專利名稱：：用于篩選蛋白活性的高密度蛋白陣列的制作方法本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2001年5月4日，申請(qǐng)?zhí)枮?1812230.2，發(fā)明名稱為“用于篩選蛋白活性的高密度蛋白陣列”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。根據(jù)美國(guó)法典第35章第119條e款(35U.S.C.§119(e))，本申請(qǐng)要求2000年5月4日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序號(hào)60/201,921以及2000年7月27日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序號(hào)60/221,034的權(quán)益，這兩個(gè)臨時(shí)專利申請(qǐng)都通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中。本發(fā)明受到政府資助，資助號(hào)為DARPA/ONRR13164-41600099和NIH(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)RO1CA77808。政府對(duì)本發(fā)明擁有一定權(quán)益。I.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于大規(guī)模研究蛋白功能的蛋白芯片，其中所述芯片包含密集反應(yīng)孔。本發(fā)明涉及蛋白芯片的使用方法，這些方法用于同時(shí)測(cè)定存在于蛋白樣品中或一塊蛋白芯片上的蛋白的有無(wú)、多少和/或功能，或者用于測(cè)定該芯片上每種蛋白的探針混合物中每種探針的有無(wú)、相對(duì)特異性和結(jié)合親和性。本發(fā)明還涉及使用蛋白芯片進(jìn)行高密度微量化學(xué)反應(yīng)的方法。此外，本發(fā)明還涉及用作蛋白芯片支持物的聚合物和蛋白芯片的制備方法。本發(fā)明還涉及用于衍化蛋白芯片支持物的化合物。II.發(fā)明背景全基因組測(cè)序已鑒定出大量的可讀框(ORF)。目前，人們?cè)诶胢RNA表達(dá)譜和基因破壞的表型認(rèn)識(shí)基因功能方面作出了巨大努力。這種努力之所以有可能獲得重大進(jìn)步，部分是緣于使用基因芯片技術(shù)以單個(gè)實(shí)驗(yàn)分析成千上萬(wàn)種基因序列。然而，有關(guān)基因功能的更多信息還是來(lái)自對(duì)編碼蛋白生化活性的分析。目前，這些類型的分析是一個(gè)研究者每次研究一種蛋白。這是一個(gè)非常耗時(shí)的過(guò)程，因?yàn)榛诘鞍椎纳钚约兓丸b定一種蛋白可能要耗時(shí)若干年。利用全基因組序列使得可對(duì)所述基因組編碼的每種蛋白進(jìn)行生化測(cè)定。迄今為止，使用一個(gè)蛋白芯片能有效分析數(shù)百或數(shù)千種蛋白樣品。這些方法非常適合于可產(chǎn)生和分析大量數(shù)據(jù)的高通量實(shí)驗(yàn)。多年前本領(lǐng)域就知道含96孔或384孔的微量滴定板。但是，這些板的尺寸(至少12.8×8.6cm)使其不適于進(jìn)行大規(guī)模的蛋白質(zhì)分析，因?yàn)榭酌芏炔粔蚋?。如上所述，已?jīng)設(shè)計(jì)出其它類型的用于DNA合成和雜交反應(yīng)的陣列，例如WO89/10977描述的陣列。然而，這些陣列不適于獨(dú)立體積的蛋白分析，因?yàn)檫@些陣列構(gòu)建在平面上，而這往往導(dǎo)致特性之間交叉影響。已應(yīng)用光刻法制備各種陣列，涵蓋平面寡核苷酸陣列(Pease等，1994，“快速分析DNA序列的光性寡核苷酸陣列”，PNAS915022-5026)、流路陣列(美國(guó)專利第5,843,767號(hào))和通過(guò)流路連接的孔陣列(Cohen等，1999，“基于微芯片的蛋白激酶A的酶測(cè)定”，AnalBiochem.27389-97)。而且，微加工和微光刻法在半導(dǎo)體加工領(lǐng)域是眾所周知的。參見例如Moreau，半導(dǎo)體光刻法原理、操作和材料，PlenumPress，1988。最近開發(fā)出設(shè)計(jì)用于在芽生釀酒酵母中表達(dá)大量具潛在生化基因組用途的蛋白的方法。已將ORF克隆入使用GAL啟動(dòng)子并將蛋白融合至多聚組氨酸(例如HISX6)標(biāo)記的表達(dá)載體。因此，該方法還用于制備和證實(shí)了約2000種酵母蛋白融合體的表達(dá)(Heyman等，1999，“使用拓?fù)洚悩?gòu)酶I介導(dǎo)的連接以基因組規(guī)?？寺『捅磉_(dá)單個(gè)可讀框”，GenomeRes.9383-392)。使用重組策略將約85％的酵母ORF和GST編碼區(qū)按照閱讀框架克隆入含CUP1(銅誘導(dǎo)型)啟動(dòng)子的載體中，由此產(chǎn)生GST融合蛋白(Martzen等，1999，“根據(jù)其產(chǎn)物活性鑒定基因的生化基因組學(xué)方法”，Science2861153-1155)。Martzen等人使用組合策略篩選具有幾種生化活性(例如磷酸二酯酶活性和Appr-1-P-加工活性)的融合蛋白集合物，并鑒定編碼這些活性的相關(guān)基因。然而，還沒(méi)有描述過(guò)分析大量單個(gè)蛋白樣品的策略。因此，需要一種蛋白芯片，該芯片上的孔高度密集，以獲得超越先有技術(shù)芯片和方法的成本和時(shí)間優(yōu)勢(shì)。不能將本申請(qǐng)第II章或其它任何章節(jié)對(duì)任一參考文獻(xiàn)的援引或認(rèn)同理解為允許將所述參考文獻(xiàn)作為本發(fā)明的先有技術(shù)。III.發(fā)明概述本發(fā)明涉及蛋白芯片，即用于大規(guī)模研究蛋白功能的位于固體支持體上的定位尋址蛋白陣列，其中所述蛋白芯片包含密集反應(yīng)孔。本發(fā)明還涉及使用蛋白芯片測(cè)定至少一個(gè)樣品中存在蛋白的有無(wú)、多少和/或功能的方法。本發(fā)明還涉及使用蛋白芯片進(jìn)行高密度微量化學(xué)反應(yīng)的方法。此外，本發(fā)明還涉及用作蛋白芯片支持物的聚合物和蛋白芯片的制備方法。本發(fā)明還涉及用于衍化蛋白芯片的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含平面(例如但不限于載玻片)的蛋白芯片?？稍诶巛d玻片上生產(chǎn)密集蛋白陣列，使得可進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)和測(cè)定，由此可以大規(guī)模平行分析蛋白的存在與否、存在多少和/或功能性。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述平面陣列上的蛋白通過(guò)3-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTS)連接體與陣列表面結(jié)合。此外，在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明通過(guò)提供含密集孔的蛋白芯片克服了本領(lǐng)域已知方法和裝置的缺點(diǎn)和局限，在所述芯片中可進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)和測(cè)定，由此可以大規(guī)模平行分析蛋白的存在與否、存在多少和/或功能性。測(cè)定陣列相比于一個(gè)接一個(gè)的測(cè)定的整體優(yōu)勢(shì)包括能夠同時(shí)鑒定許多蛋白-探針的相互作用以及能夠測(cè)定這些相互作用的相對(duì)親合性。將探針的復(fù)合混合物應(yīng)用于芯片的優(yōu)勢(shì)包括能夠在更能代表細(xì)胞的環(huán)境中測(cè)定相互作用以及能夠同時(shí)評(píng)價(jià)許多潛在配體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列，包含位于固體支持體上的多種不同物質(zhì)，所述多種不同物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種物質(zhì)由至少100種不同物質(zhì)/cm2組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列，包含位于固體支持體上的多種不同蛋白或含所述蛋白功能域的分子，每種不同的蛋白或分子都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同蛋白或分子包括在生物體基因組中具有相同類型生物活性的全部表達(dá)蛋白的至少50％。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列，包含位于固體支持體上的多種不同物質(zhì)，所述多種不同物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同位置，其中所述固體支持體選自陶瓷制品、無(wú)定形碳化硅、可鑄氧化物(castableoxide)、聚酰亞胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯和硅氧烷彈性體。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列，包含位于固體支持體上的多種不同物質(zhì)，所述多種不同物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同物質(zhì)通過(guò)3-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷連接體與固體支持體連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種在固體支持體表面含多個(gè)孔的陣列，其中所述孔的密度為至少100孔/cm2。本發(fā)明還涉及一種在固體支持體表面制備含多個(gè)孔的定位尋址陣列的方法，該方法包括以下步驟由設(shè)計(jì)用于在固體表面生產(chǎn)100孔/cm2以上密度孔的微加工模鑄造陣列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明為一種在固體支持體表面制備含多個(gè)孔的定位尋址陣列的方法，該方法包括以下步驟由設(shè)計(jì)用于在固體表面生產(chǎn)100孔/cm2以上密度孔的微加工模鑄造副模(secondarymold)，并由副模鑄造至少一種陣列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列使用方法，該方法包括以下步驟使探針與所述陣列接觸，并檢測(cè)蛋白/探針相互作用，所述陣列在固體支持體上包含多種不同物質(zhì)，這些物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同物質(zhì)由至少100種不同物質(zhì)/cm2組成。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列使用方法，該方法包括以下步驟使探針與所述陣列接觸，并檢測(cè)蛋白/探針相互作用，所述陣列在固體支持體上包含多種不同蛋白或含所述蛋白功能域的分子，每種不同蛋白或分子都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種蛋白或分子包括在生物體基因組中具有相同類型生物活性的全部表達(dá)蛋白的至少50％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列使用方法，該方法包括以下步驟使探針與所述陣列接觸，并檢測(cè)蛋白/探針相互作用，所述陣列在固體支持體上包含多種不同物質(zhì)，這些物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同位置，其中所述固體支持體選自陶瓷制品、無(wú)定形碳化硅、可鑄氧化物、聚酰亞胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯和硅氧烷彈性體。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列使用方法，該方法包括以下步驟使探針與所述陣列接觸，并檢測(cè)蛋白/探針相互作用，所述陣列在固體支持體上包含多種不同物質(zhì)，這些物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同物質(zhì)通過(guò)3-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷連接體與固體支持體連接。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列使用方法，該方法包括以下步驟在固體支持體上沉積多種不同物質(zhì)，使探針與所述陣列接觸，并檢測(cè)蛋白/探針相互作用，所述多種不同物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同物質(zhì)由至少100種不同物質(zhì)/cm2組成。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列使用方法，該方法包括以下步驟在固體支持體上沉積多種不同物質(zhì)，使探針與所述陣列接觸，并檢測(cè)蛋白/探針相互作用，所述多種不同物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同物質(zhì)由至少100種不同物質(zhì)/cm2組成，并且其中所述固體支持體為載玻片。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列使用方法，該方法包括以下步驟在固體支持體上沉積多種不同蛋白或含所述蛋白功能域的分子，使探針與所述陣列接觸，并檢測(cè)蛋白/探針相互作用，每種不同的蛋白或分子都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同蛋白或分子包括在生物體基因組中具有相同類型生物活性的全部表達(dá)蛋白的至少50％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列使用方法，該方法包括以下步驟在固體支持體上沉積多種不同蛋白或含所述蛋白功能域的分子，使探針與所述陣列接觸，并檢測(cè)蛋白/探針相互作用，每種不同的蛋白或分子都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同蛋白或分子包括在生物體基因組中具有相同類型生物活性的全部表達(dá)蛋白的至少50％，并且其中所述固體支持體為載玻片。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列制備方法，該方法包括以下步驟由設(shè)計(jì)用于在固體表面生產(chǎn)100孔/cm2以上密度孔的微加工模鑄造陣列，并在固體支持體上的所述孔中沉積多種不同物質(zhì)，這些物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同孔中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列制備方法，該方法包括以下步驟由設(shè)計(jì)用于在固體表面產(chǎn)生100孔/cm2以上密度孔的微加工模鑄造副模，由副模鑄造至少一種陣列，并在所述孔中沉積多種不同物質(zhì)，這些物質(zhì)未與固體支持體連接，它們選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在不同孔中。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列制備方法，該方法包括以下步驟由設(shè)計(jì)用于在固體表面生產(chǎn)100孔/cm2以上密度孔的微加工模鑄造副模，由副鑄模鑄造至少一種陣列，并在所述孔中沉積多種不同物質(zhì)，這些物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在不同孔中。