專利名稱：：前列腺癌的惡性程度判定試劑盒和其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于判定(診斷)前列腺癌的惡性程度從而預(yù)測(cè)患者的預(yù)后的判定試劑盒和判定法。
背景技術(shù)：
：LAT1基因是癌胚基因，在1998年由金井等人分離(Kanai，Y.，Segawa，H.，Miyamoto,K.，Uchino，H.，Takeda，E.，Endou，H.:ExpressionCloningandCharacterizationofaTransporterforLargeNeutralAminoAcidsActivatedbytheHeavyChainof4F2Antigen.J.Biol.Chem273(37):23629-23632，1998)。LATl基因，編碼具有L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的44KD的12次跨膜型蛋白質(zhì)，在與1次跨膜蛋白4F2hc(也稱為CD98)共存時(shí)，顯示Na+非依賴性地轉(zhuǎn)運(yùn)亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、組氨酸等大型中性氨基酸的經(jīng)典的L轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的活性。LAT1和4F2hc蛋白可以認(rèn)為是通過半光氨酸-半光氨酸鍵而結(jié)合。LAT1基因被證實(shí)在來源于癌的培養(yǎng)細(xì)胞、胎肝中高量表達(dá)，在正常組織中僅在腦、胎盤、睪丸、骨髓等有限的部位表達(dá)(Yanagida，O.，Kanai，Y，Chairoungdua，A.，.Kim，D，Kyung.，Segawa，H.，Nii，T.，Cha，S，Ho.，Matsuo，H.，F(xiàn)ukushima，J.，F(xiàn)ukasawa，Y.，Tani，Y.，Taketani，Y.，Uchino，H.，Kim，J,Young.，Inatomi，J.，Okayasu，I,，Miyamoto,K.，Takeda，E.，Goya，T.，Endou，H.:HumanL-typeaminoacidtransporter1(LATl):characterizationoffunctionandezpressionintumorcelllines.BiochimicaetBiophysicaActa1514:291-302，2001)。與此相對(duì)，4F2hc基因則在幾乎全部的正常組織和癌細(xì)胞等中廣泛地分布。LATl的同系物L(fēng)AT2(Segawa，H.，F(xiàn)ukasawa，Y.，Miyamoto,K.，Takeda，E.，Endou，H.，Kanai，Y.:IdentificationandFunctionalCharacterizationofaNa+independentNeutralAminoAcidTransporterwithBroadSubstrateSelectivity.J.Biol.Chem274(28):19745-19751，1999)與LAT1蛋白有50%氨基酸同源性，關(guān)于LAT2基因的人組織分布，在所調(diào)査的所有組織中存在。因此，LAT1可以稱為癌胚性的各種L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，LAT2可以稱為正常型的各種L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。作為L(zhǎng)AT的活性化因子的4F2hc幾乎在全部的組織中分布，癌組織與正常組織沒有區(qū)別。然而，前列腺癌從世界范圍看是發(fā)病頻度高的癌癥，在美國男性的癌癥中患病率是第l位，死亡率是第2位。即使在日本，前列腺癌患者數(shù)近年來也有增加的趨勢(shì)，在1975年一年間的2千人左右的患者數(shù)在2000年則報(bào)告了約2萬人，預(yù)計(jì)在2020年將達(dá)到約8萬人，在男性的癌癥中僅次于肺癌，患病率達(dá)到第2位。另外，預(yù)測(cè)由前列腺癌導(dǎo)致的死亡數(shù)在2020年將達(dá)到現(xiàn)在的1.4倍，預(yù)計(jì)在美國死亡率變?yōu)榈?位(日本臨床增刊號(hào)60;44-48，2002;前列腺疾患的臨床)。作為前列腺癌的診斷法，血中PSA值的早期發(fā)現(xiàn)、篩選方法是著名的，并被廣泛使用，但是該方法對(duì)癌癥沒有特異性，已知即使在前列腺肥大、前列腺炎時(shí)也會(huì)升高。另外，在近年，也有報(bào)道稱血中PSA僅簡(jiǎn)單地與前列腺的大小成比例。通常，若確認(rèn)血中PSA值為高值，則通過直腸指診確認(rèn)前列腺的大小、硬度等。在通過上述檢查強(qiáng)烈地懷疑發(fā)生前列腺癌時(shí)，提取活組織進(jìn)行檢查，通過蘇木素伊紅(Hematoxylineosin)染色，進(jìn)行組織病理學(xué)的診斷。