專利名稱：細(xì)胞色素c分子自組裝納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物納米電化學(xué)及電分析領(lǐng)域。涉及一種細(xì)胞色素C分子自組裝納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體及制備方法，為研究細(xì)胞色素C等生物分子直接電化學(xué)提供一種理想的平臺(tái)。
背景技術(shù)：
細(xì)胞色素C在呼吸鏈中起著電子載體的作用，研究其在電極上的直接電化學(xué)，對(duì)于了解生命體內(nèi)能量轉(zhuǎn)換和物質(zhì)代謝具有重要的意義。然而，細(xì)胞色素C在裸固體電極上的電化學(xué)活性極差，這是由于細(xì)胞色素C的電活性集團(tuán)深埋在多肽鏈內(nèi)部，與電極表面距離較遠(yuǎn)，很難與電極表面直接交換電子。利用氧化鋁、金納米粒子等電子傳遞促進(jìn)劑修飾電極表面，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞色素C與電極之間直接快速的電子傳遞。
目前金納米粒子的制備方法通常先將重量百分含量為0.01％氯金酸水溶液50mL加熱至沸騰，然后加入重量百分含量為1％檸檬酸三鈉溶液0.5mL，繼續(xù)煮沸15分鐘后，冷卻至室溫于陰涼處保存?zhèn)溆谩?br> 現(xiàn)有技術(shù)存在的主要問題是金納米粒子不穩(wěn)定，易團(tuán)聚，一般只能保存15天左右，且用于制備金納米粒子的氯金酸試劑價(jià)格昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種結(jié)構(gòu)有序、生物活性好、制備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、穩(wěn)定的細(xì)胞色素C分子自組裝納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體及制備方法。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種用于修飾玻碳電極促進(jìn)細(xì)胞色素C電子傳遞用的分子自組裝納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體，是利用自組裝技術(shù)，以羥基磷灰石納米粒子為基本單元，在三維空間組裝成納米γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體，然后再與細(xì)胞色素C組裝成細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體，該組裝體制備方法如下述將孔徑為50～200nm的多孔γ-氧化鋁模板浸入重量百分含量為1～2％的納米羥基磷灰石溶液中超聲1分鐘，暗處組裝4小時(shí)，取出后用二次蒸餾水清洗干凈，以除去弱吸附的羥基磷灰石，得到γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組合體；再將此組裝體固定在處理好的玻碳電極(Φ＝3mm)表面上，并置于100μmol/L的細(xì)胞色素C溶液中暗處繼續(xù)組裝8小時(shí)，取出后，再用二次蒸餾水沖洗以除去弱吸附的細(xì)胞色素C，得到所述的細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體。
上述的一種用于修飾玻碳電極促進(jìn)細(xì)胞色素C電子傳遞用的分子自組裝納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體，其所述制得的細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體，其細(xì)胞色素C平均表面含量為4.5×10-10～9.7×10-10mol·cm-2。
上述的γ-氧化鋁模板是用草酸-電解法制得以重量百分含量為99.99％的高純鋁箔為陽極，以鉑片作陰極，工作電壓40～80V，在重量百分含量為4％草酸溶液中電解4小時(shí)，利用反向電解法剝離氧化鋁模板，得到孔徑約為50～200nm的多孔γ-氧化鋁模板。
上述的納米羥基磷灰石用沉淀法制得超聲處理氫氧化鈣溶液，然后向其中滴加磷酸，其產(chǎn)物經(jīng)陳化、過濾、干燥后，得到納米羥基磷灰石晶體。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有顯著的技術(shù)進(jìn)步和明顯的效果將孔洞分布均勻有序，且大小可控、方便易得的納米γ-氧化鋁模板，與具有良好的生物相容性，無毒，對(duì)大部分人體蛋白具有親和性、制備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉且能長(zhǎng)期穩(wěn)定儲(chǔ)存的納米羥基磷灰石粉末(克服了金納米粒子穩(wěn)定性差的缺點(diǎn))，和細(xì)胞色素C采用分子自組裝技術(shù)組裝成的細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體，具有生物活性好、制備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、穩(wěn)定不易團(tuán)聚，可以長(zhǎng)期保存，具有良好的生物相容性，無毒，對(duì)大部分人體蛋白具有親和性。


圖1是細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體結(jié)構(gòu)示意2是電化學(xué)測(cè)量裝置簡(jiǎn)3是本發(fā)明細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體修飾的玻碳電極、γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體修飾的玻碳電極、細(xì)胞色素C修飾的玻碳電極，分別在0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液中掃描速度為0.2Vs-1時(shí)的循環(huán)伏安曲線；其中，1-玻碳電極 2-細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體 3-細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體修飾的玻碳電極、γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體修飾的玻碳電極或細(xì)胞色素C修飾的玻碳電極4-Ag/AgCl(飽和KCl)參比電極 