A.定義本申請(qǐng)使用的“蛋白”是指全長(zhǎng)蛋白、蛋白部分或肽。蛋白可在生物體(優(yōu)選細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中重組過(guò)量表達(dá)制備，或經(jīng)過(guò)較大蛋白片段化產(chǎn)生，或者化學(xué)合成。本申請(qǐng)使用的“功能域”是適合獲得目的功能活性的必需蛋白結(jié)構(gòu)域。功能域的實(shí)例特別包括具有激酶、蛋白酶、磷酸酶、糖苷酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)移酶或其它酶活性的結(jié)構(gòu)域。功能域的其它實(shí)例包括那些對(duì)DNA、RNA、蛋白、激素、配體或抗原具有結(jié)合活性的結(jié)構(gòu)域。本申請(qǐng)使用的“探針”是指任何結(jié)合核酸(例如DNA或RNA)或蛋白的化學(xué)試劑。探針的實(shí)例特別包括其它蛋白、肽、寡核苷酸、多核苷酸、DNA、RNA、小分子底物和抑制劑、藥物侯選物、受體、抗原、激素、類固醇類、磷脂、抗體、輔因子、細(xì)胞因子、谷胱甘肽、免疫球蛋白區(qū)、碳水化合物、麥芽糖、鎳、二氫胰蛋白酶(dihydrotrypsin)和生物素。芯片上的每種蛋白或探針最好都位于固體支持體上的已知預(yù)定位置，使得可根據(jù)其在固體支持體上的位置確定每種蛋白或探針。而且，蛋白和探針在固體支持體上形成定位尋址陣列。IV.附圖簡(jiǎn)述圖1a.使用圖示重組策略將119種酵母蛋白激酶克隆在高拷貝URA3表達(dá)載體(pEGKG)中，URA3表達(dá)載體在半乳糖誘導(dǎo)型GAL10啟動(dòng)子控制下生產(chǎn)GST融合蛋白。GST∷激酶構(gòu)建物導(dǎo)入大腸桿菌中，并測(cè)定每種構(gòu)建物的5′末端序列。在觀察到突變時(shí)再將整個(gè)步驟重復(fù)一遍。圖1b.如所述純化的GST∷激酶融合蛋白的免疫印跡。由3次實(shí)驗(yàn)純化出106種激酶蛋白。盡管進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，但在119種GST中仍有14種未能通過(guò)免疫印跡分析檢測(cè)出來(lái)(例如星號(hào)標(biāo)記泳道中的Mps1)。圖2a.按照以下圖示方法生產(chǎn)用于激酶研究的蛋白芯片。將聚二甲基硅氧烷(PDMS)傾注在丙烯酸主模之上。固化后剝離含孔的芯片，并安放在載玻片上。接著衍化芯片表面，然后將蛋白附著至所述孔。先用1％BSA封閉孔，此后加入激酶、33P-γ-ATP和緩沖液。于30℃溫育30分鐘后徹底清洗蛋白芯片，并將蛋白芯片對(duì)分辨率50μm的定量性X光片和MolecularDynamicsPhosphorImager曝光。對(duì)于12種底物來(lái)說(shuō)，每種激酶測(cè)定都重復(fù)進(jìn)行至少2次；對(duì)于其余的5種底物，所述測(cè)定進(jìn)行1次。圖2b.蛋白芯片放大圖。圖3.蛋白芯片和激酶測(cè)定結(jié)果。每個(gè)芯片上的位置I9表示陰性對(duì)照信號(hào)。盡管蛋白質(zhì)印跡未能檢測(cè)到可見信號(hào)(圖1b)，但在全部12個(gè)激酶反應(yīng)中位置B4的Mps1都顯示強(qiáng)激酶活性。圖4a.蛋白激酶反應(yīng)的定量分析。使用MolecularDynamicsPhosphorImager測(cè)定激酶活性，并將數(shù)據(jù)以Excel電子表格輸出。然后通過(guò)使數(shù)據(jù)對(duì)陰性對(duì)照歸一化將激酶信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)樵黾颖稊?shù)。119種激酶在4個(gè)反應(yīng)中的信號(hào)以對(duì)數(shù)顯示。倍數(shù)增加范圍為1-1000倍。圖4b.為測(cè)定底物特異性，使用下式計(jì)算特異性指數(shù)(SI)SIir＝Ftr/[(Fi1+Fi2+......+Fir)/r]，其中i表示所使用激酶的標(biāo)識(shí)，r代表底物標(biāo)識(shí)，而Fir代表與單獨(dú)的GST相比激酶i對(duì)底物r作用的增加倍數(shù)。列出了幾個(gè)SI大于3的激酶特異性實(shí)例。圖5a.激酶核心結(jié)構(gòu)域多序列比對(duì)產(chǎn)生的系統(tǒng)樹，表明了功能特異性和多聚(Tyr-Glu)激酶氨基酸序列之間的相關(guān)性?？墒褂枚嗑?Tyr-Glu)作為底物的激酶經(jīng)常在序列比較樹形圖上作圖到特異性區(qū)。有效磷酸化多聚(Tyr-Glu)的激酶用陰影表示；用方框表示微弱利用該底物的兩種激酶。用星號(hào)表示不能磷酸化多聚(Tyr-Glu)的Rad53和Ste7。如圖所示，這些激酶中有70％屬于4個(gè)序列組(圓圈內(nèi))。圖5b.兔肌肉磷酸化酶激酶(PHK)28的結(jié)構(gòu)。標(biāo)明了優(yōu)選存在于可利用多聚(Tyr-Glu)作為底物的激酶中的三種堿性殘基和甲硫氨酸(Met)殘基的位置。天冬酰胺(Asp)殘基通常在不使用多聚(Tyr-Glu)的激酶中。圖6.在蛋白芯片制備工藝中光刻步驟的截面圖。a.在氧化層兩側(cè)具有兩層硅的硅片。b.在頂部具有防護(hù)掩蔽層的硅片。c.蝕刻工藝去除表面未受防護(hù)掩蔽層保護(hù)的位置的硅。蝕刻深度受控于氧化層的位置，即蝕刻工藝不去除氧化層。d.去除掩蔽層，留下蝕刻硅片。e.將蛋白芯片材料施加于模板上。f.固化后，將蛋白芯片從模板上取下。蛋白芯片的影象為模板的對(duì)應(yīng)蝕刻物。圖7.蛋白芯片上的激酶/抑制劑測(cè)定。使用不同濃度的特異性人體PKA抑制劑PKIα或MAPK抑制劑SB202190測(cè)定針對(duì)兩種底物(即PKA蛋白底物和通常使用的激酶底物MBP)的人體蛋白激酶A(PKA)、人體促細(xì)胞分裂劑激活性蛋白激酶(MAPK)、三種酵母PKA同系物(TPK1、TPK2和TPK3)和兩種其它酵母蛋白激酶(HSL1和RCK1)。如圖所示，PKIα可特異性抑制使用肽和MBP二者作為底物的PKA活性。但是，SB202190對(duì)PKA活性未顯示出任何抑制作用。另外饒有興趣的是，PKIα不抑制所測(cè)試的三種酵母PKA同系物(TPK1、TPK2和TPK3)和所測(cè)試的其它兩種酵母蛋白激酶HSL1和RCK1。V.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于大規(guī)模研究蛋白功能的蛋白芯片，即在固體支持體上的定位尋址蛋白陣列，其中所述蛋白芯片包含密集反應(yīng)孔。定位尋址陣列提供一種使每種目的探針或蛋白都位于固體支持體上的已知預(yù)定位置的構(gòu)型，使得可根據(jù)其在陣列上的位置確定每種探針或蛋白。本發(fā)明還涉及使用蛋白芯片測(cè)定至少一種樣品中存在蛋白的有無(wú)、多少和/或功能性的方法。本發(fā)明還涉及使用蛋白芯片進(jìn)行高密度微量化學(xué)反應(yīng)的方法。此外，本發(fā)明還涉及用作蛋白芯片支持物的聚合物和蛋白芯片的制備方法。本發(fā)明還涉及用于衍化蛋白芯片支持物的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列，其在固體支持體上包含多種不同物質(zhì)，這些物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同物質(zhì)由至少100種不同物質(zhì)/cm2組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多種不同物質(zhì)由100-1000種不同物質(zhì)/cm2組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多種不同物質(zhì)由1000-10,000種不同物質(zhì)/cm2組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多種不同物質(zhì)由10,000-100,000種不同物質(zhì)/cm2組成。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述多種不同物質(zhì)由100,000-1,000,000種不同物質(zhì)/cm2組成。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述多種不同物質(zhì)由1,000,000-10,000,000種不同物質(zhì)/cm2組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多種不同物質(zhì)由10,000,000-25,000,000種不同物質(zhì)/cm2組成。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述多種不同物質(zhì)由至少25,000,000種不同物質(zhì)/cm2組成。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述多種不同物質(zhì)由至少10,000,000,000種不同物質(zhì)/cm2組成。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述多種不同物質(zhì)由至少10,000,000,000,000種不同物質(zhì)/cm2組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列，其在固體支持體上包含多種不同物質(zhì)，這些物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同物質(zhì)由至少100種不同物質(zhì)/cm2組成，并且其中所述固體支持體為載玻片。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列，其在固體支持體上包含多種不同物質(zhì)，這些物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同物質(zhì)由約30-100種不同物質(zhì)/cm2組成。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述多種不同物質(zhì)由約30種不同物質(zhì)/cm2組成。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述多種不同物質(zhì)由30-50種不同物質(zhì)/cm2組成。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述多種不同物質(zhì)由50-100種不同物質(zhì)/cm2組成。在各種具體實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種定位尋址陣列，其在固體支持體上包含多種不同蛋白或含所述蛋白功能域的分子，每種不同的蛋白或分子都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同蛋白或分子包括在生物體基因組中具有相同類型生物活性的全部表達(dá)蛋白的至少50％、75％、90％或95％。例如，所述生物體可以為真核生物或原核生物，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物、人或非人動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠、大鼠、貓、犬、馬、母牛、小雞、酵母之類的真菌、果蠅、C.elegans等。所述類型的目的生物活性可以是但不限于酶活性(例如激酶活性、蛋白酶活性、磷酸酶活性、糖苷酶活性、乙?；D(zhuǎn)移酶活性以及其它化學(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶活性)、核酸結(jié)合、激素結(jié)合等。A.生產(chǎn)蛋白芯片最好用已使用常規(guī)微加工或微光刻法模壓(stamped)、切削(milled)或蝕刻的主模鑄造本發(fā)明的具有高密度陣列孔的蛋白芯片。優(yōu)選將常規(guī)微光刻法和材料用于生產(chǎn)主模。一旦生產(chǎn)出主模，就可將主模直接用于澆鑄蛋白芯片本身?；蛘撸捎弥髂ｈT造副?；蛉?，并由這些副?；蛉ｈT造蛋白芯片。主?？捎萌魏芜m于微加工或微光刻法的材料制備，優(yōu)選硅、玻璃、石英、聚酰亞胺和聚甲基丙烯酸甲酯(有機(jī)玻璃)。對(duì)于微光刻法來(lái)說(shuō)，優(yōu)選材料為硅片。一旦生產(chǎn)出合適的主模、副模或三模，就可鑄造蛋白芯片。蛋白芯片可鑄造在任何適于鑄造的固體支持體上，包括多孔或無(wú)孔固體支持體。固體支持體優(yōu)選陶瓷制品、無(wú)定形碳化硅、固化時(shí)形成SiO2鑄件的可鑄氧化物、聚酰亞胺、聚甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯，最優(yōu)選硅氧烷彈性體材料。在硅氧烷彈性體材料中，聚二甲基硅氧烷(PDMS)是最優(yōu)選的固體支持體。硅氧烷彈性體材料的優(yōu)勢(shì)在于由于其柔韌的特性而易于由模板上取下。圖6顯示了一個(gè)用于在本發(fā)明蛋白芯片上實(shí)現(xiàn)高密度陣列孔的方法實(shí)例。提供一種在硅層之間夾有氧化層的硅片(圖6a)。這些硅片通常稱作硅絕緣體或SOI片，通?？傻米怨杵?yīng)公司(例如BelleMeadResearch，BelleMead，NJ和VirginiaSemiconductor，F(xiàn)redericksburg，VA)。然后定型硅片并通過(guò)蝕刻方法蝕刻(圖6b-d)。掩埋的氧化層起非常有效的蝕刻終止作用，使穿過(guò)硅片的蝕刻深度高度均一。蝕刻深度與蝕刻方法無(wú)關(guān)，僅取決于頂部硅層的厚度?？墒褂脻裥曰瘜W(xué)蝕刻方法(例如使用KOH或四甲基肼(TMAH))。但是，該技術(shù)對(duì)硅片的晶體方向依賴性稍強(qiáng)。因此，優(yōu)選在活性離子蝕刻(RIE)中使用稀薄氣體(一般為SF6)的技術(shù)。RIE蝕刻技術(shù)能夠在硅上刻出與硅片晶體方向無(wú)關(guān)的高度各向異性孔。參考文獻(xiàn)G.Kovacs，MicromachinedTransducersSourcebook，AcademicPress(1998)和M.Madou，F(xiàn)undamentalsofMicrofabrication，CRCPress(1997)提供了蝕刻技術(shù)的背景材料?？稍趩蝹€(gè)芯片上使用兩種形式的微光刻，以獲得需要組合的孔形狀。濕性化學(xué)蝕刻是獲得U型孔的各向同性方法，而RIE是獲得方底孔的各向異性方法。蝕刻硅片獲得主模后，主模就可用于鑄造蛋白芯片(圖6e-f)。這些構(gòu)建物可以為蛋白芯片，或者自身為副?；蛉＃儆筛蹦；蛉ｈT造蛋白芯片。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，一種制備定位尋址陣列(在固體支持體表面含多個(gè)孔)的方法包括用設(shè)計(jì)用于在固體表面生產(chǎn)100孔/cm2以上密度孔的微加工模鑄造陣列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種制備定位尋址陣列(在固體支持體表面含多個(gè)孔)的方法包括用設(shè)計(jì)用于在固體表面生產(chǎn)100孔/cm2以上密度孔的所述微加工模鑄造副模，并由副模鑄造至少一種陣列。在再一個(gè)實(shí)施方案中，一種制備定位尋址陣列的方法包括用液體鑄件材料覆蓋模板，并固化鑄件材料直至鑄件成為固體。所述液體鑄件材料優(yōu)選為硅氧烷彈性體，最優(yōu)選為聚二甲基硅氧烷?？