專利名稱：測定雙孢蘑菇褐變底物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多酚物質(zhì)種類的鑒定技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到一種測定雙孢蘑菇褐變底物的方法。
背景技術(shù)：
褐變是雙孢蘑菇采后商品品質(zhì)降低的最主要特征，不僅影響產(chǎn)品外觀質(zhì)量，而且對風(fēng)味和營養(yǎng)品質(zhì)都有一定程度的損害。菇體內(nèi)的多酚類物質(zhì)在有氧存在的條件下，經(jīng)多酚氧化酶的催化作用，將無色的酚類化合物氧化成紅褐色的醌，醌再與氨基酸反應(yīng)，氧化、縮合、重合生成類黑色聚合物是雙孢蘑菇采后褐變的主要原因。酚類物質(zhì)是酶促褐變的物質(zhì)基礎(chǔ)，一般說來生物體內(nèi)含有多種酚類物質(zhì)，但只有1種或少數(shù)幾種是PPO的主要底物。因此研究雙孢蘑菇中酚類物質(zhì)的種類、含量以及主要褐變底物對研究其褐變機理以及褐變抑制措施均具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能準(zhǔn)確測定引起褐變的主要多酚的種類和含量、對研究其褐變機理以及褐變抑制措施均具有重要意義的測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，其技術(shù)內(nèi)容為一種測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，依次包括雙孢蘑菇中多酚的提取、多酚的分離、多酚物質(zhì)種類鑒定和含量測定、主要褐變底物的確定四個步驟，其特征在于多酚物質(zhì)種類的鑒定和含量測定采用高效液相色譜法法進行，步驟四中先通過分析多酚含量在貯藏過程中的變化與褐變度之間的關(guān)系，初步確定出可能導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物種類，然后對自然褐變產(chǎn)物及標(biāo)準(zhǔn)品褐變產(chǎn)物的紫外吸收光譜進行對照，進而確定導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的主要底物。
所述的測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，步驟1中多酚的提取條件和過程為取3～5克雙孢蘑菇果肉，加10～20mL濃度為80％的色譜純甲醇，冰浴研成勻漿，80℃超純水水浴回流1小時，冷卻后過濾，用濃度為80％的甲醇定容至20mL，即為雙孢蘑菇中多酚提取液。
所述的測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，步驟2中多酚的分離采用高效液相色譜法，其分析條件為WATERS600型HPLC，色譜柱為0.4cm×15cm反向C18柱，流動相為含甲醇15％～20％的水溶液，另加入甲醇水溶液1％～1.5％的色譜純磷酸，流速為0.3～0.4ml/min，進樣量10～20μl，檢測器采用UV254nm，檢測波長280nm。步驟1所得的多酚提取液在上述條件下經(jīng)高效液相色譜儀分離，得到雙孢蘑菇中多酚的色譜圖。
所述的測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，步驟3中多酚物質(zhì)種類鑒定和含量測定采用外標(biāo)法，具體過程為將多酚標(biāo)準(zhǔn)品配制成10～100mg/l的溶液，按步驟2的工藝對多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行分離，得到標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，然后將雙孢蘑菇中多酚的色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖對照，兩張譜圖中保留時間一致的色譜峰所對應(yīng)的多酚可判斷為同一種物質(zhì)，從而確定出雙孢蘑菇中多酚的種類；根據(jù)雙孢蘑菇提取液中某種多酚的濃度＝(該標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度/該標(biāo)準(zhǔn)品峰面積)×提取液中該多酚峰面積，從而計算出雙孢蘑菇中該多酚的含量。
所述的測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，步驟3中多酚標(biāo)準(zhǔn)品至少包括氨基酚、酪氨酸兩種。
所述的測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，步驟4中導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變底物種類的初步確定為按步驟1的工藝對貯藏了不同時間的雙孢蘑菇中的多酚進行提取，然后按步驟2的工藝對提取液進行分離，根據(jù)各峰面積計算各多酚的含量在貯藏過程中的變化，同時利用色差計測定貯藏了不同時間的雙孢蘑菇的褐變度，含量降低速度與雙孢蘑菇褐變度增加速度一致的多酚即為可能導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物種類。
