專利名稱：含原位聚合甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體柱的三維微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微全分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于分離、富集樣品的含固相萃取整體柱介 質(zhì)的三維微流控芯片及其制備方法。
背景技術(shù)：
微全分析系統(tǒng)(P-TAS，又稱芯片實驗室，Lab-on-a-chip)由于其具備可實現(xiàn)分析過程
連續(xù)化、集成化、自動化和微縮化的特點，從而能夠極大地減少試劑的消耗量、縮短分析 時間、提高分析檢測效率，因此，在疾病診斷、生化分析、臨床檢測等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng) 用。由于實測樣品中基底和成分復(fù)雜，基體效應(yīng)與各干擾組分的共存，致使樣品預(yù)處理過 程多是在微流控芯片外通過離心、過濾、分離等方式實現(xiàn)，不利于微全分析系統(tǒng)的集成化， 尤其是樣品的純化富集等預(yù)處理技術(shù)更是制約微全分析系統(tǒng)發(fā)展的瓶頸之一。
針對現(xiàn)階段微流控芯片系統(tǒng)中對生物樣品的預(yù)處理，目前常用的預(yù)處理技術(shù)有基于堰、 柵欄、柱、篩等微器件構(gòu)成的過濾式預(yù)處理芯片，基于吸脫附原理的開口管、填充柱和整 體柱式固相萃取型預(yù)處理芯片，以及基于電場、磁場或聲場作用原理的預(yù)處理芯片等。與 微流控芯片上的諸多預(yù)處理方式相比，整體柱是一種新型的在管內(nèi)以原位(in situ)聚合 的方式形成的用于分離分析或作為反應(yīng)器的多孔固相萃取介質(zhì)，具有雙連續(xù)結(jié)構(gòu)和雙孔分 布兩大特點，與傳統(tǒng)的多孔微球型柱材料相比，穿透孔的存在使得整體柱材料具有較好的 滲透性和較小的傳質(zhì)阻力。整體柱式固相萃取型預(yù)處理芯片可以通過選取不同性質(zhì)的吸附 劑使分析選擇性大為提高，但存在洗脫過程致使預(yù)處辟效率降低及集成難等問題。

發(fā)明內(nèi)容
'
本發(fā)明的目的在于提供一種高效、簡便、成本低廉、能用于樣品前處理的微流控固相 萃取預(yù)處理三維芯片及其制備方法。
本發(fā)明提出的微流控芯片由基片和蓋片直接封接而成，有效地實現(xiàn)樣品前處理整體柱 與微流控芯片微管道網(wǎng)絡(luò)一體化集成。蓋片上設(shè)有樣品入口、試劑入口和廢液出口及固相 萃取預(yù)處理微通道，采用PDMS整體澆鑄成型法制備而成，固相萃取預(yù)處理微通道內(nèi)采用 紫外光照原位聚合法制備有聚甲基丙烯酸丁酯類整體柱，樣品入口設(shè)置在固相萃取預(yù)處理 微通道的入口端;所述基片以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS
為基材，刻蝕有流體混合和反應(yīng)的微通道網(wǎng)絡(luò)，微通道網(wǎng)絡(luò)由樣品進(jìn)入通道、試劑進(jìn)入通
道共同連接混合反應(yīng)通道構(gòu)成；蓋片與基片粘接封裝后，蓋片上的固相萃取預(yù)處理微通道 末端與基片上的樣品進(jìn)入通道連通，蓋片上的試劑入口連通基片上的試劑進(jìn)入通道，蓋片 上的廢液出口位于基片上的混合反應(yīng)通道末端。