蓪⒍喾N不同物質(zhì)沉積在任何這些定位尋址陣列中，以使每種不同物質(zhì)都位于固體支持體上的不同孔中，其中所述不同物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)。B.蛋白芯片的特征本發(fā)明的蛋白芯片不限于其外形尺寸，可擁有任何便利的尺寸。為了與當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室裝置兼容，優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載玻片或更小尺寸的蛋白芯片。最優(yōu)選其大小使兩個(gè)芯片拼裝成一個(gè)顯微鏡載玻片的蛋白芯片。還優(yōu)選其大小適合質(zhì)譜儀樣品池的蛋白芯片。本發(fā)明蛋白芯片的孔可具有任何形狀，例如矩形、正方形或橢圓形，優(yōu)選環(huán)形。蛋白芯片的孔可具有方底或圓底、V形底或U形底。方形略為優(yōu)選，因?yàn)閮?yōu)選的各向異性活性離子蝕刻(RIE)方法提供方底孔。特定芯片的孔底形狀不需要一致，但可根據(jù)芯片上要進(jìn)行的具體測(cè)定的需要有所變化。本發(fā)明蛋白芯片的孔可具有任意的徑高比，優(yōu)選的徑高比約為10∶1至約1∶10。本發(fā)明蛋白芯片的孔可具有任意體積，孔體積優(yōu)選1pl-5μl，孔體積更優(yōu)選1nl-1μl。最優(yōu)選的孔體積為100nl-300nl。對(duì)于很高密度孔的蛋白芯片，優(yōu)選的孔體積為10pl-100nl。本發(fā)明蛋白芯片的孔/cm2密度可廣泛變化。優(yōu)選的孔密度為約25孔/cm2至約10,000,000,000,000孔/cm2。激光切削有機(jī)玻璃主模鑄造的蛋白芯片孔密度一般為1-2,500孔/cm2。合適切削工具產(chǎn)生的孔直徑小至100μm，間距100μm。濕性化學(xué)微光刻法蝕刻的主模鑄造的蛋白芯片的孔密度一般為50-10,000,000,000孔/cm2。濕性化學(xué)蝕刻產(chǎn)生的孔深10μm，間距10μm，再產(chǎn)生直徑小于10μm的孔。RIE微光刻法蝕刻的主模鑄造的蛋白芯片的孔密度一般為100-25,000,000孔/cm2。RIE與光刻組合可產(chǎn)生直徑500nm、間距500nm的孔。使用電子束光刻與RIE的組合可產(chǎn)生直徑50nm、間距50nm的孔。具有這種尺寸和相等間距的孔產(chǎn)生孔密度為10,000,000,000,000孔/cm2的蛋白芯片。RIE優(yōu)選用于產(chǎn)生直徑20μm、間距20μm的孔。等間距的該尺寸孔的密度為25,000,000孔/cm2。上述微加工和微光刻法已成功用于560μm或280μm孔徑、間隔約1mm的濕性化學(xué)蝕刻硅片。這種孔和間距的組合分別產(chǎn)生約410,000孔/cm2和約610,000孔/cm2的陣列。當(dāng)孔徑和間距相等時(shí)，產(chǎn)生約3.19×106孔/cm2和12.75×106孔/cm2的蛋白芯片。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述陣列在固體支持體表面含多個(gè)孔，其中孔密度為至少100孔/cm2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述孔密度為100-1000孔/cm2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述孔密度為1000-10,000孔/cm2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述孔密度為10,000-100,000孔/cm2。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述孔密度為100,000-1,000,000孔/cm2。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述孔密度為1,000,000-10,000,000孔/cm2。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述孔密度為10,000,000-25,000,000孔/cm2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述孔密度為至少25,000,000孔/cm2。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述孔密度為至少10,000,000,000孔/cm2。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述孔密度為至少10,000,000,000,000孔/cm2。C.蛋白芯片的應(yīng)用在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種含平整表面(例如但不限于載玻片)的蛋白芯片。可在例如載玻片上生產(chǎn)密集蛋白陣列，使得可以進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)和測(cè)定，由此允許大規(guī)模平行分析蛋白(例如蛋白激酶)的有無(wú)、多少和/或功能性。蛋白或探針共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合至固體支持體的平整表面。蛋白或探針可直接結(jié)合至固體支持體的平整表面，或者可以通過(guò)連接分子或連接化合物附著于固體支持體。連接體可以為任何衍化固體支持體表面從而使蛋白或探針易于連接至固體支持體表面的分子或化合物。所述連接體可以共價(jià)或非共價(jià)地將蛋白或探針結(jié)合至固體支持體表面。另外，連接體可以為無(wú)機(jī)或有機(jī)分子。優(yōu)選的連接體為具有游離胺的化合物。最優(yōu)選的連接體為3-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTS)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白芯片具有幾個(gè)超越平面陣列的優(yōu)勢(shì)。即使用孔消除或降低了孔內(nèi)容物交叉污染的可能性。另一個(gè)超越平面陣列的優(yōu)勢(shì)是增加了信噪比。孔允許在較密集的構(gòu)型中使用較大體積的反應(yīng)溶液，并因此有可能獲得較強(qiáng)信號(hào)。而且，與平面陣列相比孔降低了芯片反應(yīng)溶液的蒸發(fā)率，因此允許更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間?？壮狡秸砻娴牧硪粋€(gè)優(yōu)勢(shì)在于應(yīng)用孔可以用固定有限量探針對(duì)芯片上的每個(gè)孔進(jìn)行結(jié)合研究，而使用平整表面通常是將探針不加選擇地應(yīng)用于整個(gè)底物。當(dāng)探針混合物中的探針具有高親和性但低特異性時(shí)，對(duì)底物不加選擇地應(yīng)用探針混合物將飽和許多與探針具有高親和性的蛋白。這種飽和有效限制了混合物中其它探針的檢測(cè)。通過(guò)使用孔，可將有限量的探針應(yīng)用于芯片上的各個(gè)孔。因此，應(yīng)用于每種蛋白的探針量可受到控制，不同蛋白的探針可各不相同(位于不同孔中)。一旦如上所述生產(chǎn)出蛋白芯片，則可用其進(jìn)行測(cè)定和其它化學(xué)反應(yīng)。對(duì)于測(cè)定來(lái)說(shuō)，蛋白或探針通常位于孔中。蛋白或探針的存在與否將通過(guò)分別將探針或蛋白施用于蛋白芯片測(cè)定。可以使用各種本領(lǐng)域已知的技術(shù)(其中一些在下文論述)觀測(cè)蛋白-探針相互作用。用于本發(fā)明的蛋白可以為融合蛋白(其中限定結(jié)構(gòu)域連接至各種天然蛋白中的一種)，或者可以為完整的非融合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)(例如但不限于囊泡、核內(nèi)體、亞細(xì)胞器和膜碎片)可置于蛋白芯片上(例如孔中)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將完整細(xì)胞置于蛋白芯片上(例如孔中)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，可將蛋白、含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)或完整細(xì)胞連接至蛋白芯片的固體支持體。在放置于蛋白芯片上之前或過(guò)程中可通過(guò)使用結(jié)合特定蛋白的試劑純化蛋白，其中所述試劑先前已經(jīng)放置在蛋白芯片上。可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如親和層析或柱層析)或通過(guò)分離離心樣品(例如P1或P2組分)獲得部分純化的含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)或細(xì)胞。此外，蛋白、含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)或細(xì)胞可在放置于蛋白芯片上之前或同時(shí)嵌入人工或天然膜中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白、含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)或細(xì)胞可在放置于蛋白芯片上之前或同時(shí)嵌入胞外基質(zhì)組分(例如膠原蛋白或基底層)中。本發(fā)明的蛋白可以為溶液，或者結(jié)合至固體支持體表面(例如孔中或在平整表面上)，或者結(jié)合至放置于固體支持體孔中的支持物(例如珠)?？墒褂萌魏畏峙涔ぞ?例如氣泡噴點(diǎn)或噴墨打印頭)將蛋白或探針?lè)胖糜诳字小?yōu)選微量移液分配器。蛋白或探針的放置可手動(dòng)進(jìn)行，或者可通過(guò)使用連接機(jī)器的計(jì)算機(jī)將該過(guò)程自動(dòng)進(jìn)行。因?yàn)樗隹资亲院降?，所以蛋白或探針不需要連接或結(jié)合至固體支持體表面，而是可以簡(jiǎn)單地將蛋白或探針?lè)胖糜诳字谢蚪Y(jié)合至放置于孔中的支持物(例如珠)。其它的支持物包括但不限于硝基纖維素顆粒、玻璃珠、塑料珠、磁性粒子和乳狀粒子。另一方面，蛋白或探針共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合至孔中的固體支持體表面。蛋白或探針可直接結(jié)合至固體支持體表面(在孔中)，或者可以通過(guò)連接分子或連接化合物附著于固體支持體。連接體可以為任何衍化固體支持體表面從而使蛋白或探針易于連接至固體支持體表面的分子或化合物。所述連接體可以將蛋白或探針共價(jià)結(jié)合至固體支持體表面，或者可通過(guò)非共價(jià)作用結(jié)合。另外，連接體可以為無(wú)機(jī)或有機(jī)分子。優(yōu)選的連接體為具有游離胺的化合物。最優(yōu)選的連接體為3-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTS)。非共價(jià)結(jié)合至孔表面的蛋白或探針可利用各種分子作用實(shí)現(xiàn)與孔表面的連接，例如氫鍵結(jié)合、范德華力結(jié)合、靜電結(jié)合或金屬螯合配位結(jié)合。此外，DNA-DNA、DNA-RNA和受體-配體相互作用也是用于非共價(jià)結(jié)合的作用類型。受體-配體相互作用的實(shí)例包括抗體和抗原、DNA結(jié)合蛋白和DNA、酶和底物、抗生物素蛋白(或鏈霉抗生物素蛋白)和生物素(或生物素化分子)之間的相互作用，以及脂質(zhì)結(jié)合蛋白和磷脂膜或囊泡之間的相互作用。例如，可表達(dá)具有融合蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白，所述融合蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)B接至孔表面的底物具有親和性。適于融合蛋白結(jié)合的底物包括胰蛋白酶/脫水胰蛋白酶、谷胱甘肽、免疫球蛋白區(qū)、麥芽糖、鎳或生物素及其衍生物，它們分別結(jié)合牛胰腺蛋白酶抑制劑、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、抗原、麥芽糖結(jié)合蛋白、多聚組氨酸(例如HisX6標(biāo)記)和抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白。D.蛋白芯片測(cè)定在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光或熒光的標(biāo)準(zhǔn)酶測(cè)定將蛋白芯片用于測(cè)定?？墒褂美绻庵掳l(fā)光、使用非蛋白底物的熒光、酶顯色、質(zhì)譜特征標(biāo)記和寡核苷酸標(biāo)記擴(kuò)增(例如通過(guò)PCR)檢測(cè)各種蛋白或分子修飾。因此，特別可通過(guò)化學(xué)發(fā)光、熒光、放射標(biāo)記或原子力顯微鏡檢測(cè)蛋白/探針相互作用。還可以通過(guò)直接質(zhì)譜鑒定在陣列中結(jié)合特定組分的探針。例如，可通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定通過(guò)解離探針與陣列組分的非降解方法釋放到溶液中的探針(參見例如WO98/59361)。在另一個(gè)實(shí)施例中，可通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定通過(guò)酶消化陣列組分釋放到溶液中的肽或其它化合物。陣列類型可分成幾個(gè)大類。作為第一個(gè)實(shí)例，陣列上的每個(gè)孔都接觸單一探針，檢測(cè)并定量它們的結(jié)合。這些測(cè)定結(jié)果的觀測(cè)方法包括但不限于1)使用放射標(biāo)記配體，接著放射自顯影和/或磷成象分析；2)結(jié)合半抗原，然后通過(guò)熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記抗體或高親和性半抗原配體如生物素或鏈霉抗生物素蛋白檢測(cè)；3)質(zhì)譜分析法；4)原子力顯微鏡；5)熒光偏振法；6)滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)法(Hatch等，1999，“滾環(huán)擴(kuò)增固定在固體表面上的DNA及其在多重突變檢測(cè)中的應(yīng)用”，Genet.Anal.15(2)35-40)；7)競(jìng)爭(zhēng)性PCR(Fini等，1999，“化學(xué)發(fā)光競(jìng)爭(zhēng)PCR在使用微量板發(fā)光計(jì)檢測(cè)和定量細(xì)小病毒B19DNA方面的進(jìn)展”，Clin.Chem.45(9)1391-6；Kruse等，1999，“使用半嵌套競(jìng)爭(zhēng)PCR測(cè)定檢測(cè)和定量轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)基因表達(dá)”，Cytokine11(2)179-85；Guenthner和Hart，1998，“使用微量板型檢測(cè)系統(tǒng)定量競(jìng)爭(zhēng)性PCR測(cè)定HIV-1”，Biotechniques24(5)810-6)；8)比色法；和9)生物測(cè)定，例如測(cè)定病毒滴度。作為第二個(gè)實(shí)例，陣列上的每個(gè)孔都同時(shí)接觸多種探針，包括幾種來(lái)源探針的混合物，檢測(cè)并定量其結(jié)合。這些測(cè)定結(jié)果的觀測(cè)方法包括但不限于1)質(zhì)譜分析法；2)原子力顯微鏡；3)紅外或熒光標(biāo)記化合物或蛋白；4)擴(kuò)增寡核苷酸、肽或分子量標(biāo)記；和5)刺激或抑制蛋白的酶活性。