在該診斷中，通過異形度(gradeofatypism)、分化度等診斷細(xì)胞的狀態(tài)，判斷其惡性的程度。在組織病理學(xué)的診斷中，Gleasons分類是前列腺癌特有的異形度分類，是根據(jù)異形度的程度按評(píng)分15的5級(jí)進(jìn)行分級(jí)的方法，近年來，該方法正成為對(duì)決定治療方法有著非常大的影響的診斷法。作為使用手術(shù)時(shí)摘出的材料進(jìn)行的診斷，基于TMN分類(T:原發(fā)腫瘤，N:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，M:遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移)的診斷被認(rèn)為是有效的。這些診斷法，特別是Gleasons分類，作為前列腺癌的預(yù)后判定方法被廣泛地使用，其與預(yù)后的聯(lián)系也有報(bào)告，但是現(xiàn)狀是在相關(guān)的領(lǐng)域中，為了更加精度高的診斷和治療，期待在Gleasons分類、TMN分期之外增加4新的診斷法，特別是期待分子標(biāo)記的出現(xiàn)。另外，如上所述，TMN分類等如上所述是使用在手術(shù)時(shí)摘出的材料的診斷法，因此難以對(duì)早期癌癥的惡性程度進(jìn)行診斷。專利文獻(xiàn)1日本特開平11-299489號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2日本特開2000-157286號(hào)公報(bào)因此，本發(fā)明的目的在于，提供在Gleasons分類、TMN分類之外作為新的診斷法的分子標(biāo)記的方法，同時(shí)提供通過與在手術(shù)前的早期階段使用活體檢驗(yàn)材料的Gleasons分類組合，即使不使用手術(shù)時(shí)摘出的材料而使用細(xì)胞針檢查所提取的材料時(shí)，也能夠以更高精度且容易地判定前列腺癌的惡性程度的方法。發(fā)、明內(nèi)容為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明人等首先著眼于在來源于癌的培養(yǎng)細(xì)胞、胎肝中特異性表達(dá)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體LAT1。然后，在將該LAT1作為分子標(biāo)記，研究使該LAT1顯現(xiàn)化的各種手法時(shí)發(fā)現(xiàn)，某種方法即使在使用基于細(xì)胞針檢查提取的試樣時(shí)，對(duì)于判定前列腺癌細(xì)胞的惡性程度特異性地有效，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明(1)是含有抗人LAT1單克隆抗體、通過免疫組織化學(xué)染色用于判定前列腺癌的惡性程度的試劑盒。在此，該抗人LAT1單克隆抗體只要是可以特異性地識(shí)別LAT1的抗體就沒有特別的限制，例如，可列舉特異性地識(shí)別人LAT1的從細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的N末端部位幵始1~52位的氨基酸殘基(MetAlaGlyAlaGlyProLysArgArgAlaLeuAlaAlaProAlaAlaGluGluLysGluGluAlaArgGluLysMetLeuAlaAlaLysSerAlaAspGlySerAlaProAlaGlyGluGlyGluGlyValThrLeuGinArgAsnlieThrLeu)的抗體(例如小鼠抗人LAT1單克隆抗體)。此外，人LAT1的氨基酸序列和堿基序列在日本特幵2000-157286號(hào)公報(bào)中記載。另外，針對(duì)本說明書中的"惡性程度"，將由于癌的原因造成患者死亡的癌設(shè)定為惡性程度高的癌，將即使診斷為癌也不會(huì)以癌為直接原因造成死亡的癌設(shè)定為惡性程度低的癌。在此，抗人LAT1單克隆抗體，只要是以LATl為抗原與該抗原結(jié)合就沒有特別的限制，可以適當(dāng)?shù)氖褂眯∈罂贵w、大鼠抗體、兔抗體、羊抗體等。另外，產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，基本上可以使用公知技術(shù)，按以下所述制作。即可以通過如下方法制作將所需的抗原、表達(dá)所需的抗原的細(xì)胞作為致敏性抗原來使用，將其按照通常的免疫方法進(jìn)行免疫，利用通常的細(xì)胞融合法使得到的免疫細(xì)胞與公知的母細(xì)胞融合，利用通常的篩選法，篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞(雜交瘤)。雜交瘤的制作，例如可以依照Milstein等的方法(Kohler.G.andMilstein，C.，MethodsEnzymol.(1981)73:3-46)等進(jìn)行。在制作抗人LAT1單克隆抗體時(shí)，可以將LAT1或其蛋白質(zhì)的片斷作為抗原使用，另外>可以將表達(dá)LAT1或其蛋白質(zhì)的片斷的細(xì)胞作為抗原使用。