所述的測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，步驟4中導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變主要底物的確定為分別將初步確定出可能導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物種類的標(biāo)準(zhǔn)品在雙孢蘑菇中PPO催化下的反應(yīng)產(chǎn)物以及雙孢蘑菇組織自然褐變產(chǎn)物在200nm～400nm之間進行紫外吸收光譜掃描，與雙孢蘑菇組織自然褐變產(chǎn)物的紫外吸收光譜一致的標(biāo)準(zhǔn)品所對應(yīng)的底物種類即為導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物。
所述的測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，步驟4中雙孢蘑菇組織褐變度采用全自動色差計測定。
其工作原理為雙孢蘑菇中的多酚類物質(zhì)在多酚氧化酶的催化作用下發(fā)生酶促褐變是導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的主要原因，雙孢蘑菇中含有多種多酚類物質(zhì)，但其中只有1種或少數(shù)幾種是褐變的底物。本發(fā)明首先將雙孢蘑菇中的多酚進行提取、分離和種類鑒定；然后測定雙孢蘑菇貯藏過程中各多酚含量的變化和褐變度，含量降低速度與褐變度增加速度一致的多酚即可能為導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物；最后將初步確定出可能導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物種類的標(biāo)準(zhǔn)品在雙孢蘑菇中PPO催化下的反應(yīng)產(chǎn)物以及雙孢蘑菇組織自然褐變產(chǎn)物在200nm～400nm之間的紫外吸收光譜對照，與雙孢蘑菇組織自然褐變產(chǎn)物的紫外吸收光譜一致的標(biāo)準(zhǔn)品所對應(yīng)的底物種類即為導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，在初步確定出雙孢蘑菇中褐變底物的基礎(chǔ)上，利用紫外吸收光譜掃描技術(shù)，對可能的褐變底物標(biāo)準(zhǔn)品在雙孢蘑菇中PPO催化下的反應(yīng)產(chǎn)物以及雙孢蘑菇組織自然褐變產(chǎn)物在200nm～400nm之間進行紫外吸收光譜掃描，通過紫外吸收譜圖的對照，更準(zhǔn)確地確定出了導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物種類。
具體實施例方式
實例1步驟1多酚的提取，取5克雙孢蘑菇果肉，加20mL濃度為80％的色譜純甲醇，冰浴研成勻漿，80℃超純水水浴回流1小時，冷卻后過濾，用濃度為80％的色譜純甲醇定容至20mL，得到雙孢蘑菇中多酚的提取液；步驟2多酚的分離，利用高效液相色譜儀對多酚提取液進行分離，分離條件為WATERS600型HPLC，色譜柱為0.4cm×15cm反向C18柱，流動相為15％的甲醇水溶液，另加入甲醇水溶液1％的磷酸，流速為0.3ml/min，進樣量10μl，檢測器采用UV254nm，檢測波長280nm，得到雙孢蘑菇中多酚的色譜圖。譜圖中包含兩個明顯的色譜峰，保留時間分別為2.338min和3.117min，峰面積分別為129370mv·min和1795190mv·min。
步驟3多酚種類鑒定和含量測定，將氨基酚、酪氨酸、沒食子酸、鄰苯二酚的標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成100mg/l的溶液，按步驟2的工藝對多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行分離，得到標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。以上各標(biāo)準(zhǔn)品所對應(yīng)色譜峰的保留時間和峰面積分別為氨基酚2.388min、1255822mv·min；酪氨酸3.134min、1427320mv·min；沒食子酸5.741min、6308972mv·min；鄰苯二酚14.177min、5020097mv·min。將雙孢蘑菇中多酚提取液的色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖對照，可以確定雙孢蘑菇多酚提取液色譜圖中保留時間為2.338min的多酚為氨基酚，保留時間為3.117的多酚為酪氨酸。根據(jù)雙孢蘑菇提取液中某種多酚的濃度＝(該標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度/該標(biāo)準(zhǔn)品峰面積)×提取液中該多酚峰面積，計算出雙孢蘑菇多酚提取液中氨基酚的濃度為10.30mg/l，酪氨酸濃度為125.77mg/l，從而計算出雙孢蘑菇中氨基酚含量為0.041mg/g，酪氨酸含量為0.503mg/g。步驟4褐變底物的確定按步驟1、2和3的方法，分別對采后當(dāng)天、貯藏了3天、6天的雙孢蘑菇中的多酚進行提取、分離及含量計算，得到當(dāng)天、第3天、第6天氨基酚含量分別為0.041mg/g、0.024mg/g、0.016mg/g，酪氨酸含量分別為0.503mg/g、0.346mg/g、0.220mg/g。同時利用SC-80C型全自動色差計測定采后當(dāng)天、貯藏了3天、6天的雙孢蘑菇的褐變度，分別為91.23、87.37、79.64。