由于本發(fā)明陣列的定位尋址特性，所以信息由探針混合物搜集，即通過(guò)放置在蛋白芯片上已知位置的限定蛋白，了解有關(guān)結(jié)合探針結(jié)合物的信息。假如理想的話，那么可以用單個(gè)探針探測(cè)陣列上顯示結(jié)合的位置，以鑒定感興趣的的特異性相互作用。還可以通過(guò)例如將蛋白芯片和細(xì)胞提取物溫育，獲得有用的信息，其中芯片上的每個(gè)孔都含有測(cè)定目的酶活性的反應(yīng)混合物，并且測(cè)定其中多種不同酶和/或底物活性，由此鑒定和檢測(cè)細(xì)胞所有組成成分的具體酶活性。同樣，蛋白芯片可與完整細(xì)胞或漿膜制備物溫育，以測(cè)定例如膜結(jié)合蛋白或分子的表達(dá)，或者測(cè)定細(xì)胞表面蛋白或分子的結(jié)合特性。可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)檢測(cè)結(jié)合至蛋白芯片上特定位置的細(xì)胞、細(xì)胞標(biāo)記或細(xì)胞分泌物。例如，可用B細(xì)胞或T細(xì)胞篩選含抗原陣列的蛋白芯片，其中所述抗原選自合成抗原、組織特異性抗原、疾病特異性抗原、病原體抗原和自身組織抗原。可通過(guò)確定陣列上抗原活化細(xì)胞的位置測(cè)定淋巴細(xì)胞識(shí)別的抗原或抗原決定簇?？赏ㄟ^(guò)各種方法測(cè)定淋巴細(xì)胞活化，包括但不限于檢測(cè)抗體合成、檢測(cè)摻入的3H-胸苷、用標(biāo)記抗體探測(cè)細(xì)胞表面分子來(lái)鑒定通過(guò)抗原識(shí)別或活化誘導(dǎo)或抑制的分子(例如IgD、C3b受體、IL-2受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、膜MHCII類分子、CD23、CD38、PCA-1分子、HLA-DR)以及鑒定表達(dá)和/或分泌的細(xì)胞因子。在另一個(gè)實(shí)例中，可通過(guò)使細(xì)胞與含推定有絲分裂原陣列的蛋白芯片溫育測(cè)定特定細(xì)胞類型的有絲分裂原，包括將定位尋址陣列與細(xì)胞群接觸的步驟；所述陣列包含位于固體支持體上的多種不同物質(zhì)，這些物質(zhì)選自蛋白、包含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同位置，其中不同物質(zhì)的密度至少為100種不同物質(zhì)/cm2；并檢測(cè)固體支持體上誘導(dǎo)細(xì)胞促有絲分裂活性的位置。可通過(guò)例如檢測(cè)摻入細(xì)胞的3H-胸苷測(cè)定細(xì)胞分裂。細(xì)胞可以是相同細(xì)胞類型(即同類細(xì)胞群)，或者可以是不同細(xì)胞類型。在再一個(gè)實(shí)例中，可通過(guò)例如使用放射性標(biāo)記的蛋白底物并檢測(cè)放射性底物濃度的降低或細(xì)胞吸收的放射性底物測(cè)定蛋白芯片上的細(xì)胞吸收和或蛋白加工。這些測(cè)定可用于診斷或治療目的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能知道檢測(cè)各種類型細(xì)胞相互作用的合適測(cè)定方法。因此，使用幾種類型的探針(例如已知的探針混合物、細(xì)胞提取物、亞細(xì)胞器、細(xì)胞膜制備物、完整細(xì)胞等)可提供對(duì)細(xì)胞活性的大規(guī)模或徹底的分析。具體來(lái)說(shuō)，一種或若干種篩選可構(gòu)成鑒定細(xì)胞類型的“足跡”或細(xì)胞、組織、器官或系統(tǒng)生理狀態(tài)的基礎(chǔ)。例如，可通過(guò)由蛋白芯片測(cè)定的細(xì)胞活性或表達(dá)譜區(qū)分不同的細(xì)胞類型(或多態(tài)性或功能性)。該方法還可用于測(cè)定例如細(xì)胞周期的不同階段、疾病狀態(tài)、改變的生理狀態(tài)(例如低氧)、治療(例如藥物治療)前后的生理狀態(tài)、代謝狀態(tài)、分化和發(fā)育階段、對(duì)環(huán)境刺激物(例如光、熱)的反應(yīng)、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、細(xì)胞特異性基因和/或蛋白表達(dá)以及疾病特異性基因和/或蛋白表達(dá)?？墒褂帽景l(fā)明的蛋白芯片進(jìn)行酶反應(yīng)和測(cè)定酶活性。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可鑒定調(diào)節(jié)芯片上一種或多種蛋白酶活性的化合物。例如，通過(guò)使一種化合物或多種化合物的混合物與蛋白芯片孔中的酶反應(yīng)混合物溫育，檢測(cè)和定量酶活性水平的變化，信號(hào)在芯片孔中產(chǎn)生(例如由有酶活性時(shí)出現(xiàn)熒光的底物產(chǎn)生)。記錄化合物有無(wú)之間的差異。而且，化合物對(duì)不同蛋白酶活性作用的差異可通過(guò)對(duì)比其對(duì)蛋白芯片中和芯片之間樣品的相對(duì)作用而容易地檢測(cè)到。以上詳述的各種使用本發(fā)明高密度蛋白芯片的策略可用于測(cè)定蛋白的各種物理和功能特征。例如，通過(guò)用抗體探測(cè)，可使用蛋白芯片評(píng)價(jià)蛋白的有無(wú)和存在量。在一個(gè)實(shí)施方案中，可探測(cè)GST融合蛋白的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片測(cè)定蛋白的存在與否和/或其活性水平?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法(如發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、熒光或化學(xué)熒光)檢測(cè)蛋白。例如，用熒光標(biāo)記的二抗識(shí)別針對(duì)目的蛋白的一抗，然后用由光源激發(fā)熒光產(chǎn)物并檢測(cè)隨后的熒光的設(shè)備(例如MolecularDynamics掃描儀)檢測(cè)二抗。為增強(qiáng)敏感性，用綴合酶(例如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶)的二抗識(shí)別目的蛋白的一抗。當(dāng)存在發(fā)光底物(化學(xué)發(fā)光)或熒光底物(化學(xué)熒光)時(shí)，酶切產(chǎn)生一種高度發(fā)光或熒光的產(chǎn)物，這種產(chǎn)物可通過(guò)使用例如MolecularDynamics掃描儀檢測(cè)并定量?；蛘?，可使用綴合堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶的三抗增強(qiáng)熒光標(biāo)記二抗的信號(hào)。還可以在本發(fā)明的蛋白芯片上鑒定蛋白激酶、磷酸酶、蛋白酶、糖苷酶、乙?；D(zhuǎn)移酶或其它基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶的底物。例如，將各種各樣的不同探針連接至蛋白芯片，測(cè)定其起特定酶底物作用的能力，例如測(cè)定其被蛋白激酶磷酸化的能力。檢測(cè)激酶活性的方法包括但不限于使用33P-ATP和35S-γ-ATP之類的放射性標(biāo)記或結(jié)合磷酸氨基酸的熒光抗體探針。例如，鑒于摻入到蛋白中的放射性標(biāo)記的磷在一個(gè)測(cè)定中代表激酶活性，另一個(gè)測(cè)定可檢測(cè)釋放到介質(zhì)中的放射性標(biāo)記磷(代表磷酸酶活性)。在另一個(gè)實(shí)例中，可通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定(例如質(zhì)譜分析、熒光標(biāo)記肽片段的抗體或熒光標(biāo)記底物熒光信號(hào)的消失)鑒定由蛋白酶活性產(chǎn)生并釋放到介質(zhì)中的肽片段，從而檢測(cè)蛋白酶活性。因此，可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解的幾種方法和許多獨(dú)立檢測(cè)工具容易地測(cè)定基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶活性。蛋白芯片可用于鑒定芯片上具有特異性活性(例如特定激酶、蛋白酶、核酸結(jié)合特性、核苷酸水解、激素結(jié)合和DNA結(jié)合)的蛋白。因此，所述芯片可用指示目標(biāo)活性存在與否的探針探測(cè)。例如，如果DNA結(jié)合是目標(biāo)活性，那么用DNA探測(cè)含侯選DNA結(jié)合蛋白的芯片。為蛋白或核酸配體的探針(天然或合成)對(duì)蛋白陣列的搜索可在蛋白芯片上平行進(jìn)行。探針可以是細(xì)胞、含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)、蛋白、寡核苷酸、多核苷酸、DNA、RNA、小分子底物、藥物侯選物、受體、抗原、類固醇、磷脂、抗體、免疫球蛋白區(qū)、谷胱甘肽、麥芽糖、鎳、二氫胰蛋白酶或生物素?；蛘咚鎏结樋梢詾槊傅孜锘蛞种苿?。例如，所述探針可以為選自以下酶的底物或抑制劑激酶、磷酸酶、蛋白酶、糖苷酶、乙?；D(zhuǎn)移酶和其它基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶。將芯片上的蛋白與核酸或蛋白探針組合物溫育后，可通過(guò)質(zhì)譜法鑒定結(jié)合的核酸或蛋白探針(Lakey等，1998，“檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用”，CurrOpinStructBiol.8119-23)?？赏ㄟ^(guò)使用本發(fā)明的蛋白芯片測(cè)定在康復(fù)或非康復(fù)患者的免疫應(yīng)答中起抗原作用的病原體(例如感染性疾病因子，如病毒、細(xì)菌、真菌或寄生物)靶蛋白或異常細(xì)胞(例如癌細(xì)胞、患病細(xì)胞或損傷細(xì)胞)靶蛋白。例如，分離自患者的淋巴細(xì)胞可用于篩選在蛋白芯片上含病原體蛋白陣列的蛋白芯片。一般來(lái)說(shuō)，這些篩選包括使多種淋巴細(xì)胞接觸定位尋址陣列，并檢測(cè)固體支持體上發(fā)生淋巴細(xì)胞活化的位置，所述陣列在固體支持體上含多種潛在抗原，每種不同抗原都在固體支持體上的不同位置，其中不同抗原的密度為至少100種不同抗原/cm2。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，淋巴細(xì)胞與陣列上的病原體蛋白接觸，此后測(cè)定被抗原或抗原混合物活化的B細(xì)胞或T細(xì)胞，由此鑒定來(lái)自病原體的靶抗原。另一方面，通過(guò)例如篩選潛在抗原陣列，可使用所述蛋白芯片表征免疫應(yīng)答，以鑒定患者B細(xì)胞和/或T細(xì)胞靶。例如，B細(xì)胞可與潛在抗原(即具有抗原決定簇的分子)陣列溫育，以鑒定體液型免疫的抗原靶?？乖膩?lái)源可以是例如自身組織、已知或未知抗原的收集物(例如病原性微生物的收集物)、組織特異性或疾病特異性抗原收集物或合成抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用分離自患者的淋巴細(xì)胞篩選含患者自身組織蛋白陣列的蛋白芯片。這樣的篩選可鑒定引起自身免疫或變態(tài)反應(yīng)的蛋白的底物，并由此診斷自身免疫或變態(tài)反應(yīng)和/或鑒定潛在的目的藥物侯選物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白芯片用于鑒定能夠激活B細(xì)胞或T細(xì)胞的物質(zhì)。例如，淋巴細(xì)胞與芯片上測(cè)試分子或蛋白陣列接觸并測(cè)定淋巴細(xì)胞活化，由此鑒定通常能夠活化B細(xì)胞或T細(xì)胞或淋巴細(xì)胞亞群(例如細(xì)胞毒性T細(xì)胞)的物質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)各種方法測(cè)定抗原識(shí)別誘導(dǎo)的B細(xì)胞活化，所述方法包括但不限于檢測(cè)抗體合成、3H-胸苷摻入、標(biāo)記抗體與新表達(dá)或抑制的細(xì)胞表面分子的結(jié)合以及分泌表明B細(xì)胞活化的因子(例如細(xì)胞因子)。同樣，可通過(guò)各種測(cè)定檢測(cè)使用本發(fā)明蛋白芯片篩選的T細(xì)胞活化。例如，鉻(51Cr)釋放測(cè)定可檢測(cè)抗原識(shí)別以及隨后的細(xì)胞毒性T細(xì)胞活化(參見例如Palladino等，1987，CancerRes.475074-9；Blachere等，1993，J.Immunotherapy14352-6)。通過(guò)使用本發(fā)明的蛋白芯片可測(cè)定抗體制備物的特異性，包括使抗體制備物接觸定位尋址陣列，并檢測(cè)固體支持體上抗體制備物中的抗體發(fā)生結(jié)合的位置，所述陣列在固體支持體上含多種潛在抗原，每種不同抗原都在固體支持體上的不同位置，其中不同抗原的密度為至少100種不同抗原/cm2。所述抗體制備物可以是但不限于Fab片段、抗血清以及多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體或合成抗體。例如，可通過(guò)篩選疾病特異性抗原、組織特異性抗原或其它已鑒定的抗原收集物，并測(cè)定識(shí)別哪種抗原，特征鑒定抗血清。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用單克隆抗體篩選具有相似或相關(guān)抗原的蛋白芯片陣列，通過(guò)測(cè)定單克隆抗體結(jié)合陣列上的哪種抗原評(píng)價(jià)特異性程度。可通過(guò)用復(fù)合蛋白混合物(例如細(xì)胞提取物)處理蛋白芯片并測(cè)定蛋白活性檢測(cè)特異性細(xì)胞活性靶的身份。例如，可使含不同激酶陣列的蛋白芯片接觸化合物(例如藥物)處理細(xì)胞的細(xì)胞提取物，并測(cè)定激酶活性。在另一個(gè)實(shí)例中，可使含不同激酶陣列的蛋白芯片接觸特定細(xì)胞分化階段細(xì)胞(例如多能細(xì)胞)或特定代謝狀態(tài)細(xì)胞(例如有絲分裂細(xì)胞)的細(xì)胞提取物，并測(cè)定激酶活性。將由這些測(cè)定獲得的結(jié)果與例如存在或不存在藥物時(shí)的細(xì)胞、幾個(gè)分化階段的細(xì)胞或不同代謝狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，可提供不同條件下細(xì)胞生理變化的信息?；蛘?，可通過(guò)用復(fù)合蛋白混合物(例如細(xì)胞提取物)處理含多種不同蛋白(例如肽文庫(kù))的本發(fā)明蛋白芯片并測(cè)定芯片上蛋白的修飾，檢測(cè)特異性細(xì)胞活性靶的身份。例如，可使含不同蛋白陣列的蛋白芯片接觸化合物(例如藥物)處理細(xì)胞的細(xì)胞提取物，并測(cè)定例如激酶、蛋白酶、糖苷酶、乙?；D(zhuǎn)移酶、磷酸酶或其它轉(zhuǎn)移酶活性。在另一個(gè)實(shí)例中，可使含不同蛋白陣列的蛋白芯片接觸特定細(xì)胞分化階段細(xì)胞(例如多能細(xì)胞)或特定代謝狀態(tài)細(xì)胞(例如有絲分裂細(xì)胞)的細(xì)胞提取物。將由這些測(cè)定獲得的結(jié)果與例如存在或不存在藥物時(shí)的細(xì)胞、幾個(gè)分化階段的細(xì)胞或不同代謝狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，可提供在這些條件下細(xì)胞生理作用的信息。所述蛋白芯片可用于鑒定結(jié)合特定生物目標(biāo)分子的探針，所述特定生物目標(biāo)分子包括但不限于潛在配體分子的受體、病毒受體以及孤獨(dú)受體的配體。所述蛋白芯片還可用于檢測(cè)結(jié)合蛋白芯片上蛋白的DNA或RNA以及測(cè)定結(jié)合特異性。另外，可通過(guò)用核酸序列篩選這些蛋白陣列并測(cè)定結(jié)合特異性和結(jié)合強(qiáng)度，用蛋白芯片研究特定類型的RNA結(jié)合蛋白或DNA結(jié)合蛋白(例如鋅指蛋白)。