本芯片在蓋片上的微通道內(nèi)采用紫外光照原位聚合法制備聚甲基丙烯酸丁酯類整體 柱；聚甲基丙烯酸丁酯類整體柱是采用適宜比例的甲基丙烯酸丁酯(BMA)為功能單體， 二甲基乙二醇酯(EDMA)為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈(A舊N)為引發(fā)劑，1， 4丁二醇、異丙 醇、甲醇、乙醇、水等作為致孔劑，在365nm的紫外光照的條件下原位聚合聚甲基丙烯 酸丁酯類整體柱；采用掩膜可有效控制整體柱的在微管道中的位置和長度；通過微通道表 面Y-MAPS雙官能團(tuán)試劑改性處理，能有效地解決整體柱材料與管壁的鍵合問題。所述微 流控預(yù)處理芯片，預(yù)處理材料可以用于復(fù)雜生化樣品中待測目標(biāo)組分純化富集。
本芯片的制備方法如下
(1) 蓋片采用PDMS整體澆鑄成型法制作，首先第一次澆鑄PDMS，于90'C烘箱內(nèi)固 化半小時左右得到厚度為0. 3 0. 5mm厚的PDMS膜層，再將直徑為75 200y m細(xì)金屬Pt 絲固定于上述芯片上，第二次澆鑄PDMS，在60'C烘箱內(nèi)固化4小時得到含預(yù)處理微通道 的PDMS蓋片，并在與基片各微通道口對應(yīng)位置開有供微流體出入的導(dǎo)液孔。
(2) 以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧垸PDMS為芯片底片 材料，釆用濕法或干法刻蝕有流體混合和反應(yīng)微通道。
(3) 采用Y-MAPS雙官能團(tuán)試劑處理蓋片微通道。處理過程如下先用0.1MNaOH 溶液沖洗微管道；再用重蒸水沖洗至中性，并用50倍柱體積的丙酮沖洗干凈；然后將30 XV/V雙官能團(tuán)試劑y-MAPS丙酮溶液注入微通道中，密封，放置過夜；最后用去離子水 沖洗，干燥備用；
在(3)中的芯片微通道中，采用紫外光照原位聚合法制備聚甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理 整體柱，以隔離紫外光的掩膜控制整體柱的長度和位置，按75%制孔劑和25%預(yù)聚物比 例將反應(yīng)物泵入已經(jīng)活化處理的微通道內(nèi)，所述預(yù)聚物采用甲基丙烯酸丁酯BMA為功能 單體，二甲基乙二醇酯EDMA為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈A舊N引發(fā)劑，三者按mBMA: mEDMA :mA舊N為59.5X: 39.5%: 1%的質(zhì)量比例混合，致孔劑采用甲醇和乙醇，兩者按V甲醉 :V ^為1 : 1的體積比例混合，在365nm處以18w功率的紫外光在2 10cm照射距離 下照射2 6小時，得到聚甲基丙烯酸丁酯整體柱；
(4) 將(4)制備的蓋片與基片直接粘接封裝，得到微流控固相萃取預(yù)處理芯片。 本發(fā)明提出的微流控固相萃取芯片可用于血樣中藥物(如吩噻嗪類藥物等)的凈化
和富集。
本發(fā)明提出的微流控固相萃取預(yù)處理三維芯片具有具有制作簡便、成本低廉、高負(fù)載 量、低進(jìn)樣量、快速分析、體積小巧的優(yōu)點，適合復(fù)雜生化樣品樣品的預(yù)處理。其中采用 整體澆鑄法制備微通道具有制備簡單、成本低廉、操作方便等特點，且能克服芯片封裝中 封接難、漏液等問題。采用掩膜有效控制整體微柱位置和尺寸，將整體柱分離介質(zhì)合理地
鍵合到微流控芯片管道中。芯片蓋片中的預(yù)處理管道采用了雙官能團(tuán)試劑Y -MAPS對芯片 微通道進(jìn)行改性修飾，以改善芯片表面性質(zhì)，使固相萃取介質(zhì)材料與芯片微通道內(nèi)壁得到
有效鍵合。
本發(fā)明采用的甲基丙烯酸丁酯有機聚合物整體柱屬于疏水作用分離介質(zhì)材料，主要依 據(jù)物質(zhì)的極性來分離純化待測樣品，而通過改變洗脫溶劑的濃度及運行條件可以有效地獲 得良好的洗脫效率。與其他預(yù)處理整體柱相比，原位制備的甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體柱 克服了比表面積小、負(fù)載容量低、熱誘導(dǎo)聚合過程繁瑣、通透性不好，預(yù)處理效率不高等 不足，具有具有通透性好、柱壓低、機械強度高、分析速度快、直接進(jìn)行實際樣品分離、 富集的特點。
