專利名稱：抗核抗體檢測試劑Hep－2細(xì)胞抗原片的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臨床檢驗診斷試劑，特別是一種抗核抗體檢測試劑Hep-2細(xì)胞抗原片的制備方法及其產(chǎn)品。
抗核抗體(anti-nuclear antibodies，ANA)檢測是臨床免疫學(xué)檢驗一項重要的常規(guī)檢測項目，對自身免疫性疾病的診斷具有重要意義。目前，國外臨床檢測ANA診斷試劑多采用Hep-2細(xì)胞抗原片，德國、美國、英國、日本等國家均有診斷試劑廠生產(chǎn)。Hep-2細(xì)胞為應(yīng)用廣泛的商品ANA檢測抗原基質(zhì)片。與傳統(tǒng)的鼠肝(腎)印片或冰凍切片相比較，Hep-2細(xì)胞具有核大、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、便于結(jié)果觀察及熒光染色核型分析的優(yōu)點，有助于不同核型間的鑒別；同時，Hep-2細(xì)胞具有核抗原豐富、特異性強、含量高、具備人源性抗源性抗原的特征，可以檢測出應(yīng)用鼠肝(腎)冰凍切片檢測呈陰性或反應(yīng)弱的ANA，如抗著絲點抗體、抗體成份為SSA／R0的ANA、抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體及各種抗細(xì)胞漿抗體。文獻報道，應(yīng)用Hep-2細(xì)胞株檢測ANA較鼠肝(腎)冰凍切片檢測ANA，陽性率可提高10％-20％左右。但是國外產(chǎn)品價格昂貴，不適合國內(nèi)臨床需求。
本發(fā)明的目的是提供一種可大批量生產(chǎn)、質(zhì)量穩(wěn)定、效果良好的抗核抗體檢測試劑Hep-2細(xì)胞抗原片的制備方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述制備方法制得的產(chǎn)品。
本發(fā)明的抗核抗體檢測試劑Hep-2細(xì)胞抗原片的制備方法包括細(xì)胞培養(yǎng)玻片預(yù)處理、Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)、Hep-2細(xì)胞抗原片制備；其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)玻片預(yù)處理過程包括將玻片按細(xì)胞培養(yǎng)清洗條件洗滌處理后，在無水乙醇中浸泡1小時，用干凈醫(yī)用紗布擦干玻片，置烤箱中，在215℃干烤3小時，自然冷卻后待用。
所述玻片可制成留有5-12圓孔面積的玻片，除孔外的玻片上的其它表面均由漆或其它物質(zhì)覆蓋。
所述洗滌處理過程包括將玻片在濃硫酸中浸泡2小時，清水沖洗除酸，在洗滌劑溶液中洗刷，用清水沖洗干凈后用蒸餾水浸泡、清洗數(shù)次。
所述Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)過程包括將Hep-2細(xì)胞用含5％胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，待Hep-2細(xì)胞增值至充滿容器后待用。
所述Hep-2細(xì)胞屬人喉癌細(xì)胞系，是北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科病毒室贈送的；所述培養(yǎng)過程的條件是37℃、容器中充有5％CO2氣；所述評1640細(xì)胞培養(yǎng)液可采用美國生命技術(shù)公司生產(chǎn)的產(chǎn)品。
所述Hep-2細(xì)胞抗原片制備過程是在0．25％胰酶消化細(xì)胞消化的Hep-2細(xì)胞中加入20ml含5％胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻后離心分離，棄去上清液后加入20ml細(xì)胞培養(yǎng)液混勻得到細(xì)胞液，將細(xì)胞液滴于10孔玻片上，每孔1滴，滴片時應(yīng)保證10孔抗原片中細(xì)胞懸液保持一定張力，滴片后置細(xì)胞培養(yǎng)箱中在37℃、0．5％CO2條件下培養(yǎng)20小時，然后經(jīng)37℃預(yù)溫的0．01M pH7．2磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞培養(yǎng)片、20℃預(yù)冷甲醇溶液固定5分鐘、-20℃預(yù)冷丙酮溶液固定1分鐘、蒸餾水快速沖洗一次、吹干即可。
所述混勻過程可用移液管吹打，即可達到混勻目的；所述離心分離過程可置于50ml無菌離心管中，1200轉(zhuǎn)離心分離5分鐘，棄去上清液；所述滴液過程可用經(jīng)鈷60照射滅菌的無菌塑料滴管吸取調(diào)整后的細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞液滴于玻片上；所述磷酸鹽緩沖溶液可由磷酸氫二鈉·12H2O、磷酸二氫鈉·2H2O和氫氧化鈉配制而成。
本發(fā)明的制備方法還可以包括將吹干的玻片中加入干燥劑，置錫鉑紙包裝袋中，用熱合器封袋，置-20℃冰箱中保存。
