專利名稱：：高效液相色譜法測定多利培南含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥物分析領(lǐng)域，具體涉及高效液相色譜法測定多利培南含量的方法。
背景技術(shù)：
：隨著抗生素在臨床上的大量應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。在新抗生素的研發(fā)中，近年來國外從典型的I3—內(nèi)酰胺抗生素研究領(lǐng)域正向非典型的P—內(nèi)酰胺抗生素研究領(lǐng)域轉(zhuǎn)化。碳青酶烯類抗生素就是非典型的卩一內(nèi)酰胺抗生素的一種。多利培南(doripenem)為日本Shionogi公司開發(fā)的碳青酶烯類新廣譜抗生素，具有抗菌譜廣、對絕大多數(shù)P-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定的特點(diǎn)。本品已于2005年9月在日本上市，具有良好的臨床應(yīng)用價值和市場前景。EP1270575A1中公開的多利培南的含量測定方法是采用高效液相色譜儀、紫外檢測器和十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，色譜條件為以對乙酰氨基酚為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，0.002mol/L的磷酸鹽溶液(pH5.8):乙腈=191:9為流動相，檢測波長為240nm。比較多利培南與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的色譜峰面積，并用多利培南標(biāo)準(zhǔn)品以外標(biāo)法定量。該方法存在以下不足之處(D對緩沖液pH要求苛刻，只能在pH5.8時正常測定，pH稍有變動，峰形就會分叉，不能正常測定。②使用240nm作為檢測波長，非多利培南的最大吸收波長，方法靈敏度較低，最小檢測限為3ng。③使用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，配置樣品、結(jié)果計算都比較麻煩。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中多利培南的含量測定方法對緩沖液pH要求苛刻、靈敏度較低及不夠方便等缺點(diǎn)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高效液相色譜法測定多利培南含量的方法，采用紫外檢測器進(jìn)行測定，其特征在于，該方法采用的色譜柱為辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(反相色譜柱)，流動相為磷酸的鈉鹽水溶液和乙腈，且磷酸的鈉鹽水溶液的pH為5.06.0。所述的磷酸的鈉鹽水溶液為NaH2P04、Na2HP04或Na3P04的水溶液，優(yōu)選NaH2P04水溶液。所述的磷酸的鈉鹽水溶液與乙腈的體積比為100:10100:1，優(yōu)選100:4。所述的磷酸的鈉鹽水溶液濃度為0.010.2mol/L，優(yōu)選0.02mol/L。所述的磷酸的鈉鹽水溶液的pH優(yōu)選為5.7。所述的磷酸的鈉鹽水溶液的pH值優(yōu)選用NaOH或磷酸來調(diào)節(jié)。所述的紫外檢測器的檢測波長優(yōu)選為292nm。以下提供本發(fā)明含量測定方法的實驗部分，以證明本發(fā)明方法的優(yōu)越性l.流動相的選擇1.1選取辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(5(im，①4.6X150mm)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>1.2選取辛垸基硅烷鍵合硅膠色譜柱(5|iim，0)4.6X150mm)，流動相為0.02mol/L的NaH2P04水溶液(pH5.7):乙腈<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>100:7、100:4、100:2的HPLC譜圖見附圖1、附圖2、附圖3綜合分析優(yōu)選的流動相組合為0.02mol/L的NaH2P04水溶液(pH5.7)和乙腈。100:10100:1都可以作為合適的比例，考慮到保留時間的因素，100:4為最佳比例。2.不同反相色譜柱和磷酸的鈉鹽水溶液濃度的選擇選取辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(5pm，04.6X150mm)、十八垸基硅烷鍵合硅膠色譜柱(5pm，04.6X150mm)兩種反相色譜柱。流動相磷酸的鈉鹽水溶液(NaH2P04，用NaOH調(diào)節(jié)到pH5.7):乙腈=100:4檢測波長292nm柱溫40°C樣品0.5mg/ml的多利培南水溶液進(jìn)樣量lOpL流速1.0ml/min不同反相色譜柱及磷酸的鈉鹽水溶液濃度下的保留時間(RT)0.002mol/L0.01mol/L0.02mol/LO.lmol/L0.2mol/L十八烷基硅垸鍵合硅膠色譜柱RT不穩(wěn)定約8min約9min約10min約llmin辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱色譜峰易裂分約4min約5min約6min約8min綜合分析磷酸的鈉鹽水溶液濃度很低時，色譜峰不穩(wěn)定；使用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時，分析時間較長。