從以上結(jié)果可以看出，氨基酚和酪氨酸的含量均隨雙孢蘑菇褐變度的增加而降低，說明二者均可能為導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物；然后利用紫外分光光度計分別對氨基酚和酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)品在雙孢蘑菇中PPO催化下的反應(yīng)產(chǎn)物及雙孢蘑菇組織自然褐變產(chǎn)物在200～400nm范圍內(nèi)進行紫外吸收光譜掃描，結(jié)果酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品褐變產(chǎn)物與雙孢蘑菇組織自然褐變產(chǎn)物的紫外吸收峰出現(xiàn)在240nm，而氨基酚標(biāo)準(zhǔn)品褐變產(chǎn)物的紫外吸收峰出現(xiàn)在320nm，說明只有酪氨酸是導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物。
實例2
步驟1多酚的提取，取3克雙孢蘑菇果肉，加10mL80％甲醇，冰浴研成勻漿，80℃超純水水浴回流1小時，冷卻后過濾，用80％甲醇定容至20mL，得到雙孢蘑菇中多酚的提取液。
步驟2多酚的分離，利用高效液相色譜儀分別對提取液和多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行分離，分析條件為WATERS600型HPLC，色譜柱為0.4cm×15cm反向C18柱，流動相為18％的甲醇水溶液，另加入甲醇水溶液1.2％的磷酸，流速為0.4ml/min，進樣量15μl，檢測器采用UV254nm，檢測波長280nm，得到雙孢蘑菇中多酚的色譜圖。譜圖中包含兩個明顯的色譜峰，保留時間分別為2.106min和3.004min，峰面積分別為77648mv·min和1077130mv·min。
步驟3多酚種類鑒定和含量測定，將氨基酚、酪氨酸、沒食子酸、鄰苯二酚的標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成100mg/l的溶液，按步驟2的工藝對多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行分離，得到標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。以上各標(biāo)準(zhǔn)品所對應(yīng)色譜峰的保留時間和峰面積分別為氨基酚2.115min、1255810mv·min；酪氨酸3.104min、1427334mv·min；沒食子酸5.702min、6308981mv·min；鄰苯二酚14.100min、5020106mv·min。將雙孢蘑菇中多酚提取液的色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖對照，可以確定雙孢蘑菇多酚提取液色譜圖中保留時間為2.106的多酚為氨基酚，保留時間為3.004的多酚為酪氨酸。根據(jù)雙孢蘑菇提取液中某種多酚的濃度＝(該標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度/該標(biāo)準(zhǔn)品峰面積)×提取液中該多酚峰面積，計算出雙孢蘑菇多酚提取液中氨基酚的濃度為6.18mg/l，酪氨酸濃度為75.46mg/l，從而計算出雙孢蘑菇中氨基酚含量為0.041mg/g，酪氨酸含量為0.503mg/g。
步驟4褐變底物的確定，按步驟1、2和3的方法，分別對采后當(dāng)天、貯藏了3天、6天的雙孢蘑菇中的多酚進行提取、分離及含量計算，得到當(dāng)天、第3天、第6天氨基酚含量分別為0.041mg/g、0.024mg/g、0.016mg/g，酪氨酸含量分別為0.503mg/g、0.346mg/g、0.220mg/g。同時利用SC-80C型全自動色差計測定采后當(dāng)天、貯藏了3天、6天的雙孢蘑菇的褐變度，分別為91.23、87.37、79.64。從以上結(jié)果可以看出，氨基酚和酪氨酸的含量均隨雙孢蘑菇褐變度的增加而降低，說明二者均為可能導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物種類；然后利用紫外分光光度計分別對氨基酚和酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)品在雙孢蘑菇中PPO催化下的反應(yīng)產(chǎn)物及雙孢蘑菇組織自然褐變產(chǎn)物在200～400nm范圍內(nèi)進行紫外吸收光譜掃描，結(jié)果酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品褐變產(chǎn)物與雙孢蘑菇組織自然褐變產(chǎn)物的紫外吸收峰出現(xiàn)在240nm，而氨基酚標(biāo)準(zhǔn)品褐變產(chǎn)物的紫外吸收峰出現(xiàn)在320nm，說明只有酪氨酸為導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物。
上述測定過程所用試劑均為色譜純，水為超純水。
權(quán)利要求