可用本發(fā)明的蛋白芯片分析相似生物實(shí)體中功能、配體結(jié)合或酶活性不同的蛋白的身份。例如，測(cè)定來(lái)自不同等位基因的蛋白同種型互相之間的活性差異。高密度蛋白芯片可用于藥物尋找、藥物作用模式分析、藥物特異性和藥物毒性的預(yù)測(cè)。例如，可通過(guò)使芯片上蛋白與藥物或藥物侯選物在不同測(cè)定條件下溫育，通過(guò)測(cè)定陣列上藥物結(jié)合的位置測(cè)定藥物特異性并檢測(cè)每種不同蛋白的藥物結(jié)合量，測(cè)定結(jié)合藥物的蛋白的身份及其相對(duì)親和性。另一方面，可在同一蛋白芯片或在相同的第二塊芯片上進(jìn)行測(cè)定生物活性(而不是結(jié)合測(cè)定)的生物測(cè)定。因此，使用本發(fā)明蛋白芯片的這些測(cè)定類型可用于研究藥物特異性、預(yù)測(cè)藥物潛在的副作用以及藥物分類。此外，本發(fā)明的蛋白芯片適于篩選藥物侯選物的復(fù)雜文庫(kù)。具體地說(shuō)，可使芯片上的蛋白與藥物侯選物文庫(kù)溫育，然后可通過(guò)例如質(zhì)譜法鑒定結(jié)合組分，可同時(shí)鑒定優(yōu)先結(jié)合特定亞組蛋白或結(jié)合芯片上幾個(gè)或全部蛋白的所有文庫(kù)組分。此外，可測(cè)定藥物侯選物對(duì)陣列中不同蛋白的相對(duì)親和性。而且，可在先前觀測(cè)到的相互作用、酶活性或生物反應(yīng)的潛在抑制劑、催化劑、調(diào)節(jié)劑或增強(qiáng)劑存在的情況下探測(cè)本發(fā)明的蛋白芯片。以此方式，通過(guò)使用本發(fā)明的蛋白芯片，可分析例如藥物結(jié)合的封閉或病毒的破壞或特定類別蛋白的生理效應(yīng)物。本發(fā)明的蛋白芯片可用于測(cè)定藥物對(duì)復(fù)雜蛋白混合物的多個(gè)靶的修飾作用，所述復(fù)雜蛋白混合物例如完整細(xì)胞、細(xì)胞提取物或組織勻漿?？赏ㄟ^(guò)用藥物處理細(xì)胞、組織或提取物篩選一種或多種蛋白芯片分析藥物的凈效應(yīng)，然后可提供藥物處理狀態(tài)的“信號(hào)”，并且當(dāng)與未處理狀態(tài)的“信號(hào)”相比時(shí)，可提供例如效力、毒性和副作用的預(yù)測(cè)值。而且，通過(guò)例如向細(xì)胞、細(xì)胞提取物、組織勻漿或完整生物加入藥物，并將不同處理時(shí)間點(diǎn)的藥物處理細(xì)胞或提取物應(yīng)用于蛋白芯片，可測(cè)定隨時(shí)間變化的藥物作用?？赏ㄟ^(guò)使文庫(kù)與本發(fā)明的蛋白芯片溫育進(jìn)行噬菌體展示文庫(kù)的篩選?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法(例如質(zhì)譜法)測(cè)定陽(yáng)性克隆的結(jié)合，由此鑒定目的克隆，此后可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定編碼目的克隆的DNA(參見例如Ames等，1995，J.Immunol.Methods184177-86；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.24952-8；Persic等，1997，Gene1879-18)。芯片以此方式可用于選擇具有結(jié)合芯片上特定蛋白的表面組分的細(xì)胞?；蛘?，可將噬菌體展示文庫(kù)連接至芯片，以產(chǎn)生所述文庫(kù)的定位尋址陣列，此后可用不同的探針混合物重復(fù)篩選所述陣列。本發(fā)明還提供實(shí)施本發(fā)明測(cè)定方案的試劑盒。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括一種或多種本發(fā)明的陣列。所述試劑盒還可以在一個(gè)或多個(gè)容器中包括用于測(cè)定蛋白或分子的生物活性的試劑、用于測(cè)定探針和蛋白或分子相互作用的試劑、用于測(cè)定具有目的生物活性的蛋白或分子的生物活性的試劑和/或一種或多種探針、蛋白或其它分子。用于測(cè)定蛋白或分子生物活性的試劑或測(cè)定探針和蛋白或分子之間相互作用的試劑可包含在蛋白芯片上的每一個(gè)孔中或選定孔中。所述試劑可為溶液形式或固體形式。所述試劑可包括進(jìn)行目的測(cè)定需要的蛋白或分子和探針中的任一種或兩種都包括。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包含一種或多種芯片(即在固體支持體上含多種不同物質(zhì)的定位尋址陣列，所述物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同物質(zhì)由至少100種不同物質(zhì)/cm2組成)，并在一個(gè)或多個(gè)容器中包含一種或多種探針、試劑或其它分子。陣列物質(zhì)可連接至固體支持體上的孔表面。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒中的蛋白芯片可具有已連接至固體支持體孔的蛋白或探針。在再一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒中的蛋白芯片可具有用于測(cè)定蛋白或分子生物活性或測(cè)定探針和蛋白或分子相互作用的試劑或反應(yīng)混合物，它們已連接至固體支持體孔。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑未連接至固體支持體孔，但包含在孔中。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑未連接至固體支持體孔，但包含在一個(gè)或多個(gè)容器中，并可加入到固體支持體孔中。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括一個(gè)或多個(gè)容器，容器中含有用于測(cè)定蛋白或分子生物活性的溶液反應(yīng)混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒提供一種可結(jié)合用于進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)測(cè)定的目的探針、蛋白或分子和/或其它試劑的支持物(例如珠)，此后可將附著探針、蛋白或其它試劑的支持物放置到芯片孔中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒中的一種或多種蛋白芯片具有連接至固體支持體孔的目的生物活性的蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒中的一種或多種蛋白芯片具有在生物體基因組中具有相同類型生物活性的全部表達(dá)蛋白的至少50％、75％、90％或95％，它們連接至固體支持體孔。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，試劑盒中的一種或多種蛋白芯片具有在生物體(例如特定物種)基因組中全部表達(dá)的激酶、磷酸酶、糖苷酶、蛋白酶、乙?；D(zhuǎn)移酶、其它基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶、核酸結(jié)合蛋白、激素結(jié)合蛋白或DNA結(jié)合蛋白的至少50％、75％、90％或95％，它們連接至固體支持體孔。E.用于蛋白芯片的蛋白全長(zhǎng)蛋白、全長(zhǎng)蛋白的部分和肽，無(wú)論是由生物體重組過(guò)表達(dá)制備，還是較大蛋白片段化產(chǎn)生，還是化學(xué)合成，都可在本發(fā)明中用于形成蛋白芯片。過(guò)表達(dá)蛋白的生物體包括但不限于細(xì)菌、酵母、昆蟲、人和非人哺乳動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、貓、犬、豬、母牛和馬。此外，可使用其中一種限定結(jié)構(gòu)域連接至各種天然或合成蛋白中的一種蛋白的融合蛋白?？稍谶B接至蛋白芯片孔或沉積在蛋白芯片孔中之前純化用于本發(fā)明的蛋白，或在通過(guò)使用先前已連接或沉積在蛋白芯片孔的試劑在連接過(guò)程中純化用于本發(fā)明的蛋白。這些試劑包括通常特異性結(jié)合蛋白或結(jié)合特定類型蛋白的試劑。蛋白可在連接至蛋白芯片之前或與其同時(shí)嵌入人工或天然膜(例如脂質(zhì)體、膜囊泡)中。或者可將蛋白分配到蛋白芯片孔中。優(yōu)選通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法表達(dá)用于本發(fā)明蛋白芯片的蛋白。優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是Invitrogen的InsectSelect系統(tǒng)(Carlsbad，CA，目錄號(hào)K800-01)，該系統(tǒng)是一種非裂解型單載體昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，其簡(jiǎn)化了高質(zhì)量蛋白的表達(dá)，并消除了產(chǎn)生和擴(kuò)增病毒母液的需要。該系統(tǒng)中的優(yōu)選載體是pIB/V5-HisTOPOTA載體(目錄號(hào)K890-20)?？墒褂蒙a(chǎn)商描述的方法將聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物直接克隆入該載體，然后表達(dá)具N-末端組氨酸(His)標(biāo)記的蛋白，所述標(biāo)記可用于純化表達(dá)的蛋白。得自Lifetech(Rockville，MD)的另一種昆蟲細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)BAC-TO-BACTM系統(tǒng)也是一種優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)。BAC-TO-BACTM系統(tǒng)不是使用同源重組，而是依靠位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座在大腸桿菌中產(chǎn)生重組桿狀病毒?；虮磉_(dá)由高活性多角體蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，因此在感染的昆蟲細(xì)胞中可提供高達(dá)25％的細(xì)胞蛋白。VI.實(shí)施例I使用蛋白芯片分析酵母蛋白激酶A.前言以下的實(shí)施例例舉了蛋白芯片生產(chǎn)的各個(gè)方面以及使用本發(fā)明蛋白芯片的方法。本發(fā)明的蛋白芯片技術(shù)適于快速分析大量的樣品，因此該方法適于分析幾乎所有的酵母蛋白激酶。蛋白激酶催化蛋白磷酸化，并在調(diào)節(jié)基礎(chǔ)細(xì)胞功能(如細(xì)胞周期控制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯和能量代謝7)方面起關(guān)鍵性作用。完整基因組序列的可利用性使得有可能分析所有由生物體編碼的蛋白激酶并測(cè)定其體外底物。酵母基因組已經(jīng)完成測(cè)序，包含大約6200個(gè)長(zhǎng)度超過(guò)100個(gè)密碼子的可讀框；預(yù)計(jì)其中有122個(gè)編碼蛋白激酶。這些蛋白激酶基因中有24個(gè)先前還沒(méi)有研究過(guò)8。除了兩種組氨酸蛋白激酶之外，所有的酵母蛋白激酶都是Ser/Thr家族成員；盡管已經(jīng)報(bào)道了7種磷酸化絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸的蛋白激酶，但不存在酪氨酸激酶家族成員。隨著本發(fā)明蛋白芯片技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)可如本文所述對(duì)釀酒酵母的幾乎所有蛋白激酶的生化活性進(jìn)行高通量分析。使用的蛋白芯片為300nl孔的一次性陣列，所述孔位于放置于顯微鏡載玻片上面的硅氧烷彈性體層中。高密度小尺寸孔允許高通量分批處理和同時(shí)分析許多單獨(dú)的樣品，僅需要少量蛋白。使用本發(fā)明的蛋白芯片，將釀酒酵母激酶蛋白(總共119種不同的激酶)融合至在酵母中過(guò)表達(dá)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，然后純化并測(cè)定其磷酸化17種不同底物的能力。幾乎所有的測(cè)試激酶(93％)都對(duì)一種或多種底物表現(xiàn)出至少比對(duì)照高5倍的活性，包括24種以前未表征的激酶中的18種。32種激酶顯示優(yōu)先磷酸化一種或兩種底物。27種激酶容易磷酸化多聚(Tyr-Glu)。因?yàn)檫@些激酶中僅有5種先前歸類為雙功能激酶(即它們既能磷酸化Ser/Thr，也能磷酸化Tyr)，所以這些發(fā)現(xiàn)在所述激酶能夠磷酸化酪氨酸殘基方面極大地拓展了我們的認(rèn)識(shí)。令人感興趣的是，這些雙重特異性激酶經(jīng)常在催化區(qū)域附近共有相同的氨基酸殘基。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的蛋白芯片技術(shù)可用于蛋白生化活性的高通量篩選以及用于分析完整的蛋白質(zhì)組。B.方法1.細(xì)胞培養(yǎng)、構(gòu)建和蛋白純化使用Hudson等的重組策略9，將122種酵母蛋白激酶基因中的119種克隆入高拷貝URA3表達(dá)載體(pEG(KG))中，該載體在半乳糖誘導(dǎo)型GAL10啟動(dòng)子控制下產(chǎn)生GST融合蛋白10。簡(jiǎn)而言之，由ResearchGenetics購(gòu)買與每個(gè)ORF末端互補(bǔ)的引物；這些引物的末端包含通用的20bp序列。在第二輪PCR中，通過(guò)加入與載體同源的序列修飾這些產(chǎn)物的末端。將在其末端含載體序列的PCR產(chǎn)物連同所述載體一起轉(zhuǎn)化入pep4酵母菌株(其缺少幾種酵母蛋白酶)10，并選擇Ura+菌落。在大腸桿菌中富集質(zhì)粒，通過(guò)限制酶消化確認(rèn)，使用與所述載體互補(bǔ)的引物測(cè)定涵蓋載體-插入片段連接部分在內(nèi)的DNA序列。對(duì)于GST∷Cla4構(gòu)建物，移碼突變位于N端編碼區(qū)的poly(A)節(jié)段中。發(fā)現(xiàn)一個(gè)保持讀框的正確克隆需要3個(gè)獨(dú)立的克隆。對(duì)于這些基因中的5種，獲得2個(gè)重疊的PCR產(chǎn)物，將其引入到酵母細(xì)胞中。將證實(shí)的質(zhì)粒再引入到pep4酵母菌株中，以便進(jìn)行激酶蛋白純化。為使用96孔結(jié)構(gòu)制備樣品，在含2ml孔的盒中于含棉子糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)0.75ml細(xì)胞至O.D.(600)約0.5；每種菌株使用2個(gè)孔。加入半乳糖至終濃度為4％以誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)。合并相同菌株的培養(yǎng)物，用500ml裂解緩沖液清洗1次，在200ml裂解緩沖液中重懸浮，并轉(zhuǎn)移至含100μl冷凍玻璃珠的96×0.5ml板(DotScientific，USA)中。通過(guò)在4℃重復(fù)渦旋裂解盒中的細(xì)胞，并使用谷胱甘肽珠和標(biāo)準(zhǔn)方法20在96孔結(jié)構(gòu)中由這些菌株純化GST融合蛋白。通過(guò)將純化蛋白的考馬斯染色圖譜與使用抗GST抗體的免疫印跡分析獲得的圖譜進(jìn)行對(duì)比測(cè)定5種純化GST∷激酶蛋白(Swe1、Ptk2、Pkh1、Hog1、Pbs2)的純度。結(jié)果表明，純化蛋白純度超過(guò)90％。為純化活性形式的Hog1，用0.4MNaCl在誘導(dǎo)的最后5分鐘處理所述細(xì)胞。蛋白激酶活性于-70℃可至少穩(wěn)定2個(gè)月，激酶活性幾乎沒(méi)有或沒(méi)有損失。