此外，LAT1或其蛋白質(zhì)的片斷，例如可以依照"《MolecuarCloning:ALaboratoryManual》第2版第1-3巻Sambrook，J.等著，ColdSpringHarberLaboratoryPress出版，紐約1989年"中記載的方法取得。另外，表達(dá)LATl或其蛋白質(zhì)的片斷的細(xì)胞也可以依照"《MolecuarCloning:ALaboratoryManual》第2版第1-3巻Sambrook，J.等著，ColdSpringHarberLaboratoryPress出版,紐約1989年"中記載的方法取得。該試劑盒，例如可以含有其他以下的構(gòu)成要素。(1)與抗人LAT1單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的經(jīng)過氧化物酶標(biāo)記的抗體(2)抑制內(nèi)源性的過氧化物酶的過氧化物(peroxide)(3)由氧化導(dǎo)致顯色的氧化還原色素(4)用于使抗原蛋白(LATl)和抗體易于結(jié)合的活化試劑(5)抑制組織中的LATl以外的蛋白與抗體的非特異性的結(jié)合的阻滯劑(6)在各步驟中除去附著于標(biāo)本的試劑的洗滌劑這里，對(duì)于(3)的氧化還原色素來說，有多個(gè)能夠進(jìn)行強(qiáng)度測(cè)定的信號(hào)(例如熒光)，然而重要的是能夠在可見光區(qū)域確認(rèn)變色。這是因?yàn)?，雖然原理不明確，但是在其他信號(hào)時(shí)，即使使用本發(fā)明涉及的抗人LATl單克隆抗體，也不能明確地區(qū)別惡性的前列腺癌和良性的前列腺癌。另一方面，通過使用本發(fā)明涉及的抗人LAT1單克隆抗體且與能夠在可見光區(qū)域確認(rèn)變色的試劑組合(免疫組織化學(xué)染色)，就可以明確地區(qū)別惡性的前列腺癌和良性的前列腺癌。本發(fā)明(2)是包含將抗人LAT1單克隆抗體應(yīng)用于供試品組織的工序的、基于免疫組織化學(xué)染色的前列腺癌的惡性程度判定方法。在此，該方法可以包括其他以下工序中的任一者或者全部。-將過氧化物應(yīng)用于供試品組織的工序-將供試品組織在活化試劑中浸漬，實(shí)施微波處理的工序-將阻滯劑應(yīng)用于供試品組織的工序-應(yīng)用與抗人LATl單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的標(biāo)記化抗體的工序-應(yīng)用由氧化導(dǎo)致顯色的氧化還原色素的工序-根據(jù)情況，將一抗陰性對(duì)照應(yīng)用于供試品組織的工序本發(fā)明(3)包括通過上述發(fā)明(2)的方法判定前列腺癌的惡性程度的工序、以及基于上述診斷結(jié)果決定是否投與前列腺治療藥的工序的、鑒別適于LAT1分子靶向治療藥使用的前列腺癌病例的方法。圖1是示出人活體細(xì)胞的前列腺癌細(xì)胞的染色的外觀的圖。圖2是示出基于本發(fā)明的診斷法的染色結(jié)果的判定例的圖。圖3是示出特異性試驗(yàn)的結(jié)果的圖。圖4是示出靈敏度試驗(yàn)的結(jié)果的圖。圖5是示出同時(shí)再現(xiàn)性(simultaneousrepeatability)試驗(yàn)的結(jié)果的圖。圖6是示出確認(rèn)基于使用了各種標(biāo)本的抗LAT1抗體的染色性的結(jié)果的圖。圖7是示出使用了Kaplan-Meire法的LAT1評(píng)分中的生存分析的結(jié)果的圖。圖8是示出基于斯寧庫勞普(X二-々口-:0的方法的LAT1評(píng)分與生存期關(guān)系的圖。圖9是示出PSA與LAT1評(píng)分的比較結(jié)果的圖。圖10是示出與Stage分類的比較結(jié)果的圖。圖11是示出與Gleasons評(píng)分的比較結(jié)果的圖。說明書第6/17頁具體實(shí)施例方式本具體實(shí)施方式的診斷試劑，是鑒別前列腺癌細(xì)胞以及診斷癌細(xì)胞的增殖程度(惡性程度)的體外診斷用試劑盒。本試劑盒含有作為反應(yīng)主試劑的一抗，包含6種試劑。對(duì)測(cè)定原理進(jìn)行簡(jiǎn)述，在癌細(xì)胞中表達(dá)的LAT1，是具有507個(gè)氨基酸殘基、具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞增殖所需要的必需氨基酸的功能的、12次跨細(xì)胞膜型的功能性蛋白質(zhì)。在本具體實(shí)施方式的診斷法中使用的一抗(抗人/小鼠單克隆IgG抗體)是特異性地識(shí)別LAT1的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的從N末端部位開始152位的氨基酸殘基的抗體。此外，對(duì)于本序列，通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索在人的基因中具有相同序列的蛋白，結(jié)果只檢索到LAT1。本發(fā)明的診斷試劑的對(duì)象檢查標(biāo)本，是前列腺癌活組織檢查材料的福爾馬林固定-石蠟包埋標(biāo)本的組織切片。