本發(fā)明提出的整體澆鑄法制備含固相萃取預(yù)處理單元的PDMS-玻璃微流控芯片，能明 顯改善預(yù)處理單元在微流控芯片上集成難的問題，且便于芯片上實現(xiàn)光度法、化學(xué)發(fā)光和 熒光定量檢測，是一種制備簡單、低成本、含樣品預(yù)處理單元的微流控固相萃取三維芯片， 其為微全分析系統(tǒng)集成化的發(fā)展提供更多的可能性。


圖1含原位聚合甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體柱的微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖2含原位聚合甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體柱的微流控芯片結(jié)構(gòu)蓋片示意圖3含原位聚合甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體柱的微流控芯片結(jié)構(gòu)基片示意圖中1.樣品入口； 2.試劑入口； 3.廢液出口；4.樣品進(jìn)入通道；5試劑進(jìn)入通道； 6混合反應(yīng)通道7蓋片；8基片；A-B.整體柱。
具體實施例方式
本發(fā)明提出的微流控固相萃取預(yù)處理芯片，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，整個芯片由基片8和 蓋片7直接封接而成，結(jié)構(gòu)尺寸為長(30mm) X寬(20mm) X高(3mm)。圖2中蓋 片厚度為1 2mm，蓋片中固相萃取預(yù)處理微通道(A-B整體柱)長為(5 10mm)，管 道直徑75 200um;圖3中基片厚度為1mm，基片中混合和反應(yīng)微通道尺寸為長(10 30mm) X寬(50 200um) X深(50 200 um)。
蓋片的結(jié)構(gòu)參見圖2，蓋片上設(shè)有樣品入口 1、試劑入口 2和廢液出口 3及畫相萃取 預(yù)處理微通道，采用PDMS整體澆鑄成型法制備而成，固相萃取預(yù)處理微通道內(nèi)采用紫外 光照原位聚合法制備有聚甲基丙烯酸丁酯類整體柱A-B，樣品入口 1設(shè)置在固相萃取預(yù)處 理微通道的入口端。
基片的結(jié)構(gòu)參見圖3，基片以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷 PDMS為基材，刻蝕有流體混合和反應(yīng)的微通道網(wǎng)絡(luò)，微通道網(wǎng)絡(luò)由樣品進(jìn)入通道4、試 劑進(jìn)入通道5共同連接混合反應(yīng)通道6構(gòu)成。
蓋片與基片粘接封裝后參見圖1，蓋片上的固相萃取預(yù)處理微通道末端與基片上的樣 品進(jìn)入通道4連通，蓋片上的試劑入口2連通基片上的試劑進(jìn)入通道5，蓋片上的廢液出 口 3位于基片上的混合反應(yīng)通道6末端。
按照圖1所設(shè)計的結(jié)構(gòu)制作目標(biāo)芯片。用95%的乙醇清洗玻璃片，以其作為基片， 按照PDMS涸化劑質(zhì)量比為10: 1配制PDMS澆鑄液，攪勻，靜置，除去氣泡，將其流 涎到玻璃片上，放置到9(TC烘箱中固化半小時，得到PDMS片，再將制做的模具固定在 上述PDMS片上，二次澆鑄成型得到樣品預(yù)處理芯片的蓋片。在對應(yīng)的出口和入口出制作 樣品進(jìn)出口通孔，得到目標(biāo)蓋片。