專利名稱：免疫熒光標(biāo)記試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是以綠色熒光蛋白為指示劑、以葡萄球菌蛋白A為抗抗體、應(yīng)用 于免疫標(biāo)記方面的試劑盒，其涉及免疫熒光標(biāo)記、免疫組織化學(xué)、生化分析、 抗體檢測(cè)、蛋白質(zhì)融合、綠色熒光蛋白、蛋白A、基因工程等，屬于免疫分析 和生物技術(shù)應(yīng)用等相關(guān)領(lǐng)域。
技術(shù)背景自標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)出現(xiàn)以來(lái)，其在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究中已被廣泛應(yīng)用。 其原理就是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合， 以顯色或熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體，對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)進(jìn)行定位檢測(cè)。在免疫測(cè)定中，用酶或熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體/抗原是必需的。傳統(tǒng)的標(biāo)記方 法是將指示物通過(guò)化學(xué)交聯(lián)法耦聯(lián)到抗體/抗原分子上(如將酶通過(guò)具有雙功 能或多功能化學(xué)基團(tuán)的交聯(lián)劑結(jié)合到蛋白分子上。但這種方法有其缺點(diǎn)大 量的抗體或抗原分子、酶作為反應(yīng)物參加耦合；需純化步驟才可獲得抗體-酶 耦合物；交聯(lián)后酶活性時(shí)常降低；而且在測(cè)定過(guò)程中因隨機(jī)結(jié)合引發(fā)的空間 位阻的干擾而影響免疫測(cè)定的靈敏度。另外，傳統(tǒng)熒光染料在熒光顯微鏡激 發(fā)光照射下易發(fā)生光漂白現(xiàn)象，而且傳統(tǒng)抗體制備及標(biāo)記方法易降低抗體效 價(jià)并產(chǎn)生非特異性染色。因此開(kāi)發(fā)新的標(biāo)記物及標(biāo)記方法是很有意義的。綠色熒光蛋白(GFP)是來(lái)自發(fā)光水母等海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的一種功能獨(dú)特 的蛋白質(zhì)，其受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時(shí)，可以發(fā)射出綠色熒光。自1994年GFP 基因被克隆成功以來(lái)，其作為生物標(biāo)記分子有著巨大的應(yīng)用潛力，主要因?yàn)?它具有以下特性(1)種屬不依賴性，原核、真核細(xì)胞中都可表達(dá)為有活性 的GFP; (2)熒光的產(chǎn)生不需要反應(yīng)底物與輔助因子；(3)相對(duì)較小的分子和 單體蛋白使之易于融合；(4)GFP肽鏈中一些特定氨基酸的替代可使之產(chǎn)生不 應(yīng)于不同研究的需要；(5)GFP可作為一種非侵入方法(無(wú) 需細(xì)胞通透作用，無(wú)毒作用)檢測(cè)體內(nèi)基因表達(dá)或蛋白標(biāo)記；(6)它構(gòu)象穩(wěn) 定，無(wú)光漂白作用，熒光強(qiáng)度高；(7)對(duì)一系列與GFP的N端或C端融合蛋 白的性質(zhì)研究中，己證明融合蛋白具有GFP的熒光性質(zhì)和配體蛋白質(zhì)的生物 功能。葡萄球菌A蛋白(SPA)是金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離出的一種分子量為 42000的單一多肽鏈。SPA具有許多生物學(xué)活性如激活補(bǔ)體、促有絲分裂、抑 制吞噬等。其中SPA可與人和多種哺乳動(dòng)物血清中IgG的Fc片段非特異性結(jié)合， 且這種結(jié)合不影響Fab片段與抗原特異性結(jié)合的免疫活性，利用這一特性，結(jié) 合放射、熒光、酶聯(lián)及免疫電鏡等技術(shù)建立了許多敏感、特異、快速、簡(jiǎn)便 的實(shí)驗(yàn)方法，用于疾病診斷和其它方面的研究。