作為檢測(cè)法次序，使用通常的供病理診斷的經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋的病理組織標(biāo)本，以一般的免疫組織化學(xué)的手法進(jìn)行。即，將經(jīng)石蠟包埋的標(biāo)本與本抗體反應(yīng)后，使用多聚物試劑(二抗)和染色試劑進(jìn)行染色，以光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察(圖1)。此外，圖1中，被染色的部位為惡性的癌細(xì)胞。對(duì)檢測(cè)的原理進(jìn)行說明，抗LAT1抗體(一抗)結(jié)合于在細(xì)胞膜中表達(dá)的LAT1上，進(jìn)而與多聚物試劑形成復(fù)合體。進(jìn)而，多聚物試劑的HRP與顯色試劑反應(yīng)，呈褐色。本抗體與LAT1的親和性極強(qiáng)，使用本法時(shí)，由于其高靈敏度檢測(cè)和選擇性，可以進(jìn)行從初期的癌細(xì)胞(LAT1的初期表達(dá))至晚期癌細(xì)胞(LAT1過度表達(dá))的癌的鑒別，以及可以半定量地識(shí)別LAT1的表達(dá)量，作為其應(yīng)用結(jié)果，可以評(píng)價(jià)腫瘤的進(jìn)展程度(惡性程度)。實(shí)施例<制造例1一抗的制造例>在一抗中以2|ig/mL蛋白量含有小鼠抗人L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(hLATl)單克隆抗體。該抗體為，將采用體外翻譯(invitrotranslation)法通過hLATl克隆載體合成的hLATl的1-52位的蛋白作為抗原，對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，使其脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓腫瘤細(xì)胞融合從而得到的雜交瘤，將該雜交瘤接種到小鼠腹腔內(nèi)，從所得的腹水中通過硫酸銨分級(jí)分離和G蛋白偶聯(lián)柱層析進(jìn)行純化，再溶解于含有1%牛血清白蛋白的10mMPBS(pH7.4)中而成的抗體。此外，編碼LAT1的氨基酸序列和該蛋白質(zhì)的堿基序列在日本特開2000-157286號(hào)公報(bào)中記載。<制造例2判定試劑盒的構(gòu)成例>本制造例的判定試劑盒，包含以下的6種試劑。-阻滯試劑將正常豬血清稀釋至2%從而調(diào)制?！箤⑿∈罂筁AT1單克隆抗體(制造例1)用緩沖液(in/。BSA，0.25%酪蛋白鈉，15mM疊氮化鈉，0.1%吐溫20)稀釋至2i^g/mL從而調(diào)制。-多聚物試劑使用Nichirei制HistofmesimplestainMAX-PO(M)(商標(biāo))。此外，該試劑含有4昭/mL過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體(Fab')。-一抗陰性對(duì)照將小鼠IgG(載體文庫(VectorLaboratories))在上述緩沖液中溶解，調(diào)配成2|ig/mL。-基質(zhì)緩沖液將三羥甲基氨基甲烷(Tris[hydroxylmethyl]aminomethane)和三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris[hydroxylmethyl]aminomethanechloride)用純水稀釋，從而調(diào)制。-顯色基質(zhì)將DAB(3-3，二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(3-3，Di咖inobendinetetrahydrochloride))在緩沖液(上述的基質(zhì)緩沖液)中溶解，調(diào)成0.2mg/mL。進(jìn)而，本制造例的判定試劑盒可以含有在染色中使用的以下的試劑。-內(nèi)源性過氧化物酶阻滯試劑1%11202/甲醇將過氧化氫水用甲醇稀釋至1%。-活化試劑0.01M檸檬酸緩沖液(pH6.0)將檸檬酸一水合物(0.36g)、檸檬酸三鈉鹽二水合物(2.44g)在蒸餾水中溶解，調(diào)制為1L。-洗滌液PBS將磷酸氫二鈉12水合物(2.90g)、磷酸二氫鈉二水合物(0.296g)、氯化鈉(8.5g)在蒸餾水中溶解，調(diào)制成1L。若對(duì)以上進(jìn)行整理，本制造例中的診斷試劑盒的構(gòu)成試劑(必需的6種)為以下的表l中所示的試劑。表1本制造例的診斷用試劑盒的構(gòu)成試劑的一例<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><操作方法和判定方法>1.操作方法表2中示出操作手法的概要。表2免疫組織化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>l-l.手工操作方法將供試品組織切片脫石蠟后，在染色皿中浸漬于內(nèi)源性過氧化物酶阻滯試劑中，在室溫處理30分鐘后，進(jìn)行水洗。除去標(biāo)本的剩余的水分，將其浸漬于激活化試劑中，再微波處理5分鐘。