采用玻璃片制作芯片底片，按照圖1中芯片結(jié)構(gòu)示意圖 制備刻蝕掩膜，按照標(biāo)準(zhǔn)玻璃濕法刻蝕工藝刻蝕所需深度的通道結(jié)構(gòu)；用乙醇清洗載玻片， 采用濕法刻蝕得到含混合和反應(yīng)微管道的基片。用0.1MNaOH溶液沖洗毛細(xì)管以活化管 道內(nèi)壁；用重蒸水沖洗至中性，并用50倍柱體積的丙酮沖洗干凈；然后將雙官能團(tuán)試劑 Y-MAPS丙酮(30%V/V)溶液注入微通道中，密封，放置過夜；最后用去離子水沖洗， 干燥備用。微管道分別采用NaOH、重蒸水、丙酮和雙官能團(tuán)試劑Y-MAPS丙醇(30% V/V)活化處理，干燥備用；按75%制孔劑(mBMA : m瞧m顯為59.5%: 39.5%: 1%) 和25X預(yù)聚物(V鴨V乙醉為1 : 1)比例將聚合液泵入已經(jīng)活化處理的微通道內(nèi)，在365nm 處以18w(功率)紫外光照下聚合4小時得到有機聚合物整體柱，用乙醇洗滌，于6(TC溫度 下干燥，待用。制得聚合整體柱的孔容可達(dá)到0.31cm2，g'1， BET比表面積達(dá)到365.72 m2 g—1， SEM測試圖譜顯示聚合物由3 5pm的微球和一定尺寸的微孔組成。 本芯片的使用實例
本微流控固相萃取三維芯片可通過光電倍增管(PMT)、電荷耦合器件(CCD)和光纖等方式 采集數(shù)據(jù)，與多種檢測方法集成。以血液中的鹽酸丙米嗪藥物為實測樣品，利用強酸性的 高錳酸鉀-乙二醛-丙米嗪化學(xué)發(fā)光體系進(jìn)行測定。樣品用注射微泵從預(yù)處理整體柱通道的 入口端進(jìn)樣，以2. OmLAiin的流速經(jīng)預(yù)處理整體柱，被測物質(zhì)被固相萃取材料吸附，用一 定體積的洗脫液沖洗整體柱，最后用樣品洗脫液將被測物質(zhì)從固相載體上洗脫下來；同時， 在反應(yīng)試劑入口端以同樣的速度泵入反應(yīng)試劑(發(fā)光試劑)，在反應(yīng)通道的末端檢測信號。
實驗結(jié)果顯示聚甲基丙烯酸丁酯類整體柱對血液中鹽酸丙米嗪有明顯的分離富集效果， 其富集倍數(shù)達(dá)到10倍以上，本設(shè)計芯片分析系統(tǒng)的檢出限可達(dá)到5X 10—8g/mL。
權(quán)利要求
1、一種含原位聚合甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體柱的三維微流控芯片，所述芯片由基片和蓋片封接而成，其特征在于所述蓋片設(shè)有樣品入口、試劑入口和廢液出口及固相萃取預(yù)處理微通道，采用PDMS整體澆鑄成型法制備而成，固相萃取預(yù)處理微通道內(nèi)采用紫外光照原位聚合法制備有聚甲基丙烯酸丁酯類整體柱，樣品入口設(shè)置在固相萃取預(yù)處理微通道的入口端；所述基片以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS為基材，刻蝕有流體混合和反應(yīng)的微通道網(wǎng)絡(luò)，微通道網(wǎng)絡(luò)由樣品進(jìn)入通道、試劑進(jìn)入通道共同連接混合反應(yīng)通道構(gòu)成；蓋片與基片粘接封裝后，蓋片上的固相萃取預(yù)處理微通道末端與基片上的樣品進(jìn)入通道連通，蓋片上的試劑入口連通基片上的試劑進(jìn)入通道，蓋片上的廢液出口位于基片上的混合和反應(yīng)通道末端。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維微流控芯片，其特征在于所述蓋片中固相萃取預(yù)處 理微通道長為5 10mm，微通道直徑75 200um，基片中混合和反應(yīng)微通道尺寸為長 10 30mmX寬50 200u mX深50 200 um。
