專(zhuān)利名稱(chēng)：玉米赤霉烯酮的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種玉米赤霉烯酮的檢測(cè)方法，它是利用玉米赤霉烯酮單克隆抗體制備的免疫親和柱及熒光光度計(jì)來(lái)檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法，屬生物細(xì)胞學(xué)及微生物菌類(lèi)毒性代謝產(chǎn)物檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是由禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、黃色鐮刀菌、串珠鐮刀菌、燕麥鐮刀菌、木賊鐮刀菌等菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，是一類(lèi)雌激素真菌毒素，又稱(chēng)F2毒素。玉米赤霉烯酮主要存在于玉米和玉米制品中，小麥、大麥、高粱、大米中也有一定程度的分布。
玉米赤霉烯酮具有較強(qiáng)的生殖毒性和致畸作用，可引起動(dòng)物發(fā)生雌激素亢進(jìn)癥，導(dǎo)致動(dòng)物不孕或流產(chǎn)，對(duì)家禽特別是豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業(yè)帶來(lái)了很大的損失。飼料中1mg/kg的玉米赤霉烯酮就會(huì)使動(dòng)物產(chǎn)生雌性化，更高的濃度(50~100mg/kg)將會(huì)對(duì)懷孕、排卵、移植、胎兒的發(fā)育、新生動(dòng)物的生存力產(chǎn)生不利的影響。因此，為了加快我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展，我國(guó)正在加大對(duì)飼料的監(jiān)督抽查力度，同時(shí)飼料中玉米赤霉烯酮含量成為檢驗(yàn)檢疫的重點(diǎn)之一，所以選擇適當(dāng)可行的方法檢驗(yàn)ZEN成為當(dāng)務(wù)之急。
目前玉米赤霉烯酮的測(cè)定方法有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。薄層色譜法雖然具有簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，但操作步驟多，靈敏度低。氣相色譜法、高效液相色譜法靈敏度高，但樣品處理煩瑣，操作復(fù)雜，儀器昂貴。另外，這些測(cè)定方法在操作過(guò)程中需要使用劇毒ZEN作標(biāo)準(zhǔn)物，預(yù)處理時(shí)需要用到有毒、異味有機(jī)溶劑，這些物質(zhì)不僅毒害操作人員，而且污染環(huán)境。以上這些方法只適合于實(shí)驗(yàn)室中測(cè)定，無(wú)法實(shí)現(xiàn)推廣和普及，所以絕大部分企業(yè)根本不進(jìn)行ZEN的監(jiān)督和檢測(cè)工作，一直處于放任自流的狀況。因此尋找一種經(jīng)濟(jì)、快捷、準(zhǔn)確并且易于普及推廣的ZEN檢測(cè)方法是當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷、精確、安全的玉米赤霉烯酮的檢測(cè)方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用玉米赤霉烯酮單克隆抗體的免疫親和柱和熒光光度計(jì)來(lái)檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明一種玉米赤霉烯酮的檢測(cè)方法，它是以單克隆抗體免疫親和柱為分離裝置，用熒光光度計(jì)為檢測(cè)工具的檢測(cè)方法，該方法的特征是具有以下檢測(cè)過(guò)程和步驟A.免疫親和柱的準(zhǔn)備和制備a.制備單克隆抗體，單克隆抗體的制備要通過(guò)抗原合成、小鼠免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤篩選及獲取雜交瘤細(xì)胞株、采集單克隆抗體等步驟來(lái)獲得，其步驟為(a)抗原合成1.