本發(fā)明的制備方法制得的Hep-2細(xì)胞抗原片的鑒定方法是將制備好的Hep-2細(xì)胞抗原片從錫鉑紙包裝袋中取出，電風(fēng)扇吹干，在10個抗原孔中分別加入1∶20稀釋的9種陽性對照及陰性對照血清，按常規(guī)間接熒光法操作，并在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。質(zhì)量合格的Hep-2細(xì)胞片應(yīng)可檢出抗核抗體常見熒光染色模型，如均質(zhì)型、斑點型、核仁型、著絲點型、PCNA型、線粒體型、中心體型、高爾基體型等，以及陰性對照孔表現(xiàn)為ANA陰性檢測結(jié)果。應(yīng)用時，按以下步驟進行1、將Hep-2細(xì)胞片從鋁箔包裝袋取出后立即用電風(fēng)扇吹干，待用。
2、將被檢血清用0．01mol／L pH7．4PBS1∶20稀釋后，吸取20ul滴加于抗原孔中。同時在“+”孔加入20ul陽性血清，“-”孔加入20ul陰性對照血清作為實驗對照。
3、置濕盒37℃孵育30分鐘。
4、繼用同一PBS輕輕沖洗抗原片后，用搖床搖動洗滌三次，每次5分鐘，中間更換PBS液。
5、風(fēng)干后滴加20ul免抗人1gG熒光標(biāo)記抗體于各抗原孔中，孵育同上。
6、同上法，用PBS沖洗，洗滌細(xì)胞片，最后用雙蒸水快速浸洗一次。
7、細(xì)胞片風(fēng)干后，用緩沖甘油封片液及封片蓋玻片封片，封片液要滴加適量(每孔10ul)并防止氣泡形成。最后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。8、結(jié)果判斷在Hep-2細(xì)胞核或漿位置上出現(xiàn)特異性亮綠色染色為ANA陽性，ANA陰性則無特異性熒光染色。以Hep-2細(xì)胞作為底物測定，ANA效價應(yīng)≥1∶40方能判斷為陽性。對于陽性血清應(yīng)稀釋后測得抗體最終效價。實驗陽性結(jié)果報告方式應(yīng)包括ANA熒光染色模型及抗體滴度。
使用本發(fā)明制備的抗核抗體檢測試劑Hep-2細(xì)胞抗原片時應(yīng)注意1、檢測試劑盒中Hep-2細(xì)胞片-20℃保存，其余試劑2-8℃保存。
2、Hep-2細(xì)胞片制備時已固定，實驗使用時勿需再固定。
3、每次實驗必須設(shè)陽性和陰性對照。
4、對于檢測出ANA陽性血清，可用PBS將血清作倍比稀釋后(1∶20、1∶40、1∶60．……1∶2560)，再進行檢測抗體滴度。為節(jié)約抗原片，測定ANA陽性滴度時，可滴加間隔稀釋度血清檢測，如滴加1∶20、1∶80、1∶320、1∶1280四孔檢測。
5、有時一份血清內(nèi)因含有多種抗體，可出現(xiàn)不同的染色膜型，用不同稀釋度的血清檢測，可分清各種熒光染色模型和抗體效價。
6、實驗完畢后最好短時間內(nèi)熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，如需放置過夜，請將細(xì)胞片放濕盒中2-8℃避光保存。陽性結(jié)果熒光片置-20℃可保存很長時間。
本發(fā)明的抗核抗體檢測試劑Hep-2細(xì)胞抗原片的制備方法科學(xué)合理，可大批量生產(chǎn)，所制產(chǎn)品經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院及國內(nèi)數(shù)十家醫(yī)院臨床試用，質(zhì)量穩(wěn)定、效果良好。
下面結(jié)合實施例進一步描述本發(fā)明。
實施例一種抗核抗體檢測試劑Hep-2細(xì)胞抗原片的制備方法，它包括以下步驟1、細(xì)胞培養(yǎng)玻片預(yù)處理將10孔玻片按細(xì)胞培養(yǎng)清洗條件洗滌處理，即在濃硫酸中浸泡2小時，清水沖洗數(shù)次除酸后，在洗滌劑溶液中洗刷，清水沖洗干凈，在蒸餾水浸泡、清洗數(shù)次，再在無水乙醇中浸泡1小時，用干凈醫(yī)用紗布擦干玻片，置不銹鋼烤箱中，在215℃干烤3小時，自然冷卻后待用。
2、Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)將Hep-2細(xì)胞用含5％胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)條件為37℃、培養(yǎng)箱中含有5％CO2氣下培養(yǎng)，待Hep-2細(xì)胞增值到充滿整個容器后待用。
3、Hep-2細(xì)胞抗原片制備將0．25％胰酶消化細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的Hep-2細(xì)胞中加入20ml含5％胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液，用移液管吹打混勻后置于50ml無菌離心管中，以1200轉(zhuǎn)／分離心5分鐘，棄去上清液，加入20ml細(xì)胞培養(yǎng)液并混勻細(xì)胞，用經(jīng)鈷60照射滅菌的無菌塑料滴管吸取調(diào)整后的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞液滴于上述10孔玻片上，每孔1滴，滴片時應(yīng)保證10孔抗原片中細(xì)胞懸液保持一定張力；滴片后置于用無水乙醇擦拭滅菌的不銹鋼盒中的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在37℃、0．5％CO2條件下培養(yǎng)20小時，并用37℃預(yù)溫的0．01M pH7．2的磷酸緩沖液沖洗細(xì)胞培養(yǎng)片，再置于玻璃缸中，經(jīng)20℃預(yù)冷甲醇溶液固定5分鐘、-20℃預(yù)冷丙酮溶液固定1分鐘、蒸餾水快速沖洗一次后，用電風(fēng)扇吹干；在被吹干的Hep-2細(xì)胞抗原片中加入干燥劑，置錫鉑紙包裝袋中，用熱合器封袋，置-20℃冰箱中保存。