處理后充分冷卻至室溫之后，進(jìn)行水洗，進(jìn)一步用洗滌液進(jìn)行洗滌。除去標(biāo)本的剩余的水分，在組織切片上滴入足夠量的阻滯試劑使其充分地散布于標(biāo)本，在濕潤(rùn)箱中室溫反應(yīng)30分鐘。除去標(biāo)本的剩余的水分，滴入足夠量的一抗，在濕潤(rùn)箱中室溫反應(yīng)l小時(shí)后，用洗滌液進(jìn)行洗滌(5分鐘，3次)。在陰性對(duì)照用供試品組織切片中，滴入足夠量的一抗陰性對(duì)照以代替一抗，進(jìn)行同樣地處理。除去標(biāo)本的剩余的水分，滴入足夠量的多聚物試劑，在濕潤(rùn)箱中室顯反應(yīng)30分鐘，用洗滌液進(jìn)行洗滌(5分鐘，3次)。除去標(biāo)本的剩余的水分，對(duì)供試品滴入一定量的基質(zhì)溶液或者浸漬基質(zhì)溶液，濕潤(rùn)箱中，或者在染色皿中室溫反應(yīng)15分鐘后，用洗滌液進(jìn)行洗滌。將標(biāo)本用對(duì)比染色液(例梅(Mayer)氏蘇木素液)染色后，進(jìn)行水洗。用醇類進(jìn)行脫水，以二甲苯置換后，封固，用于鏡檢。1-2.采用自動(dòng)免疫染色裝置的操作方法將供試品組織切片、阻滯試劑、一抗、一抗陰性對(duì)照、多聚物試劑、基質(zhì)溶液、蒸餾水、洗滌液、對(duì)比染色液設(shè)置于機(jī)器的規(guī)定的位置，使各試劑分別以規(guī)定時(shí)間、室溫、在濕潤(rùn)狀態(tài)下反應(yīng)。用醇類脫除供試品的水分，再用二甲苯進(jìn)行置換后，封固，用于鏡檢。2.判定法以低倍率(物鏡4倍)進(jìn)行觀察確認(rèn)整體的染色狀態(tài)后，在供試品組織中的腫瘤組織的中，對(duì)染色強(qiáng)度最高的部分以高倍率(物鏡10倍~40倍)進(jìn)行觀察，按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分(圖2)。a)評(píng)分0LAT1過度表達(dá)無染色圖案未確認(rèn)腫瘤組織的細(xì)胞膜上呈LAT1陽性的細(xì)胞(圖2a)。b)評(píng)分lLAT1過度表達(dá)無染色圖案:確認(rèn)腫瘤組織中的細(xì)胞膜上呈LAT1陽性的細(xì)胞存在多個(gè)，但是染色強(qiáng)度弱(圖2b)。c)評(píng)分2LAT1過度表達(dá)無染色圖案腫瘤組織中的細(xì)胞膜上呈中等程度的LAT1陽性細(xì)胞有多個(gè)。染色強(qiáng)度在評(píng)分1與評(píng)分3中間(圖2c)。d)評(píng)分3LAT1過度表達(dá)有染色圖案腫瘤組織中的細(xì)胞膜上呈強(qiáng)LAT1陽性的細(xì)胞存在多個(gè)，在各腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜整體上可以確認(rèn)清晰的線圈狀染色('圖2d)。<試驗(yàn)例1品質(zhì)確認(rèn)試驗(yàn)>對(duì)用于確認(rèn)判定試劑盒的品質(zhì)的對(duì)照切片(來自顯示LAT1蛋白過度表達(dá)的前列腺癌的培養(yǎng)細(xì)胞，PC3株)，基于以下的方法進(jìn)行a)特異性試驗(yàn)，b)靈敏度試驗(yàn)和c)同時(shí)再現(xiàn)性試驗(yàn)。此外，在含有本試驗(yàn)例的以后的試驗(yàn)例中，基本上以上述<制造例2>和<判定法>中記載的條件進(jìn)行實(shí)施，對(duì)于采用與這些不同的條件進(jìn)行實(shí)施之處，已用其他方式特別說明。a)特異性試驗(yàn)使用制造例2的判定試劑盒，將對(duì)照切片(來自前列腺癌的培養(yǎng)細(xì)胞PC3的石蠟切片標(biāo)本)依照上述"操作方法"進(jìn)行染色，比較/討論判定試劑盒中的一抗與一抗陰性對(duì)照的染色結(jié)果。將染色結(jié)果根據(jù)上述"判定法"的標(biāo)準(zhǔn)以評(píng)分0評(píng)分3實(shí)施評(píng)分化(表3)。在任一試驗(yàn)供試品試劑盒中，對(duì)照切片的結(jié)果均為評(píng)分3(圖3)。表3使用一抗的染色結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>根據(jù)以上的結(jié)果，使用一抗的情況下，觀察與各試驗(yàn)對(duì)照病理組織標(biāo)本的LAT1蛋白表達(dá)相對(duì)應(yīng)的特異染色圖像，確定試驗(yàn)供試品的染色程度沒有問題。b)靈敏度試驗(yàn)使用制造例2的判定試劑盒，將判定試劑盒中的一抗作為比較對(duì)照，使用將試驗(yàn)供試品試劑盒中的一抗溶液以抗體稀釋液稀釋了8倍的溶液，將標(biāo)準(zhǔn)切片和對(duì)照切片依照上述"操作方法"進(jìn)行染色，使用試驗(yàn)供試品試劑盒中的一抗和將一抗稀釋了8倍的溶液進(jìn)行染色，對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較/討論。將染色結(jié)果依照上述"判定法"的標(biāo)準(zhǔn)以評(píng)分0評(píng)分3進(jìn)行評(píng)分化(表4、表5)。