玉米赤霉烯酮-羧甲氧肟的制備稱(chēng)取玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品18mg和羰基甲氧胺45mg放置棕小瓶中，加入0.6ml吡啶使之溶解，在室溫?cái)嚢?4小時(shí)后，用真空泵抽干，然后用5ml蒸餾水溶解，用NaOH調(diào)節(jié)PH至9.0，用二氯甲烷4ml連續(xù)抽提3次，上層水溶液再用HCL調(diào)節(jié)PH至2.0，靜止5分鐘，再用用二氯甲烷4ml連續(xù)抽提3次，合并收集3次二氯甲烷液，再用無(wú)水硫酸鈉脫水，用真空泵將二氯甲烷抽干，殘留物即是玉米赤霉烯酮-羧甲氧肟，即玉米赤霉烯酮-Oxime。2.玉米赤霉烯酮免疫抗原的制備稱(chēng)取玉米赤霉烯酮-羧甲氧肟，15mg溶解在1ml二氧六環(huán)試劑中，加入溶解在1.5ml蒸餾水、PH6.0的BSA(牛血清白蛋白)或OVA(卵白蛋白)約22mg。在1小時(shí)內(nèi)加入180mgEDC(碳二亞胺)，并用HCL維持PH為6.0，室溫?cái)嚢?4小時(shí)，然后再加180mgEDC，不斷使溶液維持在PH6.0，繼續(xù)攪拌48小時(shí)左右，用0.01MPBS(PH7.2磷酸緩沖液)充分透析，離心分離后無(wú)菌過(guò)濾、分裝、待用。
(b).小鼠免疫以玉米赤霉烯酮(簡(jiǎn)稱(chēng)ZEN)和牛血清蛋白BSA的偶聯(lián)復(fù)合物(ZEN-BSA)為免疫原免疫小鼠；用60ug抗原ZEN-BSA與50ul弗氏完全佐劑乳化后腹腔注射每只10周齡BALB/C雄性小鼠，一個(gè)月后再次免疫，腹腔注射60ug抗原與弗氏不完全佐劑乳化后的抗原，再經(jīng)過(guò)2個(gè)月后加強(qiáng)免疫，采用尾靜脈注射劑量為60ug抗原，4天后取出小鼠的脾臟細(xì)胞，進(jìn)行下一步的細(xì)胞融合；(c).細(xì)胞融合免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞X63-Ag8.653以10∶1混勻，借助50％聚乙二醇(PEG1500)進(jìn)行融合，融合細(xì)胞用HAT選擇培養(yǎng)基于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；7天后更換HT培養(yǎng)液，第10天進(jìn)行陽(yáng)性孔篩選；
(d).雜交瘤篩選及獲取雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行陽(yáng)性孔篩選采用間接非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法；將篩選得到的強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋克隆化，反復(fù)克隆多次，獲得多株能穩(wěn)定分泌抗玉米赤霉烯酮抗體的雜交瘤細(xì)胞株，對(duì)其中的4E5進(jìn)行系統(tǒng)鑒定后待用；(e).采集單克隆抗體將上述4E5雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后，注入預(yù)先注射有降植烷的小鼠腹腔內(nèi)，使其生長(zhǎng)腹水瘤；10天后采集腹水，該腹水中含有大量單克隆抗體；保存好該單克隆抗體備用；b.利用上述的單克隆抗體來(lái)制備免疫親和柱，其步驟如下(a).稱(chēng)取適量溴化氰活化的的瓊脂糖干粉用1mM的稀鹽酸使其溶脹，然后在燒結(jié)玻璃濾器上沖洗以除去雜質(zhì)；(b).將溶脹后的瓊脂糖凝膠在偶聯(lián)緩沖液中與上述制備得到得單克隆抗體均勻混合，并在室溫下震蕩充分反應(yīng)1小時(shí)，偶聯(lián)緩沖液由0.1M NaHCO3和0.5M NaCL配成，PH值為8.3；(c).除去未與瓊脂糖凝膠結(jié)合的游離抗體；(d).封閉瓊脂糖凝膠珠上殘余的活性基團(tuán)，用0.1MPH值為8.0的Tris-HCl處理偶聯(lián)復(fù)合物，并靜置2小時(shí)；(e).用含有0..5MNaCl，PH值為4.0的0.1M的乙酸緩沖液淋洗偶聯(lián)復(fù)合物一次，再用含有0.5MNaCl，PH值為8.0的0.1MTris-HCl緩沖液淋洗一次，如此循環(huán)反復(fù)清洗3次；(f).最后將瓊脂糖一抗體復(fù)合物填充入55×6mm層析柱中，即制成免疫親和柱。平衡備用；B.食品和飼料中玉米赤霉烯酮的分離與檢測(cè)方法稱(chēng)取適量樣品，用一定比例的甲醇/水提取其中的ZEN，經(jīng)過(guò)過(guò)濾步驟并進(jìn)行適當(dāng)稀釋之后，將液體樣品流經(jīng)親和柱達(dá)到凈化的目的，再用甲醇將親和柱上的ZEN洗脫下來(lái)，在洗脫液中加入氯化鋁溶液衍生，提高檢測(cè)靈敏度，然后用熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣液中玉米赤霉烯酮的含量。