目前SPA除用于免疫球蛋白和 單克隆抗體的純化外，以生物素(biotin)、過(guò)氧化物酶(peroxidase)、異硫 氰酸熒光素(FITC)、膠體金(colloidal gold)等標(biāo)記蛋白SPA，在免疫組化、 免疫電鏡、Western Blotting和ELISA中得到大量應(yīng)用，被稱為"廣泛二抗"。CN1731181公開(kāi)了一種免疫熒光檢測(cè)試劑，由增強(qiáng)型綠色熒光蛋白與葡萄 球菌蛋白A的融合蛋白(ProA-EGFP)組成。同時(shí)還公開(kāi)了該試劑的制備方法， 即構(gòu)建綠色熒光蛋白(GFP)和葡萄球菌蛋白A(ProA)融合基因表達(dá)載體，以大 腸桿菌E.coli DH5a菌株表達(dá)ProA-EGFP融合蛋白；分離純化ProA-EGFP融合 蛋白。本發(fā)明的免疫熒光檢測(cè)試劑在制備免疫學(xué)診斷或檢測(cè)試劑中具有廣泛 的應(yīng)用。該專利申請(qǐng)針對(duì)的是免疫熒光試劑的制備。本申請(qǐng)針對(duì)的是該試劑 的具體應(yīng)用。 發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種免疫熒光標(biāo)記試劑盒及其制備方法。本發(fā)明的免疫熒光標(biāo)記試劑盒，是一種使用綠色熒光蛋白作為熒光指示劑 的免疫熒光標(biāo)記試劑盒。
本發(fā)明的免疫熒光標(biāo)記試劑盒，組成如下增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)和葡萄球菌蛋白A (SPA)構(gòu)成的融合蛋白 SPA-EGFP，封閉劑，洗脫緩沖液。所述的封閉劑為0. 5%的牛血清白蛋白。 所述的洗脫緩沖液為含0. 5%吐溫20的10mM PBS， pH7. 4。 本發(fā)明的免疫熒光標(biāo)記試劑盒的制備方法，構(gòu)建增強(qiáng)型綠色熒光蛋白和葡 萄球菌蛋白A的融合蛋白基因spa-egfp，以畢赤酵母表達(dá)SPA-EGFP融合蛋白， 分離純化SPA-EGFP融合蛋白；分離純化的SPA-EGFP融合蛋白作為熒光指示劑與封閉劑、洗脫緩沖液共同構(gòu)成試劑盒。所述的SPA-EGFP融合蛋白為酵母分泌表達(dá)，作用表達(dá)載體為質(zhì)粒pPIC9K， 引物按按常規(guī)設(shè)計(jì)，SPA-EGFP融合蛋白基因spa-egfp插入質(zhì)粒pPIC9K的 a-factor信號(hào)肽下游，表達(dá)用宿主細(xì)胞為畢赤酵母GS115，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母 并篩選高拷貝重組子，構(gòu)建重組spa-egfp融合基因畢赤酵母工程菌。對(duì)上述畢赤酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵，方法如下使用BMMY培養(yǎng)基，發(fā)酵條件為3CTC，甲醇濃度2%，緩沖液pH值7.0， 同時(shí)添加1%酸水解酪素(Casamino acids)。 300rpm搖床培養(yǎng)80 84h，每 20 24小時(shí)添加甲醇至終濃度2%。上述BMMY培養(yǎng)基配方1%酵母提取物，2%多聚蛋白胨，100mM磷酸緩沖 液，1. 34%無(wú)氨基酵母氮源，4X10—5%生物素，2%甲醇，1%酸水解酪素(Casamino acids )。---■將上述畢赤酵母工程菌發(fā)酵液離心，取上清液過(guò)0.45微米濾膜，上 HisTrap HP柱純化，再過(guò)HiTrap Desalting柱脫鹽，得到純度大于990/0的 SPA-EGFP。將純化的SPA-EGFP融合蛋白凍干濃縮，所獲得的SPA-EGFP融合蛋白用稀 釋緩沖液定容至一定濃度，作為熒光指示劑與封閉劑、洗脫緩沖液共同構(gòu)成 試劑盒。