使用規(guī)定濃度的一抗溶液的情況下，在對(duì)照切片的細(xì)胞膜上可以確認(rèn)評(píng)分3的染色強(qiáng)度，但在使用規(guī)定濃度的將一抗用抗體稀釋液稀釋8倍的溶液的情況下，對(duì)照切片的細(xì)胞膜的染色強(qiáng)度減退為評(píng)分1(圖4)。表4靈敏度試驗(yàn)結(jié)果使用通常的一抗的情況<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>根據(jù)以上的結(jié)果可以確認(rèn)，使用作為試劑盒構(gòu)成品的規(guī)定濃度的一抗的情況下，對(duì)照切片都為評(píng)分3，與此相對(duì)，在將規(guī)定濃度的一抗稀釋8倍的情況下，LAT1評(píng)分下降，因此確認(rèn)了本試劑盒具有能夠判定病理組織標(biāo)本中的LAT1蛋白表達(dá)的有無的靈敏度范圍。c)同時(shí)再現(xiàn)性試驗(yàn)使用制造例2的判定試劑盒，將標(biāo)準(zhǔn)供試品組織切片和對(duì)照切片各分別3片依照上述"操作方法"同時(shí)地進(jìn)行染色，對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行比較/討論。將染色結(jié)果依照"判定法"的標(biāo)準(zhǔn)以評(píng)分0~評(píng)分3進(jìn)行評(píng)分化(表6)。3片對(duì)照切片均顯示同樣的染色程度，為相同的評(píng)分(圖5)。表6使用同一試劑盒、將來自同一組織塊而制成的3片切片標(biāo)本染色的結(jié)果(實(shí)驗(yàn)l)實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在表9和圖6示出結(jié)果。表9使用各種標(biāo)本的基于抗LAT1抗體的染色性的確認(rèn)所使用標(biāo)本腫瘤細(xì)胞背景染色注釋細(xì)胞膜染色細(xì)胞質(zhì)染色核染色大腸癌+++--無任一樣品在細(xì)胞膜上都可PC3細(xì)胞+++---以確認(rèn)評(píng)分3的強(qiáng)染色前列腺癌++++—間質(zhì)部染色根據(jù)上述的結(jié)果，在任一的標(biāo)本中均可以確認(rèn)在癌細(xì)胞膜上線圈狀的強(qiáng)染色，可以確認(rèn)通過使用了本抗體的免疫組織化學(xué)染色，能夠觀察在癌細(xì)胞中LAT1的高表達(dá)。<試驗(yàn)例3臨床試驗(yàn)>接下來，考慮到從臨床醫(yī)學(xué)的觀點(diǎn)出發(fā)的證明是必要的，嘗試開發(fā)了本試驗(yàn)。針對(duì)接受了前列腺癌手術(shù)的病例，使用在手術(shù)前提取的活組織檢驗(yàn)標(biāo)本，進(jìn)行了LAT1的免疫組織化學(xué)染色。將利用活組織檢查標(biāo)本制作的切片標(biāo)本使用制造例2的判定試劑盒進(jìn)行染色，最終以茶色的聯(lián)苯胺染色圖像的強(qiáng)度(評(píng)分0~3)進(jìn)行評(píng)價(jià)，所述的活組織檢査標(biāo)本，是指在活組織檢查的采樣后保存起來的經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的組織塊。針對(duì)這些全部病例，按評(píng)分03分為4組，通過以縱軸表示生存率、以橫軸表示經(jīng)過期間(月數(shù))進(jìn)行繪圖的Kaplan-Meier方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其結(jié)果，對(duì)于以達(dá)到滿5年的生存率作為指標(biāo)的癌的惡性程度，可以確認(rèn)在評(píng)分0的病例組與評(píng)分3的病例組之間存在顯著性差異。另外，雖然針對(duì)評(píng)分1、2的組未確認(rèn)顯著性差異，但是仍顯示了依存于各評(píng)分的生存率。因此，將本方法作為癌的惡性程度診斷中的新技術(shù)而使用是可行的。進(jìn)而提示了，在將來開發(fā)出LAT1蛋白的特異性抗體醫(yī)藥品時(shí)，以及發(fā)現(xiàn)LATl/4F2hc功能的特異性的抑制藥(低分子化合物)時(shí)，對(duì)這些成為靶標(biāo)(目標(biāo)分子)的LAT1的存在進(jìn)行定量化的功能，對(duì)于判別治療藥的適應(yīng)病例具有有用性。1)實(shí)施機(jī)構(gòu)和病例數(shù)實(shí)施機(jī)構(gòu)為實(shí)施機(jī)構(gòu)A和實(shí)施機(jī)構(gòu)B二個(gè)機(jī)構(gòu)，其病例數(shù)的明細(xì)如下表所示。分別從各機(jī)構(gòu)中抽出個(gè)別病例，供試驗(yàn)。