同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法具有如下顯而易見(jiàn)的特點(diǎn)和突出的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明方法具有快捷、經(jīng)濟(jì)、精確度高等并且易于推廣普及。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，能直接讀取測(cè)試結(jié)果，能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此，能有效地在食品的生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存和銷(xiāo)售過(guò)程中對(duì)玉米赤霉烯酮實(shí)行監(jiān)控和檢測(cè)。
本發(fā)明方法可以進(jìn)行玉米赤霉烯酮的測(cè)定，測(cè)量范圍為0.01～10mg/kg。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一一、免疫親和柱的準(zhǔn)備和制備1.制備單克隆抗體，單克隆抗體的制備要通過(guò)小鼠免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤篩選及獲取雜交瘤細(xì)胞株、采集單克隆抗體等步驟來(lái)獲得，其步驟為(1)抗原合成a.玉米赤霉烯酮-羧甲氧肟的制備稱(chēng)取玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品18mg和羰基甲氧胺45mg放置棕小瓶中，加入0.6ml吡啶使之溶解，在室溫?cái)嚢?4小時(shí)后，用真空泵抽干，然后用5ml蒸餾水溶解，用NaOH調(diào)PH至9.0，用二氯甲烷4ml連續(xù)抽提3次，上層水溶液再用HCL調(diào)PH至2.0，靜止5分鐘，再用用二氯甲烷4ml連續(xù)抽提3次，合并收集3次二氯甲烷液，再用無(wú)水硫酸鈉脫水，用真空泵將二氯甲烷抽干，殘留物即是玉米赤霉烯酮-羧甲氧肟。
b.玉米赤霉烯酮免疫抗原的制備稱(chēng)取玉米赤霉烯酮-羧甲氧肟15mg溶解在1ml二氧六環(huán)試劑中，加入溶解在1.5ml蒸餾水、PH6.0的BSA(牛血清白蛋白)或OVA(卵白蛋白)約22mg。在1小時(shí)內(nèi)加入180mgEDC碳二亞胺，并用HCL維持PH為6.0，室溫?cái)嚢?4小時(shí)，然后再加180mgEDC，不斷使溶液維持在PH6.0，繼續(xù)攪拌48小時(shí)左右，用0.01MPBS(PH7.2磷酸緩沖液)充分透析，離心后無(wú)菌過(guò)濾、分裝、待用。
(2).小鼠免疫以玉米赤霉烯酮(簡(jiǎn)稱(chēng)ZEN)和牛血清蛋白BSA的偶聯(lián)復(fù)合物(ZEN-BSA)為免疫原免疫小鼠；用60ug抗原ZEN-BSA與50ul弗氏完全佐劑乳化后腹腔注射每只10周齡BALB/C雄性小鼠，一個(gè)月后再次免疫，腹腔注射60ug抗原與弗氏不完全佐劑乳化后的抗原，再經(jīng)過(guò)2個(gè)月后加強(qiáng)免疫，采用尾靜脈注射劑量為60ug抗原，4天后取出小鼠的脾臟細(xì)胞，進(jìn)行下一步的細(xì)胞融合；(3).細(xì)胞融合免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞X63-Ag8.653以10∶1混勻，借助50％聚乙二醇(PEG1500)進(jìn)行融合，融合細(xì)胞用HAT選擇培養(yǎng)基于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；7天后更換HT培養(yǎng)液，第10天進(jìn)行陽(yáng)性孔篩選；