1.一種測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，依次包括雙孢蘑菇中多酚的提取、多酚的分離、多酚物質(zhì)種類鑒定和含量測定、主要褐變底物的確定四個步驟，其特征在于多酚物質(zhì)種類的鑒定和含量測定采用高效液相色譜法法進行，步驟四中先通過分析多酚含量在貯藏過程中的變化與褐變度之間的關(guān)系，初步確定出可能導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物種類，然后對自然褐變產(chǎn)物及標(biāo)準(zhǔn)品褐變產(chǎn)物的紫外吸收光譜進行對照，進而確定導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的主要底物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，其特征在于步驟1中多酚的提取條件和過程為取3～5克雙孢蘑菇果肉，加10～20mL濃度為80％的色譜純甲醇，冰浴研成勻漿，80℃超純水水浴回流1小時，冷卻后過濾，用濃度為80％的甲醇定容至20mL，即為雙孢蘑菇中多酚提取液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，其特征在于步驟2中多酚的分離采用高效液相色譜法，其分析條件為WATERS600型HPLC，色譜柱為0.4cm×15cm反向C18柱，流動相為含甲醇15％～20％的水溶液，另加入甲醇水溶液1％～1.5％的色譜純磷酸，流速為0.3～0.4ml/min，進樣量10～20μl，檢測器采用UV254nm，檢測波長280nm。步驟1所得的多酚提取液在上述條件下經(jīng)高效液相色譜儀分離，得到雙孢蘑菇中多酚的色譜圖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，其特征在于步驟3中多酚物質(zhì)種類鑒定和含量測定采用外標(biāo)法，具體過程為將多酚標(biāo)準(zhǔn)品配制成10～100mg/l的溶液，按步驟2的工藝對多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行分離，得到標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，然后將雙孢蘑菇中多酚的色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖對照，兩張譜圖中保留時間一致的色譜峰所對應(yīng)的多酚可判斷為同一種物質(zhì)，從而確定出雙孢蘑菇中多酚的種類；根據(jù)雙孢蘑菇提取液中某種多酚的濃度＝(該標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度/該標(biāo)準(zhǔn)品峰面積)×提取液中該多酚峰面積，從而計算出雙孢蘑菇中該多酚的含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，其特征在于步驟3中多酚標(biāo)準(zhǔn)品至少包括氨基酚、酪氨酸兩種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，其特征在于步驟4中導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變底物種類的初步確定為按步驟1的工藝對貯藏了不同時間的雙孢蘑菇中的多酚進行提取，然后按步驟2的工藝對提取液進行分離，根據(jù)各峰面積計算各多酚的含量在貯藏過程中的變化，同時利用色差計測定貯藏了不同時間的雙孢蘑菇的褐變度，含量降低速度與雙孢蘑菇褐變度增加速度一致的多酚即為可能導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物種類。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，其特征在于步驟4中導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變主要底物的確定為分別將初步確定出可能導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物種類的標(biāo)準(zhǔn)品在雙孢蘑菇中PPO催化下的反應(yīng)產(chǎn)物以及雙孢蘑菇組織自然褐變產(chǎn)物在200nm～400nm之間進行紫外吸收光譜掃描，與雙孢蘑菇組織自然褐變產(chǎn)物的紫外吸收光譜一致的標(biāo)準(zhǔn)品所對應(yīng)的底物種類即為導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，其特征在于步驟4中雙孢蘑菇組織褐變度采用全自動色差計測定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定雙孢蘑菇褐變底物的方法，依次包括雙孢蘑菇中多酚的提取、多酚的分離、多酚物質(zhì)種類鑒定和含量測定、主要褐變底物的確定四個步驟，其特征在于多酚物質(zhì)種類的鑒定和含量測定采用高效液相色譜法進行，步驟四中先通過分析多酚含量在貯藏過程中的變化與褐變度之間的關(guān)系，初步確定出可能導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的底物種類，然后對自然褐變產(chǎn)物及標(biāo)準(zhǔn)品褐變產(chǎn)物的紫外吸收光譜進行對照，進而確定導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的主要底物。一般說來生物體內(nèi)含有多種酚類物質(zhì)，但只有1種或少數(shù)幾種是多酚氧化酶的主要底物，本發(fā)明能準(zhǔn)確測定引起雙孢蘑菇褐變的主要多酚的種類和含量，對進一步研究其褐變機理以及褐變抑制措施均具有重要意義。
文檔編號G01N21/31GK101038279SQ20071001434
公開日2007年9月19日 申請日期2007年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月18日
發(fā)明者朱繼英, 王相友, 王娟 申請人:山東理工大學(xué)