故選擇辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，在磷酸的鈉鹽水溶液濃度為0.01-0.2mol/ml的條件下都可以進(jìn)行分析。但考慮到磷酸的鈉鹽水溶液濃度過高時，容易使磷酸的鈉鹽水溶液從流動相中析出，有可能損傷色譜柱和儀器。故優(yōu)選的磷酸的鈉鹽水溶液濃度定為0.02mol/L。3.磷酸的鈉鹽水溶液pH值的選擇色譜柱辛垸基硅垸鍵合硅膠色譜柱(5pm，0>4.6X150mm)流動相磷酸的鈉鹽水溶液(0.02mol/LNaH2PO4，用NaOH調(diào)節(jié)pH，pH4.0用磷酸調(diào)節(jié))乙腈=100:4檢測波長292nm柱溫40。C樣品0.5mg/ml的多利培南水溶液進(jìn)樣量10pL流速l.Oml/min<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>pH5.3、pH6.0的HPLC譜圖見附圖4、附圖5綜合分析磷酸的鈉鹽水溶液pH值較低時(4.0)，保留時間過短，不利于分析。磷酸的鈉鹽水溶液pH值過較高時(7.0)，柱效很低。故選擇pH5.06.0作為磷酸的鈉鹽水溶液的pH范圍，在保證柱效的同時，使保留時間適中。4.檢測波長的選擇多利培南的紫外最大吸收波長在292nm，以292nm作為紫外檢測器的分析波長時，峰面積響應(yīng)值最大，最低檢測限可達(dá)0.5ng，使本分析方法的靈敏度提高。對比以非最大吸收波長240nm作為分析波長時，靈敏度明顯降低。故選擇292nm為紫外檢測波長。<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>最小檢測限的HPLC譜圖見附圖6。因此，最優(yōu)選地，本發(fā)明的多利培南(原料藥或多利培南注射用凍干粉末)的含量測定方法的具體步驟為，在帶有紫外檢測器的高效液相色譜儀上，取辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，流動相為NaH2P04水溶液(0.02mol/L，用NaOH調(diào)節(jié)到pH5.7):乙腈=100:4;檢測波長為292nm。精密稱取多利培南約25mg，置50ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試溶液；精密稱取多利培南標(biāo)準(zhǔn)品約25mg，置50ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)樣l(HiL，記錄色譜圖，量取多利培南峰面積。用以下公式計算得多利培南的含量。標(biāo)準(zhǔn)品稱樣量X供試品峰面積含量=-X100%供試品稱樣量X標(biāo)準(zhǔn)品峰面積本發(fā)明測定方法相對于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于-1.使用辛烷基硅垸鍵合硅膠色譜柱和0.010.2mol/L的磷酸的鈉鹽水溶液濃度之后，在pH5.06.0范圍內(nèi)都可以測定多利培南，且峰形良好；2.使用292nm作為檢測波長，是多利培南的最大吸收波長，方法靈敏度高，最小檢測限可達(dá)0.5ng;3.使用外標(biāo)法，配置樣品、結(jié)果計算都比較簡單。圖1為磷酸的鈉鹽水溶液(0.02mol/LNaH2PO4，pH5.7):乙腈=100:7的HPLC譜圖2為磷酸的鈉鹽水溶液(0.02mol/LNaH2PO4，pH5.7):乙腈=100:4的HPLC譜圖3為磷酸的鈉鹽水溶液(0.02mol/LNaH2PO4，pH5.7):乙腈=100:2的HPLC譜圖4為磷酸的鈉鹽水溶液(0.02mol/L，NaH2P04)pH為5.3時的HPLC譜圖5為磷酸的鈉鹽水溶液(0.02mol/L，NaH2P04)pH為6.0時的HPLC譜圖6為最小檢測限的HPLC譜圖；圖7為實施例4的HPLC譜圖；圖8為實施例5的HPLC譜圖。具體實施例方式實施例1取辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；流動相為0.2mol/L的NaH2P04水溶液(用NaOH調(diào)節(jié)到pH5.0):乙腈=100:4;檢測波長為292nm。精密稱取多利培南原料藥(購自日本Shionogi公司)25.7mg，置50ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試溶液；精密稱取多利培南標(biāo)準(zhǔn)品25.4mg，置50ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)樣10pL，記錄色譜圖，量取多利培南峰面積。計算得多利培南的含量為99.13%。實施例2取辛垸基硅烷鍵合硅膠色譜柱；流動相為0.01mol/L的Na2HP04水溶液(用NaOH調(diào)節(jié)到pH5.3):乙腈=100:7;檢測波長為292nm。精密稱取多利培南原料藥(購自日本Shionogi公司)24.3mg，置50ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試溶液；精密稱取多利培南標(biāo)準(zhǔn)品25.6mg，置50ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)樣l(HiL，記錄色譜圖，量取多利培南峰面積。計算得多利培南的含量為99.31%。