(4).雜交瘤篩選及獲取雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行陽(yáng)性孔篩選采用間接非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法；將篩選得到的強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋克隆化，反復(fù)克隆多次，獲得多株能穩(wěn)定分泌抗玉米赤霉烯酮抗體的雜交瘤細(xì)胞株，對(duì)其中的4E5進(jìn)行系統(tǒng)鑒定后待用；(5).采集單克隆抗體將上述4E5雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后，注入預(yù)先注射有降植烷的小鼠腹腔內(nèi)，使其生長(zhǎng)腹水瘤；10天后采集腹水，該腹水中含有大量單克隆抗體；保存好該單克隆抗體備用；2.利用上述的單克隆抗體來(lái)制備免疫親和柱，其步驟如下(1).稱(chēng)取適量溴化氰活化的瓊脂糖干粉用1mM的稀鹽酸使其溶脹，然后在燒結(jié)玻璃濾器上沖洗以除去雜質(zhì)；(2).將溶脹后的瓊脂糖凝膠在偶聯(lián)緩沖液中與上述制備得到得單克隆抗體均勻混合，并在室溫下震蕩充分反應(yīng)1小時(shí)，偶聯(lián)緩沖液由0.1M NaHCO3和0.5M NaCL配成，PH值為8.3；(3).除去未與瓊脂糖凝膠結(jié)合的游離抗體；(4).封閉瓊脂糖凝膠珠上殘余的活性基團(tuán)，用0.1MPH值為8.0的Tris-HCl處理偶聯(lián)復(fù)合物，并靜置2小時(shí)；(5).用含有0..5MNaCl，PH值為4.0的0.1M的乙酸緩沖液淋洗偶聯(lián)復(fù)合物一次，再用含有0.5MNaCl，PH值為8.0的0.1MTris-HCl緩沖液淋洗一次，如此循環(huán)反復(fù)清洗3次；(6).最后將瓊脂糖—抗體復(fù)合物填充入55×6mm層析柱中，即制成免疫親和柱。平衡備用；二玉米原料中玉米赤霉烯酮的分離與檢測(cè)方法1.樣品提取玉米磨細(xì)，使粒度小于2mm，準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品50.0克，加入氯化鈉5.0克和80％甲醇-水溶液100ml，用高速均質(zhì)器高速攪拌1分鐘，然后定量濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取10ml濾液，用1％Tween-PBS 40ml共混均勻，再用玻璃纖維濾紙過(guò)濾，濾液備用。
2.試樣濾液凈化將ZEN免疫親和柱連接于10ml玻璃注射器下，準(zhǔn)確移取上述濾液(相當(dāng)于1克樣品)，注入玻璃注射器中，控制壓力使溶液以6ml/min的流速緩慢通過(guò)ZEN免疫親和柱，直至2-3ml空氣通過(guò)柱體。以10ml1％的Tween-PBS溶液淋洗柱子1次，再用10ml蒸餾水淋洗柱子1次，棄去全部流出液，再使2-3ml空氣通過(guò)柱體。然后準(zhǔn)確加入1ml甲醇進(jìn)行洗脫，流速為1-2ml/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中備用。
3、熒光光度計(jì)測(cè)定(1)熒光光度計(jì)(VICAM VI SERIES 4)校準(zhǔn)在激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm條件下，取熒光光度計(jì)校準(zhǔn)溶液(綠色)，以此來(lái)調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的讀數(shù)值為-0.05ppm；取熒光光度計(jì)校準(zhǔn)溶液(紅色)，調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的讀數(shù)值為0.45ppm；取熒光光度計(jì)校準(zhǔn)溶液(黃色)，調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的讀數(shù)值為0.2ppm。
(2)測(cè)定取上述試樣洗脫液加入1.0ml氯化鋁衍生溶液，混合均勻后靜置5分鐘，于熒光光度計(jì)上測(cè)定樣液中玉米赤霉烯酮含量。樣品中玉米赤霉烯酮的檢測(cè)結(jié)果如表1所示表1飼料中ZEN的檢測(cè)結(jié)果