2.芯片加工和蛋白連接由硅氧烷彈性體聚二甲基硅氧烷(PDMS)(DowChemical，USA)制備芯片，在微加工模上鑄造。將液態(tài)PDMS傾注在模具上，固化(于65℃至少4小時(shí))后由可重復(fù)使用的模板上刮下柔韌的硅氧烷彈性體陣列層。盡管PDMS可容易地鑄造在微光刻加工結(jié)構(gòu)上，但為了本文描述的激酶測(cè)定，用計(jì)算機(jī)控制的激光切削工具(UniversalLaserSystems，USA)定型、由丙烯酸層制備的模板足以滿足要求。測(cè)試了超過(guò)30種不同的陣列。測(cè)試的可變因素是孔的寬度和深度(寬度范圍為100μm至2.5mm，深度為100μm至1mm)、孔間間隔(100μm至1mm)、構(gòu)型(或者矩形陣列，或者最緊密封裝)和孔形(方形與圓形)。使用激光切削丙烯酸模板提供了一種快速廉價(jià)的獲得大量參數(shù)不同的原型模板的方法。為確定使蛋白與孔的附著最大化的條件，用5MH2SO4、10MNaOH、過(guò)氧化氫或3-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTS)(Aldrich，USA)連接體處理PDMS11，12。與未處理的PDMS或其它方式處理的PDMS相比，GPTS處理獲得的蛋白與孔的吸附最大。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，用100％EtOH于室溫清洗3次后，將芯片浸入到1％GPTS溶液(95％EtOH，16mMHOAc)中，于室溫振搖1小時(shí)。用95％EtOH清洗3次后，在真空下于135℃固化芯片2小時(shí)。固化的芯片可在干燥的氬氣中儲(chǔ)存數(shù)個(gè)月12。為使蛋白連接至芯片，將蛋白溶液加入到孔中，并在冰上溫育1-2小時(shí)。用冷HEPES緩沖液(10mMHEPES，100mMNaCl，pH7.0)淋洗3次后，用1％BSA的PBS溶液(Sigma，USA)于冰上封閉孔1小時(shí)以上。由于使用了GPTS，避免了使用任何含伯胺基團(tuán)的試劑。為確定可連接至已處理PDMS的蛋白濃度，使用連續(xù)稀釋的酶液將辣根過(guò)氧化物酶(HRP)抗小鼠Ig(Amersham，USA)連接至芯片。用PBS徹底清洗后，使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)法(Amersham，USA)檢測(cè)結(jié)合的抗體。高達(dá)8×10-9μg/μm2的蛋白可連接至表面，用我們的免疫染色方法檢測(cè)需要的最少量為8×10-13μg/μm2。3.免疫印跡、激酶測(cè)定和數(shù)據(jù)獲得如所述進(jìn)行免疫印跡分析34。使用33P-γ-ATP測(cè)試GST∷蛋白激酶的體外激酶活性13。在自磷酸化測(cè)定中，將GST∷激酶直接附著于GPTS處理的PDMS，并在合適的緩沖液中用33P-γ-ATP進(jìn)行體外反應(yīng)。在底物反應(yīng)中，通過(guò)GPTS將底物粘附于孔，用HEPES緩沖液清洗孔并用1％BSA封閉，然后加入激酶、33P-γ-ATP和緩沖液?？偡磻?yīng)體積保持在0.5μl/反應(yīng)以下。于30℃溫育30分鐘以后徹底清洗芯片，使芯片對(duì)X光片和50μm分辨率的定量MolemularDynamicsPhosphorImager曝光。對(duì)于12種底物，每種激酶測(cè)定都重復(fù)至少2次；對(duì)于余下的5種底物，進(jìn)行1次測(cè)定。為測(cè)定底物特異性，使用下式計(jì)算特異性指數(shù)(SI)SIir＝Fir/[(Fi1+Fi2+......+Fir)/r]，其中i表示所使用激酶的標(biāo)識(shí)，r代表底物標(biāo)識(shí)，而Fir代表與單獨(dú)的GST相比激酶i對(duì)底物r作用的增加倍數(shù)。4.激酶序列比對(duì)和系統(tǒng)樹使用Gonnet250打分矩陣36，用CLUSTALW算法35產(chǎn)生基于107種蛋白激酶的核心激酶催化結(jié)構(gòu)域亞序列的多序列比對(duì)。由SWISS-PROT37、PIR38和GenBank39數(shù)據(jù)庫(kù)獲得激酶催化結(jié)構(gòu)域序列。對(duì)于其催化結(jié)構(gòu)域還沒(méi)有注解的那些激酶(DBF4/YDR052C和SLN1/YIL147C)，使用BLOSUM50打分矩陣42，用FASTA算法40，41由與數(shù)據(jù)組其它激酶亞序列比對(duì)推斷可能的激酶亞序列。由所述比對(duì)提取出對(duì)應(yīng)于11種核心催化亞結(jié)構(gòu)域43的蛋白亞序列，用PROTPARS44程序由計(jì)算機(jī)確定系統(tǒng)樹(圖5a)。5.蛋白芯片數(shù)據(jù)的功能分組為顯現(xiàn)蛋白激酶之間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的大致功能關(guān)系，基于其磷酸化12種不同底物的能力對(duì)激酶進(jìn)行系統(tǒng)排序(由web站點(diǎn)http//bioinfo.mbb.yale.edu/genome/yeast/chip獲得從2000年8月17日起的數(shù)據(jù))。記錄對(duì)應(yīng)于107種蛋白激酶對(duì)每種底物的-/+活性分布，離散值為。由實(shí)驗(yàn)譜之間的成對(duì)Hamming距離產(chǎn)生矩陣，使用PHYLIP軟件包44的FITCH程序34執(zhí)行的Fitch-Margoliash最小平方評(píng)價(jià)法45計(jì)算機(jī)計(jì)算未確定起源的系統(tǒng)發(fā)生。在每種情況下都對(duì)分類單位的輸入順序進(jìn)行隨機(jī)化，以便消除數(shù)據(jù)集組織中的任何固有偏倚，并通過(guò)樹結(jié)構(gòu)的整體重排獲得最佳系統(tǒng)。C.結(jié)果1.酵母激酶克隆和蛋白純化我們嘗試使用重組定向克隆策略9在高拷貝表達(dá)載體(pEG(KG))中克隆122種酵母蛋白激酶基因的完整編碼區(qū)，表達(dá)載體pEG(KG)在半乳糖誘導(dǎo)型GAL10啟動(dòng)子10(圖1a)控制下生產(chǎn)GST融合蛋白。在大腸桿菌中導(dǎo)入GST∷激酶構(gòu)建物，并測(cè)定每種構(gòu)建物的5′末端序列。使用該策略按讀框克隆了122種酵母蛋白激酶基因中的119種。三種未克隆的激酶基因非常大(4.5-8.3kb)。在酵母中過(guò)量生產(chǎn)GST∷激酶融合蛋白，使用谷胱甘肽珠和標(biāo)準(zhǔn)方法11由50ml培養(yǎng)物中純化GST∷激酶融合蛋白。對(duì)于Hog1，用高鹽處理酵母細(xì)胞，以在誘導(dǎo)的最后5分鐘活化該酶；對(duì)于其它的激酶，使用合成培養(yǎng)基(URA-/棉子糖)。使用抗GST抗體免疫印跡分析全部119種融合蛋白揭示，105種酵母菌株產(chǎn)生可檢測(cè)的GST∷融合蛋白；在大多數(shù)情況下融合蛋白為全長(zhǎng)。每ml起始培養(yǎng)物獲得高達(dá)1μg的融合蛋白(圖1b)。但是，119種GST∷激酶樣品中有14種未能通過(guò)免疫印跡分析檢測(cè)到。估計(jì)這些蛋白在使用的pep4蛋白酶缺陷型菌株中不能穩(wěn)定過(guò)量產(chǎn)生，或者這些蛋白可能形成使用我們的方法不能純化的不溶性聚集物。盡管該方法是成功的，但使用50ml培養(yǎng)物純化GST融合蛋白是一個(gè)耗時(shí)的過(guò)程，并且不能用于制備數(shù)以千計(jì)的樣品。因此，發(fā)展出在96孔結(jié)構(gòu)中培養(yǎng)細(xì)胞的方法(參見方法)。使用該方法制備出119種GST融合蛋白，并且在6小時(shí)內(nèi)每ml起始培養(yǎng)物純化的產(chǎn)量比所述50ml方法高出約2倍。2.蛋白芯片設(shè)計(jì)開發(fā)蛋白芯片對(duì)119種酵母蛋白激酶進(jìn)行高通量生化測(cè)定(圖2)。這些芯片由在一次性硅氧烷彈性體聚二甲基硅氧烷(PDMS)11中的孔陣列組成。孔陣列允許小體積的不同探針高密度裝填在單個(gè)芯片上，而在隨后的分批處理過(guò)程中仍保持隔離。使用連接體3-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTS)12將蛋白共價(jià)連接至所述孔。連接至表面的蛋白可高達(dá)8×10-9μg/μm2(參見方法)。為進(jìn)行蛋白激酶測(cè)定，使蛋白芯片技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)樣品操作和記錄設(shè)備相匹配。使用放射性同位素(33P)、以下描述的激酶測(cè)定和手動(dòng)加樣測(cè)試各種陣列配置。以下的芯片產(chǎn)生最佳結(jié)果1.4mm直徑和300μm深(大約300nl)的圓孔，具有1.8mm間距的10×14矩形陣列構(gòu)型。生產(chǎn)一個(gè)主模(12個(gè)陣列)，重復(fù)鑄造大量陣列進(jìn)行蛋白激酶分析。為操作目的將芯片放置在顯微鏡載玻片上面(圖2a)；陣列覆蓋面積稍稍超出標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載玻片的1/3，通常使用每個(gè)載玻片兩個(gè)陣列(圖2b)。盡管使用手動(dòng)移液法將蛋白置于每個(gè)孔中，但也可以使用自動(dòng)化技術(shù)。另外，這種蛋白芯片構(gòu)型還可以使用其它標(biāo)記方法，例如使用磷蛋白的熒光標(biāo)記抗體，隨后檢測(cè)免疫熒光。3.使用蛋白芯片的大規(guī)模激酶測(cè)定使用33P-γ-ATP和17種不同芯片以17個(gè)不同測(cè)定測(cè)試全部119種GST∷蛋白激酶的體外激酶活性13。使用如下的不同底物測(cè)定每種芯片1)自磷酸化；2)牛組蛋白H1(共同激酶底物)；3)牛酪蛋白(共同底物)；4)髓磷脂堿性蛋白(共同底物)；5)Axl2C末端-GST(Axl2是一種參與芽殖的跨膜磷蛋白)14；6)Rad9(一種參與DNA損傷關(guān)卡的磷蛋白)15；7)Gic2(一種參與芽殖的磷蛋白)；8)Red1(對(duì)染色體聯(lián)會(huì)很重要的一種減數(shù)分裂磷蛋白)；9)Mek1(對(duì)染色體聯(lián)會(huì)很重要的一種減數(shù)分裂蛋白激酶)；10)多聚(酪氨酸-谷氨酸1∶4)(多聚(Tyr-Glu))；一種酪氨酸激酶底物)19；11)Ptk2(一種小分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)20；12)Hsl1(一種參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的蛋白激酶)21；13)Swi6(一種參與G1/S控制的磷酸轉(zhuǎn)錄因子)22；14)Tub4(一種參與微管成核的蛋白)23；15)Hog1(一種參與滲透壓調(diào)節(jié)的蛋白激酶)24；16)Hog1(所述激酶的失活形式)和17)GST(對(duì)照)。對(duì)于自磷酸化測(cè)定，將所述激酶直接連接至處理的PDMS孔并加入33P-γ-ATP；對(duì)于底物反應(yīng)，將所述底物結(jié)合至孔，然后加入激酶和33P-γ-ATP。反應(yīng)完成后，清洗載玻片，使用高分辨率磷成象儀獲得和定量磷酸化信號(hào)。實(shí)例示于圖3。為鑒定激酶活性，將定量信號(hào)轉(zhuǎn)化為相對(duì)于GST對(duì)照的增加倍數(shù)并作圖，以便作圖進(jìn)行進(jìn)一步的分析(圖4a)。如圖4a所示，大部分(93.3％)激酶對(duì)至少一種底物表現(xiàn)出超出背景5倍或更高的活性。正如預(yù)期一樣，Hrr25、Pbs2和Mek1分別磷酸化其已知底物25-27Swi6(比GST對(duì)照高400倍)、Hog1(高10倍)和Red1(出10倍)。該測(cè)定的結(jié)果證明，24種預(yù)測(cè)的蛋白激酶中有先前還沒(méi)有研究過(guò)的18種磷酸化一種或多種底物，幾種非常規(guī)激酶也是如此8，包括組氨酸激酶(Sln1，Yi1042c)和磷脂激酶(例如Mec1)。為測(cè)定底物特異性，再將特定激酶活性對(duì)其對(duì)所有底物的平均活性歸一化。幾個(gè)實(shí)例示于圖4b；全部數(shù)據(jù)都可由http//bioinfo.mbb.yale.edu/genome/yeast/chip獲得。32種激酶對(duì)一種特定底物表現(xiàn)出特異性，特異性指數(shù)(SI，參見方法)等于或高于2，相反，一種特定蛋白激酶或一組激酶優(yōu)先磷酸化大多數(shù)底物。例如，相對(duì)于其它蛋白來(lái)說(shuō)，Dbf20、Kin2、Yak1和Ste20優(yōu)先磷酸化Axl2(一種參與酵母細(xì)胞芽殖的蛋白)的C末端。令人感興趣的是，前面的研究發(fā)現(xiàn)Ste20位于與Axl2相似的新生芽頂端，而ste20Δ/cla4ts突變體不能出芽或形成完全極化的肌動(dòng)蛋白片或絲28。另一個(gè)實(shí)例是也參與芽殖的磷蛋白Gic216。Ste20和Skm1強(qiáng)烈磷酸化Gic2(圖4b)。先前的研究提示，Cdc42與Gic2、Cla429、Ste20和Skm1相互作用。我們的結(jié)果增加了以下的可能性即Cdc42可能通過(guò)募集Ste20和/或Skm1促進(jìn)Gic2磷酸化。4.酵母包含多種雙功能特異性激酶特別令人感興趣的是雙功能特異性激酶，即既磷酸化Ser/Thr也磷酸化酪氨酸的那些酶。根據(jù)序列分析，除兩種酵母蛋白激酶以外，所有激酶都屬于Ser/Thr蛋白激酶家族；但是，在進(jìn)行本研究時(shí)有人報(bào)道了7種蛋白激酶(Mps1、Rad53、Swe1、Ime2、Ste7、Hrr25和Mck1)為雙功能特異性激酶19。我們證實(shí)，Swe1、Mps1、Ime2和Hrr25容易磷酸化多聚(Tyr-Glu)，但我們未檢測(cè)Ste7、Rad53或Mck1的任何酪氨酸激酶活性。Mck1在我們的任何一個(gè)測(cè)定中都不顯示強(qiáng)活性；但是，Ste7和Rad53在其它測(cè)定中非常活躍。因此，它們不能磷酸化多聚(Tyr-Glu)表明，它們或者多半是很弱的酪氨酸激酶，或者至少對(duì)多聚(Tyr-Glu)底物弱。與后一種可能性相一致的是，其他人發(fā)現(xiàn)多聚(Tyr-Glu)是Rad53的非常弱的底物(Ref19；D.Stern，pers.comm.)。令人感興趣的是，我們發(fā)現(xiàn)23種其它激酶也有效使用多聚(Tyr-Glu)作為底物，表明在酵母中存在至少27種激酶能夠作為雙功能特異性激酶在體外起作用。最近證實(shí)，其中一個(gè)激酶Rim1磷酸化其體內(nèi)底物Ime2上的Tyr殘基，表明其確實(shí)是雙功能特異性激酶30。總之，本實(shí)驗(yàn)粗略地使能夠起雙功能特異性激酶作用的激酶數(shù)目增加3倍，并提出了有關(guān)其中一些激酶分類為雙功能特異性激酶的問(wèn)題。5.多聚(Tyr-Glu)激酶的功能特異性和氨基序列之間的關(guān)系酵母蛋白激酶的大規(guī)模分析使我們可以比較蛋白激酶互相之間的功能關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，其中許多磷酸化多聚(Tyr-Glu)的激酶互相之間在氨基酸序列上相關(guān)70％的多聚(Tyr-Glu)激酶在系統(tǒng)樹上聚簇為4個(gè)不同的組，其中所述激酶互相之間根據(jù)其保守蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的序列相似性編組(圖5a)。氨基酸序列的其它測(cè)試揭示，相對(duì)于不使用多聚(Tyr-Glu)作為底物的激酶來(lái)說(shuō)，4種類型的氨基酸偏好存在于多聚(Tyr-Glu)類激酶中(三種為賴氨酸，一種為甲硫氨酸)；一種殘基(天冬酰胺)偏好位于不容易使用多聚(Tyr-Glu)作為底物的激酶中(圖5b)。