表io試驗(yàn)實(shí)施機(jī)構(gòu)和病例數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2)所使用的組織通過細(xì)胞針檢查提取的前列腺癌活組織檢査材料的福爾馬林固定-石蠟包埋標(biāo)本3)方法在病理組織標(biāo)本之中，隨機(jī)地抽出經(jīng)病理組織學(xué)的診斷認(rèn)定為stagelIstagelV的病例，使用本試劑盒依照上述"操作方法"實(shí)施免疫組織化學(xué)染色。所述的病理組織標(biāo)本是指，在兩個(gè)試驗(yàn)實(shí)施機(jī)構(gòu)中被診斷為前列腺癌的病例在1982年2000年間通過細(xì)胞針檢查提取、保存的福爾馬林固定-石蠟包埋病理組織標(biāo)本。依照上述"判定法"對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察、評(píng)分化，針對(duì)染色結(jié)果(LAT1評(píng)分)與5年生存率的相關(guān)性使用Kaplan-Meier方法進(jìn)行分析。(3)結(jié)果1)病例數(shù)與染色結(jié)果的明細(xì)針對(duì)被診斷為前列腺癌的病例，使用制造例2的判定試劑盒，通過免疫組織化學(xué)染色對(duì)腫瘤細(xì)胞中的LAT1蛋白的表達(dá)進(jìn)行調(diào)查時(shí)，根據(jù)病例，可以確認(rèn)達(dá)到評(píng)分03的染色。兩個(gè)機(jī)構(gòu)中的LAT1評(píng)分的明細(xì)在以下表中示出。此外，如果將全部病例的結(jié)果按評(píng)分進(jìn)行區(qū)別分類，則實(shí)施機(jī)構(gòu)A和B均有評(píng)分O的病例最多、評(píng)分3病例少的趨勢(shì)。另外，其染色程度也幾乎相同，從而判定基于制造例2的判定試劑盒的染色中無機(jī)構(gòu)間差異。表11前列腺癌組織中LAT1蛋白表達(dá)的評(píng)分化<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>2)使用了Kaplan-Meire法的LAT1評(píng)分中的生存分析針對(duì)1)的病例，將兩個(gè)機(jī)構(gòu)的結(jié)果合并，將腫瘤細(xì)胞中的LAT1蛋白的表達(dá)程度(LAT1評(píng)分)與病例患者的生存期之間的關(guān)系利用Kaplan-Meier的方法(非參數(shù)方法，Nonparametricmethod)進(jìn)行生存分析，結(jié)果確認(rèn)在LAT1高表達(dá)(LAT1評(píng)分3)和低表達(dá)組(LAT1評(píng)分0~2)之間有顯著性差異。具體地說，評(píng)分3與評(píng)分0之間得到P<0.001的結(jié)果。從這些結(jié)果可知，在LAT1評(píng)分3的組中，約半數(shù)病例在5年以內(nèi)死亡，可以確認(rèn)與評(píng)分0的病例組之間有顯著性差異(圖7)。3)采用斯寧庫勞普方法的LAT1評(píng)分的轉(zhuǎn)換分析針對(duì)l)的全部病例，在染色強(qiáng)度之外，將染色范圍分為3級(jí)進(jìn)行觀察，按focal(10%以下)、partial(10~30%)、diffiise(30%以上)進(jìn)行分類。針對(duì)各觀察結(jié)果，基于斯寧庫勞普的方法，對(duì)LAT1評(píng)分乘以與染色范圍對(duì)應(yīng)的系數(shù)(focal為1，partial為2，diffiise為3)，轉(zhuǎn)換LAT1評(píng)分(圖8)。對(duì)于這些經(jīng)轉(zhuǎn)換的LAT1評(píng)分，采用與2)相同的Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，結(jié)果確認(rèn)了LAT1評(píng)分與生存期之間的明顯差異。從該結(jié)果可確認(rèn)，在評(píng)分4以上，與評(píng)分0之間有顯著性差異，特別是評(píng)分6以上的病例中，90%為5年以內(nèi)死亡。如以上所述，提示通過使用對(duì)LAT1評(píng)分的強(qiáng)度乘以表達(dá)范圍系數(shù)(focal=l、partia卜2、diffUse=3)而轉(zhuǎn)換得到的LAT1評(píng)分(09)進(jìn)行生存分析，能夠進(jìn)行精度更高的診斷。(3)與PSA的比較針對(duì)相同的病例，與已知的作為前列腺癌的特異標(biāo)記的PSA進(jìn)行比較。本次使用的171病例中，針對(duì)臨近手術(shù)前記錄過PSA值的127病例，以PSA值4ng/mL和10ng/mL作為閾值，使用Kaplan-Meire方法進(jìn)行生存分析，與基于LAT1評(píng)分的結(jié)果進(jìn)行比較。在任一的閾值中，使用PSA值都未能確認(rèn)低表達(dá)組與高表達(dá)組之間的差別。使用相同的病例進(jìn)行的LAT1評(píng)分分析中，確認(rèn)了評(píng)分0組與評(píng)分3組之間有顯著性差異(圖9)。