從測(cè)定結(jié)果可以得出，所檢測(cè)飼料中的玉米赤霉烯酮的含量其平均值為183.33ppm，且三個(gè)平行檢測(cè)的結(jié)果批內(nèi)變異系數(shù)為3.1％，說(shuō)明免疫親和柱性能穩(wěn)定，完全可以實(shí)際檢測(cè)。
本發(fā)明中采用的免疫親和柱的回收效果良好，它具有較高的回收率，可以通過(guò)熒光光度計(jì)檢測(cè)免疫親和柱的回收效果，檢測(cè)方法如下將ZEN標(biāo)準(zhǔn)品以不同濃度添加到不含ZEN的樣品中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)提取方法提取ZEN，用本發(fā)明的免疫親和柱凈化后，在真菌毒素?zé)晒夥治鰞x上直接讀取ZEN濃度結(jié)果，計(jì)算回收率，其結(jié)果如下表2所示表2熒光光度計(jì)檢測(cè)回收率結(jié)果添加ZEN濃度(mg/kg)次數(shù)50100200
熒光計(jì)實(shí)際測(cè)得值(mg/kg)1 45961902 43931903 4793195平均值4511.67 191.67平均回收率(％)909495.8變異系數(shù)(％) 4.4 1.8 1.5從上表檢測(cè)結(jié)果可知，其回收率均在90％以上，處于《中華人民共和國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》的范圍之內(nèi)。由此表明本發(fā)明所采用的免疫親和柱完全可以滿足ZEN快速檢測(cè)的需要。
權(quán)利要求
1.一種玉米赤霉烯酮的檢測(cè)方法，它是以單克隆抗體免疫親和柱為分離裝置，用熒光光度計(jì)為檢測(cè)工具的檢測(cè)方法，該方法的特征是具有以下檢測(cè)過(guò)程和步驟A.免疫親和柱的準(zhǔn)備和制備a.制備單克隆抗體，單克隆抗體的制備通過(guò)抗原合成、小鼠免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤篩選及獲取雜交瘤細(xì)胞株、采集單克隆抗體步驟來(lái)獲得，其具體步驟為(a).抗原合成第一步是玉米赤霉烯酮-羧甲氧肟的制備稱(chēng)取玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品18mg和羰基甲氧胺45mg放置棕小瓶中，加入0.6ml吡啶使之溶解，在室溫?cái)嚢?4小時(shí)后，用真空泵抽干，然后用5ml蒸餾水溶解，用NaOH調(diào)PH至9.0，用二氯甲烷4ml連續(xù)抽提3次，上層水溶液再用HCL調(diào)節(jié)PH至2.0，靜止5分鐘，再用用二氯甲烷4ml連續(xù)抽提3次，合并收集3次二氯甲烷液，再用無(wú)水硫酸鈉脫水，用真空泵將二氯甲烷抽干，殘留物即是玉米赤霉烯酮-羧甲氧肟；第二步玉米赤霉烯酮免疫抗原的制備稱(chēng)取玉米赤霉烯酮-羧甲氧肟15mg溶解在1ml二氧六環(huán)試劑中，加入溶解在1.5ml蒸餾水、PH6.0的BSA(牛血清白蛋白)或OVA(卵白蛋白)約22mg；在1小時(shí)內(nèi)加入180mgEDC(碳二亞胺)，并用HCL維持PH為6.0，室溫?cái)嚢?4小時(shí)，然后再加180mgEDC，不斷使溶液維持在PH6.0，繼續(xù)攪拌48小時(shí)左右，用0.01MPBS(PH7.2磷酸緩沖液)充分透析，離心分離后無(wú)菌過(guò)濾、分裝、待用；(b).小鼠免疫以玉米赤霉烯酮，簡(jiǎn)稱(chēng)ZEN和牛血清蛋白BSA的偶聯(lián)復(fù)合物，即ZEN-BSA為免疫原免疫小鼠；用60ug抗原ZEN-BSA與50ul弗氏完全佐劑乳化后腹腔注射每只10周齡BALB/C雄性小鼠，一個(gè)月后再次免疫，腹腔注射60ug抗原與弗氏不完全佐劑乳化后的抗原，再經(jīng)過(guò)2個(gè)月后加強(qiáng)免疫，采用尾靜脈注射劑量為60ug抗原，4天后取出小鼠的脾臟細(xì)胞，進(jìn)行下一步的細(xì)胞融合；(c).細(xì)胞融合免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞X63-Ag8.653以10∶1混勻，借助50％聚乙二醇進(jìn)行融合，融合細(xì)胞用HAT選擇培養(yǎng)基于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；7天后更換HT培養(yǎng)液，第10天進(jìn)行陽(yáng)性孔篩選；(d).