5-對(duì)電極6-電解池 7-0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液8-電化學(xué)分析儀 9-細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體修飾玻碳電極在0.2mol/LHAc-NaAc緩沖液中掃描速度為0.2Vs-1時(shí)的循環(huán)伏安曲線10-細(xì)胞色素C修飾玻碳電極在0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液中掃描速度為0.2Vs-1時(shí)的循環(huán)伏安曲線 11-γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體修飾玻碳電極在0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液中掃描速度為0.2Vs-1時(shí)的循環(huán)伏安曲線。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例1(細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體的制備)(1)γ-氧化鋁模板的制備用草酸-電解法制備γ-氧化鋁模板，以重量百分含量為99.99％高純鋁箔為陽極，以鉑片作陰極，工作電壓40V，在4％草酸溶液中電解4小時(shí)，利用反向電解法剝離γ-氧化鋁模板，即得到孔徑約50nm的微孔γ-氧化鋁模板，備用。
(2)納米磷灰石的制備用沉淀法制備納米羥基磷灰石，用超聲處理30mL其濃度為0.3mol/L氫氧化鈣溶液10min，然后向其中滴加重量百分含量為0.017％的磷酸20mL，控制滴定速度約為1mL/min，其產(chǎn)物經(jīng)陳化24小時(shí)，過濾，置于真空烘箱中100℃烘干24小時(shí)，得到納米羥基磷灰石晶體，備用。
(3)玻碳電極的處理分別用粒徑為1.0、0.3、0.05μm的α-Al2O3粉機(jī)械拋光圖1中圓柱形玻碳電極1上表面，在二次蒸餾水中超聲處理后，在2mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.5mol/L KCl溶液中掃描，直至得到穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)伏安圖，表明玻碳電極處理完畢。
(4)細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體的制備將步驟(1)制得的孔徑約為50nm的微孔γ-氧化鋁模板，浸入上述步驟(2)得到的納米羥基磷灰石1wt％的溶液中超聲1分鐘，組裝4小時(shí)，取出后用二次蒸餾水將其清洗干凈，得到γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體；用熔融態(tài)石蠟將該組裝體固定在上述步驟(3)處理好的圓柱形玻碳電極頂部表面上(見圖1)，再將該組合體修飾的電極置于100μmol/L細(xì)胞色素C溶液中暗處繼續(xù)組裝8小時(shí)，取出后再用二次蒸餾水沖洗以除去弱吸附的細(xì)胞色素C，即得到用于修飾玻碳電極的分子自組裝細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體2(見圖1)，其細(xì)胞色素C平均表面含量約為9.7×10-10mol·cm-2。
實(shí)施例2(細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體的制備)(1)納米γ-氧化鋁模板的制備用草酸-電解法制備納米γ-氧化鋁模板，以重量百分含量為99.99％高純鋁箔為陽極，以鉑片作陰極，工作電壓80V，在4％草酸溶液中電解4小時(shí)，利用反向電解法剝離γ-氧化鋁模板，即得到孔徑約為200nm的微孔γ-氧化鋁模板，備用。
(2)納米磷灰石的制備用沉淀法制備納米羥基磷灰石，超聲處理30mL其濃度為0.3mol/L氫氧化鈣溶液10min，然后向其中滴加重量百分含量為0.017％的磷酸20mL，控制滴定速度約為1mL/min，其產(chǎn)物經(jīng)陳化24小時(shí)，過濾，置于真空烘箱中100℃烘干24小時(shí)，得到納米羥基磷灰石晶體，備用。
(3)玻碳電極的處理分別用粒徑為1.0、0.3、0.05μm的α-Al2O3粉機(jī)械拋光圖1中圓柱形玻碳電極1上表面，在二次蒸餾水中超聲處理后，在2mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.5mol/L KCl溶液中掃描，直至得到穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)伏安圖，表明玻碳電極處理完畢。
(4)細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體的制備將步驟(1)制得的孔徑約為200nm的微孔γ-氧化鋁模板浸入上述步驟(2)得到的納米羥基磷灰石1wt％的溶液中超聲1分鐘，組裝4小時(shí)，取出后用二次蒸餾水將其清洗干凈，得到γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體；用熔融態(tài)石蠟將該組裝體固定在上述步驟(3)處理好的圓柱形玻碳電極頂部表面上，再將該組合體修飾的電極置于100μmol/L細(xì)胞色素C溶液中暗處繼續(xù)組裝8小時(shí)，取出后再用二次蒸餾水沖洗以除去弱吸附的細(xì)胞色素C，即得到用于修飾玻碳電極的分子自組裝細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體2(見圖1)，其細(xì)胞色素C平均表面含量為4.5×10-10mol·cm-2。
實(shí)施例3(細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體及其制備)(1)納米γ-氧化鋁模板的制備用草酸-電解法制備γ-氧化鋁模板，以重量百分含量為99.99％高純鋁箔為陽極，以鉑片作陰極，工作電壓60V，在4％草酸溶液中電解4小時(shí)，利用反向電解法剝離γ-氧化鋁模板，即得到孔徑約150nm的微孔γ-氧化鋁模板，備用。
(2)納米磷灰石的制備用沉淀法制備納米羥基磷灰石，超聲處理30mL其濃度為0.3mol/L氫氧化鈣溶液10min，然后向其中滴加重量百分含量為0.017％的磷酸20mL，控制滴定速度約為1mL/min，其產(chǎn)物經(jīng)陳化24小時(shí)，過濾，置于真空烘箱中100℃烘干24小時(shí)，得到納米羥基磷灰石晶體，備用。
