專利名稱:鈉診斷/測定試劑盒及鈉的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種鈉診斷/測定試劑盒,同時(shí)本發(fā)明還涉及測定鈉濃 度的方法,屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
血清中鈉離子含量(簡稱"血鈉")在臨床上有著非常重要的意義,
醫(yī)學(xué)上有三個(gè)決定水平,依次為水平1——115mmo1/1,水平2—— 135mmo1/1,水平3——150mmo1/1。當(dāng)患者血鈉濃度等于或低于水平1 時(shí),可出現(xiàn)神志不清、疲勞、惡心、頭痛、嘔吐和厭食等癥狀,表明 機(jī)體內(nèi)水的比例大于鈉,應(yīng)采用相應(yīng)治療措施;當(dāng)血鈉濃度低于水平 2時(shí),應(yīng)查找低鈉血癥的原因,進(jìn)一步測定血清滲透壓、血鉀并進(jìn)行 尿液分析,以確定診斷;當(dāng)血鈉濃度高于水平3時(shí),應(yīng)檢査其它試驗(yàn) 項(xiàng)目,尋找導(dǎo)致高鈉血癥的原因。
現(xiàn)有技術(shù)中測定鈉離子含量的常用方法有火焰光度計(jì)法、離子 選擇電極法、化學(xué)測定法、原子分光光度法、酶動(dòng)力學(xué)法等。
火焰光度計(jì)法——1950年開始使用并一直沿用至今,可檢測血清、 尿液、腦脊液及胸腹水中的Na+和K+,是一種發(fā)射光譜分析法,其結(jié) 果準(zhǔn)確可靠,廣為臨床采用。該方法分為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法和外標(biāo)準(zhǔn)法兩種。 外標(biāo)準(zhǔn)法操作誤差較大, 一般不采用。現(xiàn)在主要使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)法,即 向標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)液中加進(jìn)相同濃度的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)元素鋰或銫進(jìn)行測定,操 作時(shí),將含鋰的溶液作為稀釋液,同時(shí)測定K+、 Na+和Li+的濃度, 以標(biāo)本與標(biāo)準(zhǔn)液的NaVLi+與K+7Li+比值,計(jì)算Na+、 K+濃度。由于 血清稀釋倍數(shù)大,血清蛋白質(zhì)粘性的影響幾乎可以忽略不計(jì)。
離子選擇電極法——簡稱ISE法,是采用靈敏的特定專用電極, 在專用儀器上進(jìn)行血清和尿等體液中的K+、 Na+的測定,因標(biāo)本用量 少,快速準(zhǔn)確,幾乎有取代其它方法的趨勢。其測定原理是,用離子 選擇電極與參比電極組合起來,浸泡在待測標(biāo)本溶液中進(jìn)行檢測。目 前已有的電極種類有①玻璃膜電極,感應(yīng)材料為玻璃薄膜,有PH 電極、K+電極和Na+電極;②固相膜電極,由難溶性金屬物質(zhì)加壓成 型,以固體膜或單日膜作為感應(yīng)膜,有C卜電極和F-電極;③液態(tài)膜 電極,將環(huán)氧樹脂或內(nèi)裝聚氯乙稀作為感應(yīng)膜,有C^+電極;④用纈 氨霉素膜制成的K+電極。上述電極均有一定的使用壽命,因?yàn)殡姌O使 用一段時(shí)間后就會自動(dòng)老化,有效期長短不一。目前離子選擇電極法 應(yīng)用也較為普遍,但是電極成本昂貴。
此外,化學(xué)測定法主要利用復(fù)環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚, 作為離子載體進(jìn)行測定。由于大環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)有空穴,分子內(nèi)部的氧原子 有未共用電子對可與金屬離子結(jié)合,根據(jù)空穴大小,可選擇性結(jié)合不 同直徑的金屬離子,從而達(dá)到測出離子濃度的目的;原子分光光度法 也可用于檢測血清中K+、 Na+,但操作繁雜,誤差較大,不及火焰光 度法簡便。
酶法測定鈉離子含量的方法,與火焰光度計(jì)法或離子選擇電極法 都有較好的一致性,這種方法抗干擾性強(qiáng)、穩(wěn)定性好,但用生化分析 儀不能同時(shí)測定鈉離子和鉀離子各自的含量,導(dǎo)致這種方法不能得到 推廣應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù),計(jì)量/ 連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的 變化,得以測定鈉濃度的方法,同時(shí),本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方
法的鈉診斷/測定試劑盒,采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或 半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行鈉濃度測定,而且測定速度快、準(zhǔn)確度 高,因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明鈉濃度測定方法原理如下
乳糖+水β-半乳糖苷酶/Na+葡萄糖+半乳糖 半乳糖+輔酶半乳糖脫氫酶 D-半乳糖酸-l,4-內(nèi)酯 +還原型輔酶
這個(gè)方法應(yīng)用需要鈉離子激活的卩-半乳糖苷酶(lactase ; EC 3.2.1.108)酶(偶)聯(lián)半乳糖脫氫酶(galactose 1-dehydrogenase ; EC 1丄1.48 ; EC 1丄1.120)酶促反應(yīng)速率比色法。p-半乳糖苷酶在鈉離 子的激活下酶解乳糖反應(yīng)產(chǎn)生半乳糖,再通過(偶)聯(lián)合半乳糖脫氫 酶的作用,最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔 酶(在340nm處有吸收峰),從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸 光度上升的速度,通過測量340nm處吸光度上升的速度,可以測算鈉 的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明,從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考 慮,無論是單劑、雙劑還是三劑,如下成分關(guān)系的本發(fā)明鈉診斷/測定
試劑盒較為理想
緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
乳糖 20 mmol/LP-半乳糖苷酶 10000 U/L
半乳糖脫氫酶 16000 U/L
本發(fā)明的鈉診斷/測定試劑盒可以是單劑,包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖、!3-半乳糖苷酶/Na+、半乳糖脫氫酶。
試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成 液體試劑,直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、P-半乳糖苷酶/Na+、半乳糖脫氫酶。
輔酶、乳糖、(3-半乳糖苷酶/Na+、半乳糖脫氫酶在試劑1或試劑2 中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使 用;也可以配制成液體試劑,直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。
試劑2
緩沖液、乳糖。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、P-半乳糖苷酶/Na+、半乳糖脫氫酶。
輔酶、乳糖、β-半乳糖苷酶/Na+、半乳糖脫氫酶在試劑1、試劑2 或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水 溶解后使用;也可以配制成液體試劑,直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑,本發(fā)明測定鈉濃度的方法,其輔酶可 以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一
本實(shí)施例的鈉診斷/測定試劑為單試劑,包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