3、 權(quán)利要求1所述的三維微流控芯片的制備方法，包括以下步驟(1) 蓋片采用TOMS整體澆鑄成型法制作，首先第一次澆鑄PDMS，于90。C烘箱內(nèi)固 化半小時左右得到厚度為0. 3 0. 5mm厚的PDMS膜層，再將直徑為75 200y m細(xì)金屬Pt 絲固定于上述PDMS膜層上，第二次澆鑄PDMS，在6(TC烘箱內(nèi)固化4小時得到含預(yù)處 理微通道的PDMS蓋片，并在與下述基片各微通道口對應(yīng)位置開有供微流體出入的樣品入 口、試劑入口和廢液出口；(2) 以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧垸PDMS為芯片基片材 料，采用濕法或干法刻蝕有流體混合和反應(yīng)的微通道網(wǎng)絡(luò)，微通道網(wǎng)絡(luò)尺寸為長10 30mmX寬5。 200u mX深50 200 um;(3) 采用y-MAPS雙官能團(tuán)試劑處理蓋片中微通道，處理過程如下先用0.1MNaOH 溶液沖洗微通道；再用重蒸水沖洗至中性，并用50倍柱體積的丙酮沖洗干凈；然后將30 XV/V雙官能團(tuán)試劑y-MAPS丙酮溶液注入微通道中，密封，放置過夜；最后用去離子水 沖洗，干燥備用；(4)在蓋片的微通道中，采用紫外光照原位聚合法制備聚甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體 柱，以隔離紫外光的掩膜控制整體柱的長度和位置，按75%制孔劑和25%預(yù)聚物比例將 反應(yīng)物泵入已經(jīng)活化處理的微通道內(nèi)，所述預(yù)聚物采用甲基丙烯酸丁酯BMA為功能單體， 二甲基乙二醇酯EDMA為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈A舊N引發(fā)劑，三者按mBMA : mEDMA : mA舊N為59.5。/^: 39.5%: 1%的質(zhì)量比例混合，致孔劑采用甲醇和乙醇，兩者按V甲醉V 乙醇為1 : 1的體積比例混合，在365nm處以18w功率的紫外光在2 10cm照射距離下照 射2 6小時，得到聚甲基丙烯酸丁酯整體柱；(5)將步驟(4)制備的蓋片與步驟(1)制備的基片直接粘接封裝，使蓋片上的固 相萃取預(yù)處理微通道末端與基片上的進(jìn)樣通道連通，蓋片上的試劑入口連通基片上的試劑 進(jìn)入通道，蓋片上的廢液出口位于基片上的混合反應(yīng)通道末端，即得到微流控固相萃取預(yù) 處理芯片。
全文摘要
本發(fā)明屬于微全分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種含原位聚合甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體柱的三維微流控芯片，在微流控芯片上的微通道內(nèi)采用紫外光照原位聚合法制備聚甲基丙烯酸丁酯類整體柱，微流控芯片的基片可采用玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS等為基材，刻蝕有流體混合和反應(yīng)的微通道網(wǎng)絡(luò)；蓋片采用整體澆鑄PDMS法制作集固相萃取預(yù)處理單元的微通道，在與基片各微通道口對應(yīng)位置開有供微流體出入的導(dǎo)液孔，并與基片直接鍵合，實現(xiàn)樣品預(yù)處理整體柱與微流控芯片微管道網(wǎng)絡(luò)一體化集成。本芯片具有制作簡便、成本低廉、進(jìn)樣量少、分離分析快速的優(yōu)點，適合復(fù)雜生化樣品樣品的預(yù)處理和分析測試。
文檔編號G01N33/48GK101358912SQ20081007030
公開日2009年2月4日 申請日期2008年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月17日
發(fā)明者張文品, 溢 徐, 徐平洲, 強 曹, 萍 曾 申請人:重慶大學(xué)