專利名稱：基于量子點標(biāo)記的免疫印跡檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種納米技術(shù)領(lǐng)域的蛋白質(zhì)檢測方法，具體說是一種基于量子點 標(biāo)記的免疫印跡檢測方法。
技術(shù)背景常規(guī)免疫印跡(Western Blots)是采用化學(xué)發(fā)光和輻射技術(shù)。應(yīng)用傳統(tǒng)的 有機熒光發(fā)色團的免疫印跡分析技術(shù)有其固有的局限性。低的熒光穩(wěn)定性使其很 難在長時間段成像，從而使檢測靈敏度低。因為不同的發(fā)色團需要不同波長激發(fā) 光源，而且需要很復(fù)雜的設(shè)計平臺，因此多通道技術(shù)也是不可能的。另外，染料 寬的發(fā)射光譜使得多通路互相重疊而產(chǎn)生干擾。量子點(QDs)特指半徑小于或接近激子波爾半徑的半導(dǎo)體納米顆粒，大小均 勻的半導(dǎo)體量子點發(fā)射光譜窄且具有尺寸"調(diào)諧"特性，用單個波長即可激發(fā)不 同的量子點，熒光量子產(chǎn)率高，穩(wěn)定性好，具有很好的生物相容性等優(yōu)點。而且 近年來量子點豐富的光學(xué)特性及其在生物學(xué)標(biāo)識方面巨大的研究和應(yīng)用價值逐 步被看好。量子點獨特的光學(xué)性能使得連接有蛋白或者二抗的量子點可以作為免 疫印跡的優(yōu)良的熒光成像劑。量子點光穩(wěn)定性的增強有利于信號穩(wěn)定性以及高質(zhì) 量的分析。另外，寬的吸收峰和窄的發(fā)射峰使得在一個簡單的系統(tǒng)中多色多通道 成為可能。單一、便宜的紫外激發(fā)光源激發(fā)就可以得到490 nm到680 nm范圍的發(fā)射波長。量子點基礎(chǔ)上的免疫印跡不但可以多色檢測，而且價錢便宜，并具有以下優(yōu) 點光穩(wěn)定性增加，高靈敏度，與現(xiàn)有化學(xué)發(fā)光方法比較靈敏度高或者相當(dāng)；多 通道，大容量；線性強，提高蛋白表達量；比增強型化學(xué)發(fā)光試劑(ECU便宜； 與現(xiàn)有的成像系統(tǒng)相容，不用專用設(shè)備；不用暗室，膠片，不用沖洗，節(jié)約時間 和成本；不用脫模；多色檢測，可以在同一個檢測窗口觀察到多個抗體的存在并決定他們的濃度，比單色檢測降低成本。用量子點標(biāo)記的免疫印跡檢測方法，分 析轉(zhuǎn)換信號可以大大加速并且提高靈敏度和準確度。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，Richard L 0rnberg等在《Nature Methods》 (自然方法) 2, 79 - 81 (2005)上發(fā)表，Western blot analysis with quantum dot fluorescence technology: a sensitive and quantitative method for multiplexed proteomics (用量子點的一光技術(shù)進行免疫印跡分析靈敏、定量 的多元檢測方法)。該文是在同一個檢測點用多種量子點標(biāo)記進行多元蛋白質(zhì)和 蛋白質(zhì)狀態(tài)定量檢測，要求不同波長的量子點同時應(yīng)用，且定量分析。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于量子點標(biāo)記的免疫印 跡檢測方法，使其利用量子點的熒光特性，將其與抗體偶聯(lián)，直接進行蛋白免疫 印跡檢測，可以大大加速并且提高靈敏度和準確度。本發(fā)明是簡單直接的定性分 析方法，更簡單易行，適用于非定量蛋白質(zhì)及其功能檢測。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明采用聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE),被檢測物是蛋白質(zhì)，"探針"是抗體，"顯色"用量子點標(biāo)記的二抗。 經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相 載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性 不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與 量子點標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，在紫外燈下，量子點發(fā)射熒光以檢測電泳分離的 特異性目的基因表達的蛋白成分。用簡單紫外成像系統(tǒng)配備不同的濾光片可以得 到免疫印跡圖像。本發(fā)明方法具體包括以下步驟第一步.量子點與抗體的連接將表面帶有羧基的量子點分散在硼酸鹽緩沖溶液(PH=9. 18)中，加入硫化 二亞胺(EDC)和二抗，漩渦混合振蕩均勻，在室溫下反應(yīng)。