所述殘基中的大多數(shù)都位于所述分子的催化部分附近(圖5b)31，提示它們可能在底物識(shí)別中起作用。D.討論1.大規(guī)模分析蛋白激酶本研究使用新型蛋白芯片技術(shù)特征鑒定119種蛋白激酶對(duì)17種不同底物的活性。我們發(fā)現(xiàn)特定蛋白是特定蛋白激酶的優(yōu)選底物，反之亦然，許多蛋白激酶優(yōu)選特定底物。這些研究要考慮非目的酶的激酶有可能污染我們的制品。盡管這不能嚴(yán)格排除在外，但通過(guò)考馬斯染色和用抗-GST免疫印跡染色對(duì)我們樣品中的5種進(jìn)行分析表明，我們的制品不存在任何不是GST融合蛋白的可檢測(cè)條帶(參見方法)。需要重點(diǎn)指出的是，體外測(cè)定不能確保特定激酶的體外底物能被該激酶體內(nèi)磷酸化。相反，這些實(shí)驗(yàn)表明，某些蛋白能夠用作特定激酶的底物，由此允許進(jìn)一步的分析。在這方面，這些測(cè)定類似于檢測(cè)候選相互作用的雙雜交研究。測(cè)定該過(guò)程是否能正常地在體內(nèi)發(fā)生必須其它的實(shí)驗(yàn)方法。與其中許多底物可能是體內(nèi)真正底物的想法相一致的是，觀察到三種激酶Hrr25、Pbs2和Mek1在我們的測(cè)定中磷酸化其已知底物。而且，許多激酶(例如Ste20)與其體外底物(例如Axl2)共定位。因此，我們預(yù)期，許多在我們的體外測(cè)定中磷酸化底物的激酶在體內(nèi)可能也是如此。盡管其中大部分激酶在我們的測(cè)定中有活性，但有幾種沒(méi)有。推測(cè)我們制品中的后幾種激酶或者缺乏足夠量的活化物，或者在活化條件下不能純化。例如，在我們的測(cè)定中無(wú)活性的Cdc28可能缺乏其活化細(xì)胞周期蛋白。對(duì)于Hog1，用高鹽處理細(xì)胞以活化酶。因?yàn)槲覀兊募っ钢苽湮锏拇_幾乎全部都表現(xiàn)出活性，所以我們推測(cè)制備物中的至少部分酶已正確活化和/或包含必須的輔因子。有可能是這些酶在其天然生物中過(guò)表達(dá)對(duì)高度成功地獲得活化酶起顯著作用。使用蛋白芯片測(cè)定鑒定出許多利用多聚(Tyr-Glu)的激酶。大規(guī)模分析許多激酶提供了一種使多聚(Tyr-Glu)激酶的功能特異性與特異性氨基酸序列聯(lián)系起來(lái)的新方法。磷酸化多聚(Tyr-Glu)的激酶中的許多殘基都包含堿性殘基。這可以預(yù)計(jì)得到，假如激酶殘基和Glu殘基之間是靜電作用的話。但是，某些其它殘基的作用不是顯而易見的，例如磷酸化多聚(Tyr-Glu)的激酶上的Met殘基，以及不磷酸化多聚(Tyr-Glu)的激酶上的Asn。這些激酶殘基可通過(guò)其它機(jī)制提供底物特異性。無(wú)論如何，分析其它底物應(yīng)當(dāng)可以進(jìn)一步使所有蛋白激酶的功能特異性和蛋白激酶序列關(guān)聯(lián)起來(lái)。2.蛋白芯片技術(shù)除了快速分析大量樣品之外，本文描述的蛋白芯片技術(shù)具有超越常規(guī)方法的顯著優(yōu)勢(shì)。1)芯片型測(cè)定具有高信噪比。我們發(fā)現(xiàn)，使用蛋白芯片表現(xiàn)出的信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于(＞10倍)傳統(tǒng)微量滴定板測(cè)定觀察到的信噪比(未列出數(shù)據(jù))。推測(cè)這是由于以下事實(shí)33P-γ-ATP與PDMS的結(jié)合未達(dá)到微量滴定板的程度。2)需要的材料量非常少。反應(yīng)體積為384孔微量滴定板使用量的1/20-1/40；每次反應(yīng)使用的蛋白激酶少于20ng。3)使用蛋白芯片的酶測(cè)定非常敏感。即使僅有105種融合蛋白可通過(guò)免疫印跡分析檢測(cè)出來(lái)，但仍有112種融合蛋白對(duì)至少一種底物的酶活性顯示超過(guò)背景5倍。例如，Mps1在許多激酶測(cè)定中始終如一地顯示出最強(qiáng)活性，即使我們還不能夠通過(guò)免疫印跡分析檢測(cè)出該融合蛋白(參見圖1b和3a)。4)最后，芯片廉價(jià)；每個(gè)陣列的材料成本低于8美分。微加工模也易于制備且廉價(jià)。除了分析蛋白激酶外，該蛋白芯片技術(shù)也適用于各種各樣的其它測(cè)定，例如ATP和GTP結(jié)合測(cè)定、核酸酶測(cè)定、解螺旋酶測(cè)定和蛋白-蛋白作用測(cè)定。最近，在一個(gè)獨(dú)立研究中，Phizicky和同事在非常弱的CUP1啟動(dòng)子控制下表達(dá)了為GST融合蛋白的酵母蛋白6。盡管其克隆的品質(zhì)還沒(méi)有確定，但他們能夠使用含所述融合蛋白的酵母菌株庫(kù)鑒定生化活性。我們的蛋白芯片方法的優(yōu)勢(shì)在于所有樣品都可以在單一實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行分析。而且，盡管本研究使用具有聚集樣品優(yōu)勢(shì)的孔，但也可以使用平面PDMS芯片和載玻片進(jìn)行其它測(cè)定；其優(yōu)勢(shì)是可與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)樣針工具微陣列一起使用。該技術(shù)還可適用于促進(jìn)高通量藥物篩選，在該篩選中人們可篩選抑制或激活任何目的基因產(chǎn)物酶活性的化合物。因?yàn)檫@些測(cè)定將在蛋白水平上進(jìn)行，所以結(jié)果對(duì)蛋白的分子功能更直接和更有意義。我們使用通?？色@得的樣品操作和記錄設(shè)備配置用于特定蛋白激酶測(cè)定的蛋白芯片技術(shù)。為此，陣列尺寸相對(duì)比容易用微加工硅氧烷彈性體結(jié)構(gòu)獲得的尺寸要大32。我們鑄造的PDMS結(jié)構(gòu)的形狀尺寸比本文報(bào)道的用微光刻加工模獲得的結(jié)構(gòu)小兩個(gè)數(shù)量級(jí)，而其他人報(bào)道了微加工結(jié)構(gòu)的亞微米形體尺寸33。這些結(jié)果表明，微加工蛋白芯片的孔密度可容易地增加幾個(gè)數(shù)量級(jí)。本文報(bào)道的蛋白芯片技術(shù)易于放大?？傊_發(fā)了一種用于高通量篩選蛋白生化活性的廉價(jià)一次性蛋白芯片技術(shù)。通過(guò)測(cè)定釀酒酵母的119種蛋白激酶對(duì)17種不同底物的磷酸化進(jìn)行分析，證明了其用途。這些蛋白芯片允許同時(shí)檢測(cè)數(shù)以百計(jì)的蛋白樣品。使用基于芯片技術(shù)的微加工孔陣列使陣列密度可容易地增加幾個(gè)數(shù)量級(jí)。隨著合適樣品操作和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，這些蛋白芯片可用于同時(shí)測(cè)定幾千至幾百萬(wàn)種樣品。E.參考文獻(xiàn)1.Fields，S.，Kohara，Y.，和Lockhart，D.J.功能基因組，Proc.Natl.Acad.Sci.96，8825-26(1999)。2.Goffeau，A.，等，6000種基因的生命，Science274，563-567(1996)。3.DeRisi，J.L.，Iyer，V.R.和Brown，P.O.在基因組規(guī)模上探索基因表達(dá)的代謝和遺傳控制，Science278，680-686(1997)。4.Winzeler，E.A.等，通過(guò)基因缺失和平行分析功能性特征鑒定釀酒酵母基因組，Science285，901-906(1999)。5.Heyman，J.A.，等，使用拓?fù)洚悩?gòu)酶-I介導(dǎo)的連接對(duì)各個(gè)可讀框進(jìn)行基因組規(guī)模的克隆和表達(dá)，GenomeRes.9，383-392(1999)。6.Martzen，M.R.，等，通過(guò)其產(chǎn)物活性鑒定基因的生化基因組方法，Science286，1153-1155(1999)。7.PlowmanG.D.，SudarsanamS.，BinghamJ.，WhyteD.，和HunterT.，Caenorhabditiselegans蛋白激酶多細(xì)胞生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型，Proc.Natl.Acad.Sci.96，13603-12610(1999)。8.Hunter，T.，&Plowman，G.D.，芽殖酵母蛋白激酶120種或更多，TIBS22，18-22(1997)。9.Hudson，J.R.，等，易用形式的釀酒酵母成套預(yù)測(cè)基因，GenomeRes.7，1169-1173(1997)。10.Mitchell，D.A.，Marshall，T.K.，和Deschenes，R.J.誘導(dǎo)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合蛋白在酵母中過(guò)表達(dá)的載體，Yeast9，715-23(1993)。11.Rogers，Y.-H.，等，通過(guò)二硫鍵將寡核苷酸固定在玻璃支持體上DNA微陣列制備方法，Analy.Biochem.266，23-30(1999)。12.Stimpson，D.J.，等，通過(guò)使用光波指引實(shí)時(shí)檢測(cè)寡核苷酸陣列上的DNA雜交和解鏈，Proc.Natl.Acad.Sci.92，6379-6383(1995)。13.Hunter，T.&Sefton，B.M.蛋白質(zhì)磷酸化，Meth.inEnzym.200，35-83(1991)。14.Roemer，T.K.，等，在酵母中選擇軸向生長(zhǎng)位點(diǎn)需要一種新質(zhì)膜糖蛋白Axl2p，Genes&Dev.10，777-793(1996)。15.Weinert，T.A.&Hartwell，L.H.cdc突變體的細(xì)胞周期停滯和RAD9關(guān)卡的特異性，Genetics134，63-80(1993)。16.Jaquenoud，M.，Gulli，M.P.，Peter，K.，和Peter，M.cdc42p效應(yīng)物Gic2p是SCFGrrl復(fù)合物遍在蛋白依賴性降解的目標(biāo)，EMBOJ.17，5360-5373(1998)。17.Menees，T.M.，Ross-MacDonald，P.B.，和Roeder，G.S.染色體聯(lián)會(huì)需要一種減數(shù)分裂特異性酵母基因MEI4，Mol.CellBiol.12，1340-1351(1992)。18.Bailis，T.M.，&Roeder，G.S.聯(lián)會(huì)復(fù)合體形態(tài)發(fā)生和姐妹染色單體粘合需要減數(shù)分裂染色體蛋白Mek1依賴性磷酸化，Genes&Dev.12，3551-3563(1998)。19.Stern，D.F.，Zheng，P.，Beidler，D.R.，和Zerillo，C.一種釀酒酵母新激酶Spk1磷酸化蛋白上的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸，Mol.CellBiol.11，987-1001(1991)。20.Kaouass，M.，等，在釀酒酵母中進(jìn)行高親和性亞精胺轉(zhuǎn)運(yùn)需要編碼推定的Ser/Thr蛋白激酶的STK2基因，Mol.CellBiol.17，2994-3004(1997)。21.Barral，Y.，Parra，M.，Bidlingmaier，S.，和Snyder，M.Niml相關(guān)性激酶使酵母的細(xì)胞周期進(jìn)展和外周細(xì)胞骨架形成相協(xié)調(diào)，Genes&Dev.13，176-187(1999)。22.Madden，K.，Sheu，Y.-J.，Baetz，K.，Andrews，B.，和Snyder，M.作為酵母PKC-MAP激酶途徑靶的SBF細(xì)胞周期調(diào)節(jié)物，Science275，1781-1784(1997)。23.Sobel，S.G.&Snyder，M.高度趨異的γ-微管蛋白基因是釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和正確微管組織化必須的，J.CellBiol.131，1775-1788(1995)。24.Ferrigno，P.，Posas，F(xiàn).，Koepp，D.，Saito，H.，和Silver，P.A.調(diào)節(jié)HOG1MAPK的核質(zhì)/胞質(zhì)交換需要輸入蛋白β類似物NMD5和XPO1，EMBOJ.17，5606-5614(1998)。25.Ho，U.，Mason，S.，Kobayahi，R.，Heokstra，M.，和Andrew，B.酪蛋白激酶I型異構(gòu)酶Hrr25和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子SBF在釀酒酵母中對(duì)DNA損傷的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的作用，Proc.Natl.Acad.Sci.94，581-586(1997)。26.Wurgler-Murphy，S.M.，Maeda，T.，Witten，E.A.，和Saito，H.通過(guò)PTP2和PTP3蛋白酪氨酸磷酸酶調(diào)節(jié)釀酒酵母HOG1有絲分裂原活化的蛋白激酶，Mol.CellBiol.17，1289-1297(1997)。27.Santos，T.&Hollingsworth，N.M.在酵母有絲分裂過(guò)程中與Hoplp物理性相互作用的MEK1依賴性磷蛋白R(shí)ed1p，J.Biol.Chem.274，1783-1790(1999)。28.Holly，S.P.&Blumer，K.J.PAK家族激酶在釀酒酵母細(xì)胞周期的整個(gè)過(guò)程中調(diào)節(jié)細(xì)胞和肌動(dòng)蛋白極化，J.CellBiol.147，845-856(1999)。29.Richman，T.J.，Sawyer，M.M.，和Johnson，D.I.cdc42pGTP酶在酵母中參與調(diào)節(jié)頂部各向同性開關(guān)和核分裂的G2/M形態(tài)發(fā)生關(guān)卡，J.Biol.Chem.274，16861-16870(1999)。30.Malathi，K.，Xiao，Y.，和Mitchell，A.P.酵母GSK3β/長(zhǎng)柔毛類似物Rimllp在有絲分裂活化中的催化作用，Genetics153，1145-1152(1999)。31.Owen，D.J.，Noble，M.E.，Garman，E.F.，Papageorgiou，A.C.，和Johnson，L.N.磷酸化酶激酶催化結(jié)構(gòu)域的兩種結(jié)構(gòu)與底物類似物和產(chǎn)物復(fù)合的活性蛋白激酶，Structure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gè)樣品點(diǎn)樣在一個(gè)載玻片上。將載玻片置于有蓋的干凈容器中于室溫溫育1小時(shí)。6.用10ml封閉緩沖液(100mM甘氨酸、100mMTris，pH8.0、50mMNaCl)于室溫封閉載玻片1小時(shí)。用TBS緩沖液(50mMTris，pH8.0、150mMNaCl)清洗載玻片3次，并以1500rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘至干燥。7.用HybriWellSealingSystem(Schleicher&Schuell，Germany)覆蓋在載玻片的底物表面，并將含蛋白激酶和作為標(biāo)記試劑的33P-γ-ATP的40μl激酶混合物加入到在冰上的底物中。8.將反應(yīng)物在潮濕箱中于30℃溫育30分鐘。將封條由載玻片上剝落，將載玻片浸入到含50mMEDTA的大體積PBS緩沖液中。再用相同的緩沖液于室溫清洗載玻片3×15分鐘。然后用Kimwipes干燥清洗的載玻片。9.為獲得信號(hào)，將載玻片對(duì)磷成象儀屏幕曝光，使用ImageQuant軟件分析數(shù)據(jù)。XI.