗堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG的抗體10倍稀釋，向每一反應(yīng)槽中加入100ul，放入孵育振蕩器，37'C反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后洗膜。4、檢測J每一反應(yīng)槽加入配置好的顯色液100ul，室溫10min觀察結(jié)果。試驗(yàn)例l本發(fā)明試劑盒臨床檢測自身免疫疾病的試驗(yàn)取225例自身免疫疾病患者，其中系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者(SLE)45人、硬皮癥患者(MCTD)38人、干燥綜合征患者(SS)14人、肌炎(DM)患者45人、多發(fā)性肌炎患者(PM)25人、混合型結(jié)締組織病(MCTD)患者22人、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)患者36人；另選75例正常對照(對照組)。標(biāo)本收集受檢者均于早晨空腹抽靜脈血3ml。分離血清，置一2(TC冰箱保存。采用本發(fā)明試劑盒(實(shí)施例l所制備)檢測nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、Jo-l、核小體、dsDNA、組蛋白、核糖體P蛋白、AMA-M2;PM-Scl、CENPB及PCNA。嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)；率的比較用x2檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表l。表l對300份血清檢測的顯色結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從試驗(yàn)結(jié)果可見，本發(fā)明試劑盒可以準(zhǔn)確的檢測或診斷出自身免疫疾病(包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮癥、干燥綜合征、肌炎、多發(fā)性肌炎、混合型結(jié)締組織病、原發(fā)性膽汁性肝硬化)，具有敏感度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好，操作簡便，樣品消耗少，結(jié)果判斷客觀等優(yōu)點(diǎn)。權(quán)利要求1、一種檢測自身免疫疾病相關(guān)抗核抗體譜的試劑盒，包括反應(yīng)卡、酶聯(lián)試劑、顯色劑、終止液和濃縮洗滌液，其特征在于所述反應(yīng)卡由載片和固定在載片之上的包被有15條平行的抗原檢測線的硝酸纖維素膜或尼龍膜所組成，該抗原檢測線分別由nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、Jo-1、核小體、dsDNA、組蛋白、核糖體P蛋白、AMA-M2、PM-Scl、CENPB和PCNA彼此獨(dú)立的劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上而形成。2、按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的硝酸纖維素膜或尼龍膜還含有1條由抗羊IgG劃線而成的對照線。3、按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的硝酸纖維素膜或尼龍膜上的每一檢測線對應(yīng)于或者置于載片反應(yīng)區(qū)中彼此分隔的一個(gè)相對獨(dú)立的反應(yīng)槽中。4、按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的自身免疫疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡，混合性結(jié)締組織病、干燥綜合癥、系統(tǒng)性硬皮病、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。5、按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的酶聯(lián)試劑為堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG;所述的顯色劑為5-溴-4_氯-3-吲哚-磷酸；所述的終止液為1X磷酸鹽緩沖液；所述的濃縮洗滌液為IOX磷酸鹽緩沖液。6、按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、Jo-l、核小體、dsDNA、組蛋白、核糖體P蛋白或AMA-M2為天然抗原。7、按照權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述的nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、Jo-l、核小體、dsDNA、組蛋白或核糖體P蛋白采用丙酮法從犢牛胸腺組織中提取得到。8、按照權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述的天然AP-M2從采用丙酮法豬心組織中提取得到。9、按照權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在Sf9細(xì)胞中表達(dá)Ro-52、PM-Scl、CENPB或PCNA基因，分別得到Ro-52、PM-Scl、CENPB或PCNA重組抗原。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測自身免疫疾病相關(guān)抗核抗體譜的試劑盒及其制備方法。該試劑盒包括反應(yīng)卡、酶聯(lián)試劑、顯色劑、終止液和濃縮洗滌液，所述反應(yīng)卡由載片和固定在載片上的硝酸纖維素膜或尼龍膜所組成，該硝酸纖維素膜或尼龍膜上含有分別由nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、Jo-1、核小體、dsDNA、組蛋白、核糖體P蛋白、AMA-M2、PM-Scl、CENPB、PCNA15天然及重組抗原包被而成的15條平行的檢測線。本發(fā)明試劑盒可準(zhǔn)確診斷出自身免疫疾病，克服了現(xiàn)有免疫印跡診斷方法在檢測自身免疫疾病中所存在的缺點(diǎn)，具有敏感度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好，操作簡便，樣品消耗少，結(jié)果判斷客觀等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號G01N33/558GK101329341SQ20081013230公開日2008年12月24日申請日期2008年7月9日優(yōu)先權(quán)日2008年7月9日發(fā)明者路戴,鑫金申請人:黑龍江美康匯融生物技術(shù)股份有限公司