專利名稱：鋰診斷/測定試劑盒及鋰濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鋰診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鋰濃度的 方法，屬于醫(yī)學(xué)/工業(yè)/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
20世紀40年代，Cade首次用鋰鹽治療躁狂癥成功，總有效率約70%， 鋰鹽對躁狂和抑郁的復(fù)發(fā)有預(yù)防作用，也用于治療分裂情感性精神病。另 外，鋰鹽可使雙相障礙維持治療階段的自殺行為減少86%，而當停用鋰鹽 后，自殺危險性會增加7.5倍。當血鋰濃度達到或超過1.5mmol/L，會出 現(xiàn)不同程度的中毒癥狀，血鋰濃度3.0mmd / L以上可危及生命。
近幾年，臨床實驗室多數(shù)方法學(xué)都有了新的發(fā)展，但鋰的測定方法基本 維持火焰原子發(fā)射法、火焰原子吸收法及離子選擇電極法。原子吸收的 方法是將稀釋的標本吸入乙炔火焰中，利用空心陰極元素燈光源發(fā)出被測 元素的特征輻射光，為火焰原子化器產(chǎn)生的樣品蒸汽中的待測元素基態(tài)原 子所吸收。鋰在波長670.8 nm處的被吸光的特征輻射光的大小與標本中的 鋰濃度成正比。但目前國內(nèi)的臨床實驗室沒有統(tǒng)一的實驗方法和實驗操作 規(guī)程，也很難在精神病醫(yī)院的實驗室中査找到其使用情況。
自然界中無游離鋰，因此實際指鋰離子或鋰鹽，而碳酸鋰是最重要的鋰 化物。碳酸鋰被用于陶瓷釉料的生產(chǎn)、特種玻璃、鋁的熔煉和鋼鐵鑄造粉 末。氫氧化鋰和氯化鋰應(yīng)用在潤滑劑、空調(diào)和干燥系統(tǒng)中。丁基鋰、鋰金 屬、特種無機物和特種有機物，被用于制藥、合成橡膠等領(lǐng)域。鋰是一種稀有金屬，鋰電池就以它為主要原料，航空航天工業(yè)也離不開鋰。金屬鋰與 鋰合金在核能發(fā)電、輕質(zhì)高比強合金、輕金屬焊接等諸多領(lǐng)域都有著廣闊 的開發(fā)利用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原 型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定鋰 濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的鋰診斷/測定試劑盒， 采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行 鋰濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明鋰濃度測定方法原理如下
肌醇-l-磷酸+水肌醇-1-磷酸酶/1\4￡2+/0+肌醇+磷酸根 磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶二氧化碳+
磷酸烯醇式丙酮酸+水 二氧化碳+乙酰輔酶八+還原型輔酶丙酮酸脫氫酶 丙酮酸
+輔酶八+輔酶
這種方法應(yīng)用能被鋰抑制活性的肌醇-l-磷酸酶(inositol-l-phosphase; EC 3丄3.25)酶(偶)聯(lián)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpymvate carboxylase; EC 4.1.1.31)、丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2丄51)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法/速率比色法。肌醇-l-磷酸酶(需要鎂離子 激活其活性，鋰離子能抑制鎂離子的激活作用)酶解肌醇-l-磷酸反應(yīng)產(chǎn)生 磷酸根，再通過(偶)聯(lián)合磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶的作 用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/ 速度，比較對照及鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，可以測算鋰的濃 度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明鋰診斷/測定試劑盒較
為理想
緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
肌醇-l-磷酸酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
丙酮酸脫氫酶
氯化鎂
肌醇-l-磷酸
草酰乙酸
乙酰輔酶A 氯化鎂可以用其它鎂鹽取代；如硫酸鎂等'
100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10000U/L 10000 U/L 10000U/L 0.6 mmol/L 8 mmol/L 8 mmol/L 10 mmol/L
本發(fā)明的鋰診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇 式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔 酶A。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸、草酰乙 酸、乙酰輔酶A。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、 丙酮酸脫氫酶。
還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙
酮酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的 位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸、草酰乙
酸、乙酰輔酶A。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、肌醇-l-磷酸酶。 還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙 酮酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或試 劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定鋰濃度的方法，其還原型輔酶
可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
本實施例的鋰診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 肌醇-l-磷酸酶 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 丙酮酸脫氫酶 氯化鎂 肌醇-l-磷酸 草酰乙酸
乙酰輔酶A
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥,
100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L
10000U/L
10000 U/L
10000U/L 0.6 mmol/L 8 mmol/L 8 mmol/L
10 mmol/L
制成干粉試劑；使用
前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光 度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測對照及鋰樣品 與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約 l分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
分別加入對照及樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，比較對照及 鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測算出鋰的濃度大小。
實施例二
本實施例的鋰診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
氯化鎂
肌醇-l-磷酸
草酰乙酸
乙酰輔酶A
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 0.6 mmol/L 8 mmol/L 8 mmol/L 10 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
肌醇-l-磷酸酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L 10000 U/L 10000U/L
丙酮酸脫氫酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光 度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測對照及鋰樣品 與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))， 延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
10分別加入對照及樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置
于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，比較對照及 鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測算出鋰的濃度大小。
實施例三
本實施例的鋰診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
氯化鎂
肌醇-l-磷酸
草酰乙酸
乙酰輔酶A 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 丙酮酸脫氫酶
穩(wěn)定劑
100mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 0,6 mmol/L 8 mmol/L 8 mmol/L 10 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 10000 U/L 10000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
500 mmol/L
肌醇-l-磷酸酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用測定鋰濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10
分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被 測對照及鋰樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 分別加入對照及樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置 于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，比較對照及 鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測算出鋰的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的測定方法均能達到 本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析 儀器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0015; 吸光度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線下降；試劑可測有效(RX).99)線形范圍可 達0.45mmol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±7%;試劑測 試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2 %;試劑的靈敏度可達0.0988 ± 0.049 AA/mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足 以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種利用能被鋰抑制活性的酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鋰濃度測定方法，其方法原理如下肌醇-1-磷酸+水 <u>肌醇-1-磷酸酶/Mg</u><u>2+</u><u>/Li</u><u>+</u> 肌醇+磷酸根磷酸根+草酰乙酸 <u>磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶</u> 二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶 <u>丙酮酸脫氫酶</u> 丙酮酸 +輔酶A+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，比較對照及鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，測算出鋰的濃度大小測定結(jié)果。
2.
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鋰診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A 組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鋰診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A 組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌 醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶組成。還原 型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸 脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的 位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鋰診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇 式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A 組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氯化鎂、肌 醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、肌醇-l-磷酸酶組成。還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-l-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、肌醇-l-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述鋰診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用能被鋰抑制活性的酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鋰診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鋰濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/工業(yè)/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、氯化鎂、肌醇-1-磷酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A、肌醇-1-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過分別將對照及鋰樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，比較對照及鋰樣品吸光度下降的程度/速度的差別，從而測算出鋰的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464314SQ20071019210
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司