雜交瘤篩選及獲取雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行陽(yáng)性孔篩選采用間接非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法；將篩選得到的強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋克隆化，反復(fù)克隆多次，獲得多株能穩(wěn)定分泌抗玉米赤霉烯酮抗體的雜交瘤細(xì)胞株，對(duì)其中的4E5進(jìn)行系統(tǒng)鑒定后待用；(e).采集單克隆抗體將上述4E5雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后，注入預(yù)先注射有降植烷的小鼠腹腔內(nèi)，使其生長(zhǎng)腹水瘤；10天后采集腹水，該腹水中含有大量單克隆抗體；保存好該單克隆抗體備用；b.利用上述的單克隆抗體來(lái)制備免疫親和柱，其步驟如下(a).稱(chēng)取適量溴化氰活化的瓊脂糖干粉，用1mM的稀鹽酸使其溶脹，然后在燒結(jié)玻璃濾器上沖洗以除去雜質(zhì)；(b).將溶脹后的瓊脂糖凝膠在偶聯(lián)緩沖液中與上述制備得到的單克隆抗體均勻混合，并在室溫下震蕩充分反應(yīng)1小時(shí)，偶聯(lián)緩沖液由0.1M NaHCO3和0.5MNaCL配成，PH值為8.3；(c).除去未與瓊脂糖凝膠結(jié)合的游離抗體；(d).封閉瓊脂糖凝膠珠上殘余的活性基團(tuán)，用0.1MPH值為8.0的Tris-HCl處理偶聯(lián)復(fù)合物，并靜置2小時(shí)；(e).用含有0..5MNaCl，PH值為4.0的0.1M的乙酸緩沖液淋洗偶聯(lián)復(fù)合物一次，再用含有0.5MNaCl，PH值為8.0的0.1MTris-HCl緩沖液淋洗一次，如此循環(huán)反復(fù)清洗3次；(f).最后將瓊脂糖-抗體復(fù)合物填充入55×6mm層析柱中，即制成免疫親和柱。平衡備用；B.食品和飼料中玉米赤霉烯酮的分離與檢測(cè)方法稱(chēng)取適量樣品，用一定比例的甲醇/水提取其中的ZEN，經(jīng)過(guò)過(guò)濾步驟并進(jìn)行適當(dāng)稀釋之后，將液體樣品流經(jīng)親和柱達(dá)到凈化的目的，再用甲醇將親和柱上的ZEN洗脫下來(lái)，在洗脫液中加入氯化鋁溶液衍生，提高檢測(cè)靈敏度，然后用熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣液中玉米赤霉烯酮的含量。
全文摘要
發(fā)明涉及一種玉米赤霉烯酮的檢測(cè)方法，它是利用玉米赤霉烯酮單克隆抗體制備的免疫親和柱及熒光光度計(jì)來(lái)檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法，屬生物細(xì)胞學(xué)及微生物菌類(lèi)毒性代謝產(chǎn)物檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法的具有以下檢測(cè)過(guò)程和步驟一.免疫親和柱的準(zhǔn)備和制備1.制備單克隆抗體單克隆抗體的制備要通過(guò)抗原合成、小鼠免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤篩選及獲取雜交瘤細(xì)胞株、采集單克隆抗體等步驟來(lái)獲得，2.利用上述的單克隆抗體來(lái)制備免疫親和柱；二.樣品中玉米赤霉烯酮的分離與檢測(cè)方法將玉米試樣用甲醇/水溶液提取其中的ZEN，經(jīng)過(guò)過(guò)濾步驟并進(jìn)行適當(dāng)稀釋之后，將液體樣品流經(jīng)親和柱，再用甲醇洗脫下來(lái)后，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣液中玉米赤霉烯酮的含量。
文檔編號(hào)G01N30/88GK1645134SQ200510023579
公開(kāi)日2005年7月27日 申請(qǐng)日期2005年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月26日
發(fā)明者陳宇光, 黎雙華, 顧鳴 申請(qǐng)人:上海大學(xué)