(3)玻碳電極的處理分別用粒徑為1.0、0.3、0.05μm的α-Al2O3粉機(jī)械拋光圖1中圓柱形玻碳電極1上表面，在二次蒸餾水中超聲處理后，在2mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.5mol/L KCl溶液中掃描，直至得到穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)伏安圖，表明玻碳電極處理完畢。
(4)細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體的制備將步驟(1)制得的孔徑約150nm的微孔γ-氧化鋁模板浸入上述步驟(2)得到的納米羥基磷灰石1.5wt％的溶液中超聲1分鐘，組裝4小時(shí)，取出后用二次蒸餾水將其清洗干凈，得到γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體；用熔融態(tài)石蠟將該組裝體固定在上述步驟(3)處理好的圓柱形玻碳電極頂部表面上，再將該組合體修飾的電極置于100μmol/L細(xì)胞色素C溶液中暗處繼續(xù)組裝8小時(shí)，取出后再用二次蒸餾水沖洗以除去弱吸附的細(xì)胞色素C，即得到用于修飾玻碳電極的分子自組裝細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體2(見圖1)，其細(xì)胞色素C平均表面含量為7.8×10-10mol·cm-2。
實(shí)施例4(本發(fā)明細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合組裝體電化學(xué)性質(zhì)研究)見圖2，采用傳統(tǒng)的三電極系統(tǒng)，以上述制得的細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合組裝體修飾的玻碳電極為工作電極3，Ag/AgCl(飽和KCl)為參比電極4，鉑絲為對(duì)電極5。將前述的各電極置于電解池6內(nèi)的0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液7中，并分別與上海辰華儀器公司生產(chǎn)的CHI 660B電化學(xué)分析儀8的工作電極接口、參比電極接口、對(duì)電極接口連接。在0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液7中，掃描速度為0.2Vs-1時(shí)測(cè)得各組裝體的循環(huán)伏安曲線。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體修飾玻碳電極3有一對(duì)穩(wěn)定、對(duì)稱的氧化還原峰9，其氧化還原式電位[E0′＝(Epa+Epc)/2]為0.22V，為細(xì)胞色素C血紅素輔基中氧化還原活性中心Fe(III)/Fe(II)的氧化還原特征峰，而同樣條件下，細(xì)胞色素C修飾玻碳電極(即將玻碳電極浸入細(xì)胞色素C溶液中直接組裝)、γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體修飾玻碳電極未發(fā)現(xiàn)任何氧化還原峰10、11(以上參見圖3)，表明γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體不僅保持細(xì)胞色素C生物活性不變，且對(duì)細(xì)胞色素C電子傳遞具有促進(jìn)作用。
權(quán)利要求
1.一種用于修飾玻碳電極促進(jìn)細(xì)胞色素C電子傳遞用的分子自組裝納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體，是利用自組裝技術(shù)，以羥基磷灰石納米粒子為基本單元，在三維空間組裝成納米γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體，然后再與細(xì)胞色素C組裝成細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體，該組裝體制備方法如下述將孔徑為50～200nm的多孔γ-氧化鋁模板浸入重量百分含量為1～2％的納米羥基磷灰石溶液中超聲1分鐘，暗處組裝4小時(shí)，取出后用二次蒸餾水清洗干凈，以除去弱吸附的羥基磷灰石，得到γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組合體；再將此組裝體固定在處理好的玻碳電極(Φ＝3mm)表面上，并置于100μmol/L的細(xì)胞色素C溶液中暗處繼續(xù)組裝8小時(shí)，取出后，再用二次蒸餾水沖洗以除去弱吸附的細(xì)胞色素C，得到所述的細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于修飾玻碳電極促進(jìn)細(xì)胞色素C電子傳遞用的分子自組裝納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體，其所述制得的細(xì)胞色素C/γ-氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體，其細(xì)胞色素C平均表面含量為4.5×10-10～9.7×10-10mol·cm-2。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞色素C分子自組裝納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體及制法，以羥基磷灰石納米粒子為基本單元，在三維空間組裝成納米γ－氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體(組裝體1)，然后與細(xì)胞色素C組裝，得到細(xì)胞色素C/γ－氧化鋁模板/羥基磷灰石納米有序復(fù)合結(jié)構(gòu)組裝體，其細(xì)胞色素C平均表面含量為4.5×10
文檔編號(hào)G01N27/36GK1940548SQ20061001722
公開日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2006年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月28日
發(fā)明者秦玉華, 關(guān)曉輝, 孫墨杰, 楊迎軍, 魯敏 申請(qǐng)人:東北電力大學(xué)