反應(yīng)溶液離心，用磷 酸緩沖溶液多次洗滌，得到量子點和二抗連接物(量子點標(biāo)記的二抗)。第一步中，在室溫下反應(yīng)時間為3小時。第一步中，所述硼酸鹽緩沖溶液，其pH二9. 18;所述磷酸緩沖溶液，其濃度 為0. 1M， pH=7. 8。第一步中，所述恒流轉(zhuǎn)膜，是指60mA恒流轉(zhuǎn)膜2小時。 第二步.免疫印跡過程電轉(zhuǎn)移將電泳后的膠平鋪在經(jīng)甲醇浸泡后的PVDF (聚偏二氟乙烯)膜上, 夾在六層濾紙中間，放到半干式電轉(zhuǎn)儀上，恒流轉(zhuǎn)膜；免疫反應(yīng)將轉(zhuǎn)好的膜放到TBST溶液中清洗，加入含5。/。脫脂奶粉的TBST溶液 中，搖床封閉，之后加入l: 1000稀釋的單抗，搖床孵育，TBST溶液清洗兩次， 加入l: 500稀釋的量子點標(biāo)記的二抗，在避光條件下孵育，TBST清洗三次；拍照直接將反應(yīng)后的膜在凝膠成像系統(tǒng)中成像，利用量子點在紫外光照射下發(fā)射熒光的性能，得到免疫印跡圖像。第二步中，將轉(zhuǎn)好的膜放到TBST溶液中清洗，其時間為10min。 第二步中，搖床封閉是指37'C搖床封閉1小時。 第二步中，TBST溶液清洗兩次，每次5分鐘。第二步中，在避光條件下37°。孵育60分鐘，TBST清洗3次，每次5分鐘。本發(fā)明所選用的量子點根據(jù)其尺寸大小，發(fā)射波長可以是520nm(綠色)，560 (橙黃色)，600nm(橙色)，和620nm (紅橙色)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明是基于標(biāo)準的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和免疫印 跡過程進行的，利用納米量子點的熒光性能，不用傳統(tǒng)的顯色、顯影、定影、涼 干等照片洗印過程，直接成像，不但價錢便宜，而且光穩(wěn)定性增加，與現(xiàn)有化學(xué) 發(fā)光方法比較靈敏度高或者相當(dāng)；與現(xiàn)有的成像系統(tǒng)相容，不用專用設(shè)備；不用 暗室，膠片，不用沖洗，節(jié)約時間和成本，且檢測的靈敏度有所提高。
具體實施方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下 進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限 于下述的實施例。用量子點標(biāo)記的免疫印跡檢測方法檢測BRCAA1蛋白表達情況。 將表面帶有羧基的量子點(發(fā)射波長為520nm (綠色)，600nm(橙色)，620nm (紅橙色)和680 nm (紅色))分散在硼酸鹽緩沖溶液(ph=9. 18)中，加入硫化 二亞胺(EDC)和羊抗兔二抗，漩渦混合振蕩均勻，在室溫下反應(yīng)3小時。反應(yīng)溶液 高速離心，用磷酸緩沖溶液(PBS， 0. 1M， pH^.8)多次洗滌，得到量子點標(biāo)記的二抗復(fù)合物。將含有目標(biāo)蛋白(BRCAA1)的質(zhì)粒進行細胞轉(zhuǎn)染。細胞總蛋白提取在細胞 培養(yǎng)皿中加入200ul RIPA裂解液，用細胞刮刀收集細胞，將所有液體轉(zhuǎn)入一個滅 菌的離心管中。用槍頭來回抽打10次，12000RPM4。C離心5min，將上清移至另一 滅菌的離心管中，備用。丙烯酰胺蛋白電泳配制10%分離膠與4%濃縮膠，安裝好垂直電泳膠板后灌 膠，先灌分離膠，等分離膠完全凝固后灌濃縮膠，并插上梳子。濃縮膠完全凝固 后拔出梳子，安裝好電泳裝置，取提取好的蛋白上清與2XSDS蛋白上樣緩沖液混 合均勻，于沸水中水浴3分鐘以使蛋白完全變性。用微量上樣器進行上樣每孔上 樣20ul。先60V恒壓進行電泳，直到蛋白完全跑出濃縮膠后將電壓設(shè)為80V，直至 溴酚藍跑出分離膠時停止電泳。電轉(zhuǎn)移:將電泳后的膠平鋪在經(jīng)甲醇浸泡后的PVDF膜上，夾在六層濾紙中間， 放到半干式電轉(zhuǎn)儀上，60mA恒流轉(zhuǎn)膜2小時。免疫反應(yīng)將轉(zhuǎn)好的膜放到TBST溶液(25mM Tris-Cl， 150mM NaCl， 0.05 %Tween20 ， pH7. 2)中清洗10min;加入含5。/D脫脂奶粉的TBST溶液中，37。C搖床封 閉l小時；之后加入l: IOOO稀釋的兔抗人BRCAAI抗體，37。C搖床孵育l小時；TBST 溶液清洗兩次，每次5分鐘；加入l: 500稀釋的量子點標(biāo)記的羊抗兔二抗復(fù)合物， 在避光條件下于37'C孵育60分鐘；TBST清洗3次，每次5分鐘。拍照直接將反應(yīng)后的膜在凝膠成像系統(tǒng)中成像，可以明顯看到在140KDa 處，BRCAA1的亮的條帶。本發(fā)明以連接有二抗的量子點作為免疫印跡的優(yōu)良的熒光成像劑，可以大大 加速并且提高靈敏度和準確度。
權(quán)利要求