實施例3取辛烷基硅垸鍵合硅膠色譜柱；流動相為0.1mol/L的Na3P04水溶液(用磷酸調(diào)節(jié)到pH6.0):乙腈二100:2;檢測波長為292nm。精密稱取多利培南原料藥(購自日本Shionogi公司)25.5mg，置50ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試溶液；精密稱取多利培南標(biāo)準(zhǔn)品25.0mg，置50ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)樣l(HiL，記錄色譜圖，量取多利培南峰面積。計算得多利培南的含量為98.91%。實施例4取辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；流動相為0.02mol/L的NaH2P04水溶液(用磷酸調(diào)節(jié)到pH5.7):乙腈=100:4;檢測波長為292nm。精密稱取多利培南原料藥(購自日本Shionogi公司)24.9mg，置50ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試溶液；精密稱取多利培南標(biāo)準(zhǔn)品25.2mg，置50ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)樣l(HiL，記錄色譜圖，量取多利培南峰面積。計算得多利培南的含量為99.54%。實施例5取辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；流動相為0.02mol/L的Na2HP04水溶液(用NaOH調(diào)節(jié)到pH5.7):乙腈=100:4;檢測波長為292nm。精密稱取多利培南注射用凍干粉末(購自日本Shionogi公司)24.8mg，置50ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試溶液；精密稱取多利培南標(biāo)準(zhǔn)品24.9mg，置50ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)樣l(HiL，記錄色譜圖，量取多利培南峰面積。計算得多利培南的含量為98.65%。實施例6取辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；流動相為0.1mol/L的NaH2P04水溶液(用NaOH調(diào)節(jié)到pH5.3):乙腈=100:1;檢測波長為292nm。精密稱取多利培南注射用凍干粉末(購自日本Shionogi公司)24.5mg，置50ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試溶液；精密稱取多利培南標(biāo)準(zhǔn)品24.9mg，置50ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)樣l(HiL，記錄色譜圖，量取多利培南峰面積。計算得多利培南的含量為98.71%。權(quán)利要求1.高效液相色譜法測定多利培南含量的方法，采用紫外檢測器進(jìn)行測定，其特征在于，該方法采用的色譜柱為辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，流動相為磷酸的鈉鹽水溶液和乙腈，且磷酸的鈉鹽水溶液的pH為5.0～6.0。2.如權(quán)利要求1所述的測定多利培南含量的方法，其特征在于，所述的磷酸的鈉鹽水溶液為NaH2P04、Na2HP04或Na3P04的水溶液。3.如權(quán)利要求2所述的測定多利培南含量的方法，其特征在于，所述的磷酸的鈉鹽水溶液為NaH2P04水溶液。4.如權(quán)利要求1所述的測定多利培南含量的方法，其特征在于，所述的磷酸的鈉鹽水溶液與乙腈的體積比為100:10100:1。5.如權(quán)利要求4所述的測定多利培南含量的方法，其特征在于，所述的磷酸的鈉鹽水溶液與乙腈的體積比為100:4。6.如權(quán)利要求1或2所述的測定多利培南含量的方法，其特征在于，所述的磷酸的鈉鹽水溶液濃度為0.010.2mol/L。7.如權(quán)利要求6所述的測定多利培南含量的方法，其特征在于，所述的磷酸的鈉鹽水溶液的濃度為0.02mol/L。8.如權(quán)利要求1所述的測定多利培南含量的方法，其特征在于，所述的磷酸的鈉鹽水溶液的pH為5.7。9.如權(quán)利要求1或8所述的測定多利培南含量的方法，其特征在于，所述的磷酸的鈉鹽水溶液的pH值用NaOH或磷酸來調(diào)節(jié)。10.如權(quán)利要求1所述的測定多利培南含量的方法，其特征在于，檢測波長為292nm。全文摘要本發(fā)明公開了一種高效液相色譜法測定多利培南含量的方法，采用紫外檢測器進(jìn)行測定，其特征在于，該方法采用的色譜柱為辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，流動相為磷酸的鈉鹽水溶液和乙腈，且磷酸的鈉鹽水溶液的pH為5.0～6.0。本發(fā)明方法操作簡單、靈敏度高，在pH5.0～6.0范圍內(nèi)都可以測定多利培南，且峰形良好。文檔編號G01N30/00GK101191787SQ20061011855公開日2008年6月4日申請日期2006年11月21日優(yōu)先權(quán)日2006年11月21日發(fā)明者莉劉,周一萌,張慶文,張敏如,李懿睿,潘紅娟申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院