權(quán)利要求
1.一種抗核抗體檢測試劑Hep-2細(xì)胞抗原片的制備方法，其特征是包括細(xì)胞培養(yǎng)玻片預(yù)處理、Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)、Hep-2細(xì)胞抗原片制備；其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)玻片預(yù)處理過程包括將玻片按細(xì)胞培養(yǎng)清洗條件洗滌處理后，在無水乙醇中浸泡1小時，用干凈醫(yī)用紗布擦干玻片，置烤箱中，在215℃干烤3小時，自然冷卻后待用；所述Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)過程包括將Hep-2細(xì)胞用含5％胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，待Hep-2細(xì)胞增值至充滿容器后待用；所述Hep-2細(xì)胞抗原片制備過程是在0．25％胰酶消化細(xì)胞消化的Hep-2細(xì)胞中加入20ml含5％胎牛血清的 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻后離心分離，棄去上清液后加入20ml細(xì)胞培養(yǎng)液混勻得到細(xì)胞液，將細(xì)胞液滴于10孔玻片上，每孔1滴，滴片時應(yīng)保證10孔抗原片中細(xì)胞懸液保持一定張力，滴片后置細(xì)胞培養(yǎng)箱中在37℃、0．5％CO2條件下培養(yǎng)20小時，然后經(jīng)37℃預(yù)溫的0．01M pH7．2磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞培養(yǎng)片、20℃預(yù)冷甲醇溶液固定5分鐘、-20℃預(yù)冷丙酮溶液固定1分鐘、蒸餾水快速沖洗一次、吹干即可。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是所述玻片可制成留有5-12圓孔面積的玻片，除孔外的玻片上的其它表面均由漆或其它物質(zhì)覆蓋。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是所述Hep-2細(xì)胞的培養(yǎng)過程的條件是37℃、容器中充有5％CO2氣。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是所述Hep-2細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的混勻過程采用移液管吹打。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是所述離心分離過程可置于50ml無菌離心管中，1200轉(zhuǎn)離心分離5分鐘，棄去上清液；
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是所述滴液過程可用經(jīng)鈷60照射滅菌的無菌塑料滴管吸取調(diào)整后的細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞液滴于玻片上。
7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是還包括將吹干的玻片中加入干燥劑，置錫鉑紙包裝袋中，用熱合器封袋，置-20℃冰箱中保存。
8.一種抗核抗體檢測試劑Hep-2細(xì)胞抗原片，其特征是采用權(quán)利要求1-7所述的制備方法制得的。
全文摘要
本發(fā)明為一種抗核抗體檢測試劑Hep-2細(xì)胞抗原片的制備方法及其制備方法。本制備過程包括在胰酶消化細(xì)胞消化的Hep－2細(xì)胞中加入含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液,混勻后離心分離,加入細(xì)胞培養(yǎng)液混勻得到細(xì)胞液并滴于玻片上,經(jīng)培養(yǎng)、固定、沖洗、吹干后即得。本制備方法可大批量生產(chǎn),所制產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、效果良好。
文檔編號G01N33/531GK1281984SQ0012157
公開日2001年1月31日 申請日期2000年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月14日
發(fā)明者李永哲, 王慧珍, 倪安平 申請人:李永哲, 王慧珍, 倪安平