(4)與Stage分類的比較病例組中，依據(jù)手術(shù)時(shí)的信息，在病理學(xué)的TMN分期和手術(shù)時(shí)的與轉(zhuǎn)移的有無相關(guān)的信息的基礎(chǔ)上進(jìn)行stage分類，進(jìn)行Kaplan-Meire生存分析。使用Stage分類不能確認(rèn)與5年生存率之間的顯著性差異，與此相對(duì)，使用LAT1分類，在任一的Stage中，評(píng)分0組與評(píng)分3組之間均確認(rèn)有顯著性差異(圖10)。(5)與Gleasons評(píng)分的比較利用試驗(yàn)中所使用的活組織檢查材料的病理診斷結(jié)果報(bào)告書，調(diào)查診斷時(shí)的Gleasons評(píng)分，針對(duì)得到信息的154病例，通過Kaplan-Meire法進(jìn)行生存分析，與基于LAT1評(píng)分的結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)，兩者幾乎得到相同的結(jié)果(圖11)。如以上所述，本發(fā)明顯示了與在前列腺癌診斷中被視為最重要的Gleasons評(píng)分分類的結(jié)果(P=0.0008)同等的有用性。(6)結(jié)論根據(jù)本臨床試驗(yàn)結(jié)果，LAT1的表達(dá)與前列腺癌患者的生存期顯著地逆相關(guān)，提示其有用性可與Gleasons評(píng)分相匹敵。另外，本發(fā)明與現(xiàn)在作為前列腺癌的標(biāo)志而使用的PSA、及為表示癌進(jìn)展度而使用的Stage分類相比，在癌的惡性程度診斷中也得到良好的結(jié)果。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本方法對(duì)前列腺腫瘤細(xì)胞的染色靈敏度良好，雖然與抗體的特性相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)非特異反應(yīng)，也被證明無機(jī)構(gòu)間誤差。另外，通過使用本手法，將在前列腺腫瘤細(xì)胞膜上表達(dá)的LAT1量定性地進(jìn)行可視化，提示可以診斷前列腺腫瘤細(xì)胞的惡性程度，進(jìn)而，其有用性與Gleasons評(píng)分等同，與PSA和Stage分類相比可以認(rèn)為是有用的。進(jìn)而，本法通過免疫組織化學(xué)染色，定性地診斷細(xì)胞膜上的LAT1，與Gleasons分類、其他的病理診斷法相比，觀察和判定結(jié)果容易。進(jìn)而，期待著通過將本手法與Gleasons評(píng)分組合，使精度更高的前列1腺癌的惡性程度診斷成為可能。特別是在基于Gleasons分類、TMN分類的診斷法中，在Gleasons評(píng)分總共達(dá)到7附近時(shí)，還有接受T3N0(所謂的StageII)的判定時(shí)，此時(shí)有難以進(jìn)行預(yù)后的診斷的情況，通過與本發(fā)明的方法并用，對(duì)明確這些灰色區(qū)域有所幫助。因此，本方法可以稱為是，診斷前列腺癌的惡性程度、進(jìn)行預(yù)后判定的，同時(shí)還決定之后的治療方針的所謂新的前列腺癌的診斷藥。權(quán)利要求1.一種前列腺癌的惡性程度判定用試劑盒，其含有抗人LAT1單克隆抗體，且基于免疫組織化學(xué)染色。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前列腺癌的惡性程度判定用試劑盒，其中，所述單克隆抗體為特異性地識(shí)別人LAT1的從N末端部位開始1~52位氨基酸殘基的抗體。3.—種前列腺癌的惡性程度判定方法，其包括在供試品組織中應(yīng)用抗人LAT1單克隆抗體的工序，且基于免疫組織化學(xué)染色。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的前列腺癌的惡性程度判定方法，其中，所述單克隆抗體為特異性地識(shí)別人LAT1的從N末端部位開始1~52位氨基酸殘基的抗體。5.—種鑒別適于使用LAT1分子靶向治療藥的前列腺癌病例的方法，其中包括通過權(quán)利要求3或4所述的方法對(duì)前列腺癌的惡性程度進(jìn)行判定的判定工序；以及基于所述判定工序的診斷結(jié)果，決定是否給與前列腺治療藥的工序。全文摘要本發(fā)明的目的在于，在Gleasons分類、TMN分類之外，提供作為新診斷法的分子標(biāo)記的手法，從而提供在手術(shù)前的早期階段，使用活組織檢查材料，與Gleasons分類組合使用，在不使用手術(shù)時(shí)摘出材料而使用利用細(xì)胞針檢查提取的材料的情況下，也可以以更高精度且容易地判定前列腺癌的惡性程度的方法。本發(fā)明涉及用于判定(診斷)前列腺癌的惡性程度、預(yù)測(cè)患者的預(yù)后的判定試劑盒和判定法。文檔編號(hào)G01N33/574GK101680895SQ20078005252公開日2010年3月24日申請(qǐng)日期2007年2月6日優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日發(fā)明者岡安勛,坂田武,遠(yuǎn)藤仁申請(qǐng)人:J制藥股份有限公司