所述的SPA-EGFP融合蛋白在酵母中表達(dá)后可以有效地分泌至培養(yǎng)基中， 并且表達(dá)產(chǎn)物同時(shí)具備SPA的IgG結(jié)合活性以及EGFP的熒光活性。 本發(fā)明所述的免疫熒光標(biāo)記試劑盒可用于制備臨床診斷試劑盒。 本發(fā)明所述的免疫熒光標(biāo)記試劑盒可用于制備檢測(cè)試劑盒。 本發(fā)明所述的免疫熒光標(biāo)記試劑盒可用于免疫學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞免疫組化檢 測(cè)及蛋白芯片等方面的研究。本發(fā)明通過(guò)DNA重組技術(shù)，將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因與葡萄 球菌蛋白A (SPA)基因融合，將融合基因轉(zhuǎn)染到畢赤酵母GS115中，并使其 高效表達(dá)SPA-EGFP,將表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，純化后獲得高純度的 SPA-EGFP融合蛋白。利用此融合蛋白取代傳統(tǒng)免疫標(biāo)記試劑盒中的指示劑系 統(tǒng)(酶聯(lián)顯色/熒光試劑)和抗抗體(也可稱為二抗)，配合以專用的封閉劑、 洗脫緩沖溶液，構(gòu)成新型免疫標(biāo)記試劑盒。本發(fā)明的綠色熒光蛋白免疫熒光標(biāo)記試劑盒，以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (EGFP)為指示劑、以葡萄球菌蛋白A (SPA)為抗抗體，可廣泛應(yīng)用于免疫熒 光標(biāo)記、免疫組織化學(xué)、生化分析、抗體檢測(cè)、蛋白質(zhì)芯片等領(lǐng)域，可有效 取代現(xiàn)有產(chǎn)品，且操作更加簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性、靈敏性和可靠性更好，尤其適用 于采用熒光分析儀器進(jìn)行的高通量分析。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例h免疫熒光標(biāo)記試劑盒組成如下增強(qiáng)型綠色熒光蛋白和葡萄球菌蛋白A構(gòu)成的融合蛋白SPA-EGFP，封閉劑0. 5%的牛血清白蛋白，洗脫緩沖液含0. 5%Tween 20的lOmMPBS， pH7.4。實(shí)施例2:免疫熒光標(biāo)記試劑盒的制備1、融合蛋白SPA-EGFP構(gòu)建表達(dá)方法參見(jiàn)CN1731181。SPA-EGFP融合蛋白基因spa-egfp (質(zhì)粒是DNA序列，只有基因才可插入質(zhì)粒中)插入質(zhì)粒pPIC9K的a-factor信號(hào)肽下游，表達(dá)用宿主細(xì)胞為畢赤
酵母GS115，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母并篩選高拷貝重組子，構(gòu)建重組SPA-EGFP融合 基因畢赤酵母工程菌。對(duì)上述畢赤酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵，使用B顧Y培養(yǎng)基， 發(fā)酵條件為30°C，甲醇濃度2% ，緩沖液pH值7.0，同時(shí)添加l%Casamino acids。 300rpm搖床培養(yǎng)80 84h，每20 24小時(shí)添加甲醇至終濃度2%。將 畢赤酵母工程菌發(fā)酵液離心，取上清液過(guò)0. 45微米濾膜，上HisTr即HP柱 純化，再過(guò)HiTrap Desalting柱脫鹽，得到純度大于99%的SPA-EGFP。將純 化的SPA-EGFP融合蛋白凍干濃縮，備用。2、 采用0.5%的牛血清白蛋白作為封閉劑。3、 采用含0.5。/。Tween 20的50mM PBS作為洗脫緩沖液，其pH7.4。4、 將所獲得的純化SPA-EGFP融合蛋白用稀釋緩沖液定容至1: 100 (質(zhì)量體積百分比)，作為熒光指示劑與封閉劑、洗脫緩沖液共同構(gòu)成試劑盒。 上述的稀釋緩沖液具體是20mMraS，其為pH8.0。下面的實(shí)施例3-4的稀釋緩沖液與本實(shí)施例相同。實(shí)施例3:免疫熒光標(biāo)記試劑盒的使用方法(直接法)稀釋根據(jù)需要，用稀釋緩沖液將抗原稀釋至一定濃度。固定將稀釋好的抗原滴加至固相載體上，以封閉劑覆蓋無(wú)抗原區(qū)域，避免熒光指示劑的非特異性吸附。