乳糖 20 mmol/L
(3-半乳糖苷酶 10000 U/L
半乳糖脫氫酶 16000 U/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,進(jìn)行冷凍干燥,制成干粉試劑; 使用前,加入純凈水,復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃,反應(yīng)時(shí)間10分鐘,起始 吸光度≤0.1,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測鈉樣品 與試劑的體積比例為1/25,反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng)),延遲時(shí)間 大約1分鐘左右,檢測時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下,檢測主波長340nm吸光度上升的速度,從而測算出鈉的濃
度大小。
實(shí)施例二
本實(shí)施例的鈉診斷/測定試劑為雙試劑,包括
試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶3 mmol/L
乳糖30 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑50 mmol/L
P-半乳糖苷酶16000U/L
半乳糖脫氫酶24000 U/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體雙試劑,可以直接使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C,反應(yīng)時(shí)間10分鐘,起始
吸光度《0.1,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測鈉樣品
與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5,反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng)),
延遲時(shí)間大約1分鐘左右,檢測時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化
分析儀下,檢測主波長340nm吸光度上升的速度,從而測算出鈉的濃
度大小。實(shí)施例三
本實(shí)施例的鈉診斷/測定試劑為三試劑,包括:
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑50 mmol/L 輔酶 3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100 mmol/L 乳糖10 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑50 mmol/L
P-半乳糖苷酶6000 U/L
半乳糖脫氫酶12000 U/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體三試劑,可以直接使用。 測定鈉濃度時(shí),在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃,反應(yīng)時(shí) 間10分鐘,起始吸光度 ≤0.1,測試主波長340nm,測試副波長405nm, 被測鈉樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5,反應(yīng)方 向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng)),延遲時(shí)間大約l分鐘左右,檢測時(shí)間2分鐘 左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下,檢測主波長340nm吸光度上升的速度,從而測算出鈉的濃度大小。
申請人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的,鑒于測定步驟等情況與以上實(shí) 施例類同,不另一一例舉。
總之,實(shí)驗(yàn)證明,采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結(jié)果,并且靈敏度高、精確度好,便于推廣應(yīng) 用。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法的鈉的濃度測定方法,其方法原理如下乳糖+水 β-半乳糖苷酶/Na+ 葡萄糖+半乳糖半乳糖+輔酶 半乳糖脫氧酶 D-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯 +還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下,檢測主波長340nm吸光度上升的速度,測算出鈉的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種鈉診斷/測定試劑盒,主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L 穩(wěn)定劑 1——50mmol/L輔酶 1——6 mmol/L乳糖 1——50mmol/Lβ-半乳糖苷酶 1000——80000 U/L半乳糖脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液體試劑,直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鈉診斷/測定試劑盒,其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖、β-半乳糖苷酶/Na+、半乳糖脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鈉診斷/測定試劑盒,其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖、β-半乳糖苷酶/Na+、半乳糖脫氫酶組成雙劑試劑;試劑l,由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖組成;試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、!3-半乳糖苷酶/Na+、半乳糖脫氫酶組 成。輔酶、乳糖、p-半乳糖苷酶/Na+、半乳糖脫氫酶在試劑1或試 劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鈉診斷/測定試劑盒,其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖、(3-半乳糖苷酶/Na+、半乳糖脫氫 酶組成多劑試劑;試劑l,由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成;試劑2, 由緩沖液、乳糖組成;試劑3,由緩沖液、穩(wěn)定劑、p-半乳糖苷酶 /Na+、半乳糖脫氫酶組成。輔酶、乳糖、P-半乳糖苷酶/Na+、半乳 糖脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鈉診斷/測定試劑盒,其特征在于還包括穩(wěn) 定劑1-4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸 銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鈉診斷/測定試劑盒,同時(shí)本發(fā)明還涉及測定鈉濃度的方法原理、試劑的組成及成分,屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、乳糖、β-半乳糖苷酶、半乳糖脫氫酶及穩(wěn)定劑;通過將樣品與試劑按一定的體積比混合,使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng),再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下,檢測主波長340nm處吸光度上升的速度,從而測算出鈉的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果。
文檔編號G01N33/84GK101173929SQ20061009730
公開日2008年5月7日 申請日期2006年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司