1、一種基于量子點標(biāo)記的免疫印跡檢測方法，其特征在于，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，探針是抗體，顯色用量子點標(biāo)記的二抗，經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與量子點標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，在紫外燈下，量子點發(fā)射熒光以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分，用簡單紫外成像系統(tǒng)配備濾光片得到免疫印跡圖像。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的基于量子點標(biāo)記的免疫印跡檢測方法，其特征是，包括以下步驟第一步.量子點與抗體的連接將表面帶有羧基的量子點分散在硼酸鹽緩沖溶液中，加入硫化二亞胺和二 抗，漩渦混合振蕩均勻，在室溫下反應(yīng)，反應(yīng)溶液離心，用磷酸緩沖溶液多次洗 滌，得到量子點和二抗連接物，即量子點標(biāo)記的二抗；第二步.免疫印跡過程電轉(zhuǎn)移將電泳后的膠平鋪在經(jīng)甲醇浸泡后的聚偏二氟乙烯膜上，夾在六層 濾紙中間，放到半干式電轉(zhuǎn)儀上，恒流轉(zhuǎn)膜；免疫反應(yīng)將轉(zhuǎn)好的膜放到TBST溶液中清洗，加入含5Q/。脫脂奶粉的TBST溶液 中，搖床封閉，之后加入l: 1000稀釋的單抗，搖床孵育，TBST溶液清洗兩次， 加入l: 500稀釋的量子點標(biāo)記的二抗，在避光條件下孵育，TBST清洗三次；拍照直接將反應(yīng)后的膜在凝膠成像系統(tǒng)中成像，利用量子點在紫外光照射下發(fā)射熒光的性能，得到免疫印跡圖像。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的基于量子點標(biāo)記的免疫印跡檢測方法，其特 征是，所選用的量子點，其發(fā)射波長是520nm、 560 nm、 600nm和620nm中的一種。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于量子點標(biāo)記的免疫印跡檢測方法，其特征是， 第一步中，在室溫下反應(yīng)時間為3小時。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的基于量子點標(biāo)記的免疫印跡檢測方法，其特征是，第一步中，所述硼酸鹽緩沖溶液，其P^9. 18;所述磷酸緩沖溶液，其濃度為O. 1M， pH=7. 8。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的基于量子點標(biāo)記的免疫印跡檢測方法，其特征 是，第一步中，所述恒流轉(zhuǎn)膜，是指60mA恒流轉(zhuǎn)膜2小時。
7、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于量子點標(biāo)記的免疫印跡檢測方法，其特征是， 第二步中，將轉(zhuǎn)好的膜放到TBST溶液中清洗，其時間為10min。
8、 根據(jù)權(quán)利要求2或7所述的基于量子點標(biāo)記的免疫印跡檢測方法，其特征 是，第二步中，搖床封閉是指37'C搖床封閉1小時。
9、 根據(jù)權(quán)利要求2或7所述的基于量子點標(biāo)記的免疫印跡檢測方法，其特征 是，第二步中，TBST溶液清洗兩次，每次5分鐘。10、 根據(jù)權(quán)利要求2或7所述的基于量子點標(biāo)記的免疫印跡檢測方法，其特征 是，第二步中，在避光條件下37。C孵育60分鐘，TBST清洗3次，每次5分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于量子點標(biāo)記的免疫印跡檢測方法，首先將帶有羧基或者氨基的量子點通過化學(xué)反應(yīng)與二抗相連接，形成量子點標(biāo)記的復(fù)合物；采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，探針是抗體，顯色用量子點標(biāo)記的二抗。經(jīng)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與量子點標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，在紫外燈下，量子點發(fā)射熒光以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。用簡單紫外成像系統(tǒng)配備濾光片得到免疫印跡圖像。本發(fā)明以連接有二抗的量子點作為免疫印跡的優(yōu)良的熒光成像劑，可以大大加速并且提高靈敏度和準確度。
文檔編號G01N33/561GK101241140SQ200810034559
公開日2008年8月13日 申請日期2008年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月13日
發(fā)明者崔大祥, 蓉 賀, 峰 高 申請人:上海交通大學(xué)