標(biāo)記將熒光指示劑稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度，與樣品混合，溫育，以使之與 抗體結(jié)合。加樣:滴加標(biāo)記好的樣品至固定有抗原的固相載體上，溫育，以使抗原抗 體結(jié)合。清洗以洗脫緩沖液沖洗固相載體三次，去除未結(jié)合樣品及熒光指示劑。 結(jié)果觀察熒光顯微鏡下進(jìn)行定性/定量觀察。 實(shí)施例4:免疫熒光標(biāo)記試劑盒的使用方法(間接法) 稀釋根據(jù)需要，用稀釋緩沖液將抗原稀釋至一定濃度。 固定將稀釋好的抗原滴加至固相載體上，以封閉劑覆蓋無(wú)抗原區(qū)域，避 免熒光指示劑的非特異性吸附。樣品處理使用稀釋緩沖液將樣品稀釋至一定濃度。加樣將處理好的樣品滴加至固定有抗原的固相載體上，溫育，以使抗原 抗體結(jié)合。標(biāo)記將熒光指示劑滴加至抗原抗體結(jié)合后的固相載體上，以使之與抗體妙入 ^口 口 o清洗以洗脫緩沖液沖洗固相載體三次，去除未結(jié)合樣品及熒光指示劑。 結(jié)果觀察熒光顯微鏡下進(jìn)行定性/定量觀察。
權(quán)利要求
1.一種使用綠色熒光蛋白作為熒光指示劑的免疫熒光標(biāo)記試劑盒。
2. 如權(quán)利要求1所述的免疫熒光標(biāo)記試劑盒，其特征在于由下列試劑組 成增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)和葡萄球菌蛋白A (ProA)構(gòu)成的SPA-EGFP 融合蛋白，封閉劑，洗脫緩沖液；所述的封閉劑為0.5%的牛血清白蛋白，所 述的洗脫緩沖液為含0. 5%吐溫20的10mM PBS， pH7. 4。
3. 如權(quán)利要求2所述的免疫熒光標(biāo)記試劑盒，其特征在于SPA-EGFP融 合蛋白為酵母分泌表達(dá)，表達(dá)用宿主細(xì)胞為畢赤酵母GS115。
4. 如權(quán)利要求2所述的免疫熒光標(biāo)記試劑盒，其特征在于將spa-egfp 融合基因插入酵母表達(dá)載體PPIC9K中，將此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115， 構(gòu)建成SPA-EGFP融合蛋白畢赤酵母工程菌。
5. 如權(quán)利要求3所述的免疫熒光標(biāo)記試劑盒，其特征在于SPA-EGFP融 合蛋白在酵母中表達(dá)后有效地分泌至培養(yǎng)基中，表達(dá)產(chǎn)物同時(shí)具備SPA的IgG 結(jié)合活性以及EGFP的熒光活性。
6. 權(quán)利要求1所述的免疫熒光標(biāo)記試劑盒在制備檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1所述的免疫熒光標(biāo)記試劑盒在制備免疫學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞免疫 組化檢測(cè)及蛋白芯片等方面上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種免疫熒光標(biāo)記試劑盒。是以綠色熒光蛋白(GFP)為指示劑、以葡萄球菌蛋白A(SPA)為抗抗體、應(yīng)用于免疫標(biāo)記方面的試劑盒。同時(shí)還公開(kāi)了該試劑盒的制備方法。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于免疫熒光標(biāo)記、免疫組織化學(xué)、生化分析、抗體檢測(cè)、蛋白質(zhì)芯片等領(lǐng)域，可有效取代現(xiàn)有產(chǎn)品，且操作更加簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性、靈敏性和可靠性更好，尤其適用于采用熒光分析儀器進(jìn)行的高通量分析。
文檔編號(hào)G01N33/52GK101149372SQ20071001419
公開(kāi)日2008年3月26日 申請(qǐng)日期2007年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月16日
發(fā)明者吉愛(ài)國(guó), 超 宋, 浩 梁 申請(qǐng)人:山東大學(xué)威海分校