引用的參考文獻(xiàn)本文引用的所有參考文獻(xiàn)都通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中，均等同于每個(gè)具體而單獨(dú)指明的單獨(dú)出版物或?qū)＠驅(qū)＠暾?qǐng)通過(guò)引用整體結(jié)合。可在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種修飾和改變，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。本文描述的具體實(shí)施方案僅僅是為了舉例說(shuō)明，本發(fā)明連同所附權(quán)利要求的等同方案的全部范圍僅受所附權(quán)利要求書的限制。權(quán)利要求1.一種定位尋址陣列，其在固體支持體上包含多種不同物質(zhì)，所述物質(zhì)選自蛋白和包含所述蛋白功能域的分子，每種不同物質(zhì)在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同物質(zhì)由至少100種不同物質(zhì)/cm2組成，其中所述多種不同物質(zhì)由全部表達(dá)蛋白或包含所述蛋白功能域的分子的至少50％構(gòu)成，所述表達(dá)蛋白或分子在生物體基因組中具有相同類型的生物活性。2.權(quán)利要求1的陣列，其中所述多種不同物質(zhì)的組成如下100-1,000種不同物質(zhì)/cm2，1,000-10,000種不同物質(zhì)/cm2，10,000-100,000種不同物質(zhì)/cm2，10,000-100,000種不同物質(zhì)/cm2或100,000-1,000,000種不同物質(zhì)/cm2。3.權(quán)利要求1的陣列，其中所述固體支持體為載玻片。4.權(quán)利要求1的陣列，其中所述固體支持體由硅氧烷彈性體物構(gòu)成。5.權(quán)利要求1的陣列，其中每種不同物質(zhì)存在于固體支持體表面的不同孔中。6.權(quán)利要求5的陣列，其中在不同孔中的每種不同物質(zhì)結(jié)合至所述固體支持體的表面。7.權(quán)利要求6的陣列，其中在不同孔中的每種不同物質(zhì)共價(jià)結(jié)合至所述固體支持體表面。8.權(quán)利要求7的陣列，其中在不同孔中的每種不同物質(zhì)都通過(guò)連接體共價(jià)結(jié)合至所述固體支持體表面。9.權(quán)利要求8的陣列，其中所述連接體為3-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷。10.權(quán)利要求6的陣列，其中在不同孔中的每種不同物質(zhì)非共價(jià)結(jié)合至所述固體支持體表面。11.權(quán)利要求6的陣列，其中在不同孔中的每種不同物質(zhì)都不結(jié)合至所述固體支持體表面。12.權(quán)利要求5的陣列，其中在不同孔中的每種不同物質(zhì)為溶液。13.權(quán)利要求5的陣列，其中每個(gè)孔都含有用于測(cè)定蛋白或分子生物活性的試劑。14.一種定位尋址陣列，其在固體支持體上包含多種不同蛋白或含所述蛋白功能域的分子，每種不同的蛋白或分子都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種蛋白或分子由在生物體基因組中具有相同類型生物活性的全部表達(dá)蛋白的至少50％構(gòu)成。15.權(quán)利要求14的陣列，其中所述多種蛋白或分子由在生物體基因組中具有相同類型生物活性的全部表達(dá)蛋白的至少75％或至少90％構(gòu)成。16.權(quán)利要求14的陣列，其中所述具有目的生物活性的表達(dá)蛋白選自激酶、磷酸酶、蛋白酶、乙?；D(zhuǎn)移酶、其它基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶、核酸結(jié)合蛋白、激素結(jié)合蛋白和DNA結(jié)合蛋白。17.權(quán)利要求14的陣列，其中所述固體支持體選自陶瓷制品、無(wú)定形碳化硅、可鑄氧化物、聚酰亞胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯和硅氧烷彈性體。18.權(quán)利要求17的陣列，其中所述固體支持體為聚二甲基硅氧烷。19.一種定位尋址陣列，其在固體支持體上包含多種物質(zhì)，所述物質(zhì)選自蛋白和包含所述蛋白功能域的分子，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同物質(zhì)通過(guò)3-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷連接體與固體支持體連接。20.一種在固體支持體表面包含多個(gè)孔的陣列，其中所述孔密度為至少100孔/cm2。21.權(quán)利要求20的陣列，其中所述孔密度為100-1,000孔/cm2，1,000-10,000孔/cm2，10,000-100,000孔/cm2，100,000-1,000,000孔/cm2或1,000,000-10,000,000孔/cm2。22.權(quán)利要求20的陣列，其中所述孔中存在多種不同物質(zhì)，這些物質(zhì)選自蛋白和包含所述蛋白功能域的分子，每種不同物質(zhì)都存在于不同孔中。23.權(quán)利要求20的陣列，其中每個(gè)孔都含有用于測(cè)定蛋白或分子生物活性的試劑。24.權(quán)利要求20的陣列，其中所述孔體積為1pl-5μl。25.權(quán)利要求24的陣列，其中所述孔體積為1nl-1μl。26.一種制備在固體支持體表面含有多個(gè)孔的定位尋址陣列的方法，該方法包括以下步驟用設(shè)計(jì)用于在固體表面產(chǎn)生100孔/cm2以上密度孔的微加工模鑄造陣列。27.一種制備在固體支持體表面含有多個(gè)孔的定位尋址陣列的方法，該方法包括以下步驟(a)用設(shè)計(jì)用于在固體表面產(chǎn)生100孔/cm2以上密度孔的微加工模鑄造副模；(b)用所述副模鑄造至少一種陣列。28.權(quán)利要求26或27的方法，其中所述陣列的鑄造還包括以下步驟(a)用液態(tài)鑄造材料覆蓋模板；(b)固化鑄造材料，直至鑄造物成為固體。29.權(quán)利要求26-28任一項(xiàng)的方法，其還包括以下步驟在固體支持體上的孔中沉積多種不同物質(zhì)，所述多種不同物質(zhì)選自蛋白和含所述蛋白功能域的分子，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同孔中。30.權(quán)利要求26-29任一項(xiàng)的方法，其中所述孔密度為100-1,000孔/cm2，1,000-10,000孔/cm2，10,000-100,000孔/cm2，100,000-1,000,000孔/cm2或1,000,000-10,000,000孔/cm2。31.權(quán)利要求26-30任一項(xiàng)的方法，其中所述陣列由硅氧烷彈性體鑄造。32.權(quán)利要求28的方法，其中所述液態(tài)鑄造材料為硅氧烷彈性體。33.一種使用權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)的定位尋址陣列的方法，所述方法包括以下步驟(a)使探針與所述陣列接觸；(b)檢測(cè)蛋白/探針的相互作用。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述探針為酶底物或抑制劑。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述探針為選自以下的酶的底物或抑制劑激酶、磷酸酶、蛋白酶、乙?；D(zhuǎn)移酶和其它基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶。36.權(quán)利要求33的方法，其中所述探針選自蛋白、寡核苷酸、多核苷酸、DNA、RNA、小分子底物、藥物侯選物、受體、抗原、類固醇、磷脂、抗體、谷胱甘肽、免疫球蛋白區(qū)、麥芽糖、鎳、二氫胰蛋白酶和生物素。37.權(quán)利要求33-36任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白/探針相互作用的檢測(cè)通過(guò)包括質(zhì)譜法的方法檢測(cè)。38.權(quán)利要求33-36任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白/探針相互作用的檢測(cè)方法包括使用化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性標(biāo)記或原子力顯微鏡法。39.一種制備及使用權(quán)利要求1的定位尋址陣列的方法，該方法包括以下步驟(a)在固體支持體上沉積多種不同物質(zhì)，所述多種不同物質(zhì)選自蛋白和包含所述蛋白功能域的分子，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種不同物質(zhì)由至少100種不同物質(zhì)/cm2組成；(b)使探針與所述陣列接觸；(c)檢測(cè)蛋白/探針的相互作用。40.一種制備及使用權(quán)利要求14的定位尋址陣列的方法，該方法包括以下步驟(a)在固體支持體上沉積多種不同蛋白或含所述蛋白功能域的分子，每種不同的蛋白或分子都在固體支持體上的不同位置，其中所述多種蛋白或分子由在生物體基因組中具有相同類型生物活性的全部表達(dá)蛋白的至少50％構(gòu)成；(b)使探針與所述陣列接觸；(c)檢測(cè)蛋白/探針的相互作用。41.權(quán)利要求39或40的方法，其中所述固體支持體為載玻片。42.一種鑒定活化淋巴細(xì)胞的抗原的方法，該方法包括以下步驟(a)使定位尋址陣列與多種淋巴細(xì)胞接觸，所述陣列在固體支持體上含有多種潛在抗原，每種不同抗原都在固體支持體上的不同位置，其中不同抗原的密度為至少100種不同抗原/cm2；(b)檢測(cè)固體支持體上發(fā)生淋巴細(xì)胞活化的位置。43.一種測(cè)定抗體制品特異性的方法，該方法包括以下步驟(a)使定位尋址陣列與抗體制品接觸，所述陣列在固體支持體上含有多種潛在抗原，每種不同抗原都在固體支持體上的不同位置，其中不同抗原的密度為至少100種不同抗原/cm2；(b)檢測(cè)在固體支持體上所述抗體制品中的抗體發(fā)生結(jié)合的位置，由此推斷所述抗體制品的特異性。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述抗體制品包括抗血清、單克隆抗體或多克隆抗體。45.權(quán)利要求43的方法，其中所述抗體制品包含F(xiàn)ab片段、嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體或合成抗體。46.權(quán)利要求43的方法，其中抗體結(jié)合如下進(jìn)行檢測(cè)使所述陣列與結(jié)合所述抗體制品抗體的熒光標(biāo)記二抗接觸；去除未結(jié)合的二抗；檢測(cè)所述陣列上的結(jié)合標(biāo)記。47.一種鑒定有絲分裂原的方法，該方法包括以下步驟(a)使定位尋址陣列與細(xì)胞群接觸；所述陣列在固體支持體上含多種不同物質(zhì)，所述多種不同物質(zhì)選自蛋白、含所述蛋白功能域的分子、完整細(xì)胞和含蛋白的細(xì)胞物質(zhì)，每種不同物質(zhì)都在固體支持體上的不同位置，其中所述不同物質(zhì)的密度為至少100種不同物質(zhì)/cm2；(b)檢測(cè)固體支持體上誘導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂活性的位置。48.一種試劑盒，該試劑盒包含(a)一種或多種權(quán)利要求1的陣列，其在固體支持體表面含有多個(gè)孔，其中所述孔密度為至少100孔/cm2；(b)在一個(gè)或多個(gè)容器中的一種或多種探針、試劑或其它分子。49.權(quán)利要求48的試劑盒，其中所述一個(gè)或多個(gè)容器包含用于測(cè)定蛋白生物活性的試劑。50.權(quán)利要求48的試劑盒，其中所述一個(gè)或多個(gè)容器包含用于測(cè)定探針和蛋白相互作用的試劑。51.一種試劑盒，該試劑盒包含(a)一種或多種權(quán)利要求1的定位尋址陣列；(b)在一個(gè)或多個(gè)容器中的一種或多種探針、試劑或其它分子。52.權(quán)利要求51的試劑盒，其中所述底物連接至所述固體支持體上的孔表面。53.權(quán)利要求51的試劑盒，其中所述蛋白或分子選自激酶、磷酸酶、蛋白酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶、核酸結(jié)合蛋白和激素結(jié)合蛋白。54.權(quán)利要求48-53任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述相同類型的生物活性選自激酶活性、磷酸酶活性、蛋白酶活性、糖苷酶活性、乙酰酶活性、基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶活性、核酸結(jié)合活性、激素結(jié)合活性和DNA結(jié)合活性。55.權(quán)利要求1-25和57-58任一項(xiàng)的陣列，其中所述相同類型的生物活性選自激酶活性、磷酸酶活性、蛋白酶活性、糖苷酶活性、乙酰酶活性、基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶活性、核酸結(jié)合活性、激素結(jié)合活性和DNA結(jié)合活性。56.權(quán)利要求40的方法，其中所述相同類型的生物活性選自激酶活性、磷酸酶活性、蛋白酶活性、糖苷酶活性、乙酰酶活性、基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶活性、核酸結(jié)合活性、激素結(jié)合活性和DNA結(jié)合活性。57.一種定位尋址蛋白陣列，其在固體支持體上包含生物體的50種不同蛋白，每種不同蛋白在固體支持體上的不同位置，其中不同蛋白在陣列上的密度為至少100種蛋白/cm2，所述蛋白具有相同的生物活性。58.權(quán)利要求57的定位尋址蛋白陣列，其中陣列包含生物體的100種不同蛋白。59.權(quán)利要求57的定位尋址蛋白陣列，其中陣列包含生物體的61種不同激酶。60.權(quán)利要求57的定位尋址蛋白陣列，其中陣列包含生物體的92種不同激酶。61.權(quán)利要求57的定位尋址蛋白陣列，其中陣列包含生物體的107種不同激酶。62.權(quán)利要求57的定位尋址蛋白陣列，其中陣列包含生物體的116種不同激酶。63.權(quán)利要求57的定位尋址蛋白陣列，其中陣列包含生物體的119種不同激酶。64.權(quán)利要求57的定位尋址蛋白陣列，其中陣列包含生物體的122種不同激酶。65.權(quán)利要求57的定位尋址蛋白陣列，其中陣列主要由生物體的50-122種不同激酶組成。66.權(quán)利要求58-65任一項(xiàng)的定位尋址陣列，其中激酶是酵母激酶。67.權(quán)利要求57的定位尋址蛋白陣列，其中陣列主要由生物體的100種激酶的一個(gè)或幾個(gè)拷貝組成。68.權(quán)利要求57的定位尋址蛋白陣列，其中陣列由生物體的基本上全部激酶的一個(gè)或幾個(gè)拷貝組成。69.權(quán)利要求68的定位尋址蛋白陣列，其中陣列包含生物體的所有激酶，所述激酶由長(zhǎng)度小于4.5kb的核酸編碼序列編碼。70.權(quán)利要求68的定位尋址蛋白陣列，其中陣列包含生物體的所有激酶，所述激酶由適當(dāng)長(zhǎng)度的核酸編碼序列編碼，使得激酶可以由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。71.權(quán)利要求57的定位尋址蛋白陣列，其中陣列上的大多數(shù)激酶具有激酶活性。72.權(quán)利要求57的定位尋址蛋白陣列，其中檢測(cè)激酶活性的試劑與陣列接觸。73.權(quán)利要求65-68任一項(xiàng)的方法，其中定位尋址陣列包含生物體的50種激酶。74.權(quán)利要求65-68任一項(xiàng)的方法，其中定位尋址陣列包含生物體的100種激酶。75.權(quán)利要求65-68任一項(xiàng)的方法，其中定位尋址陣列包含生物體的119種激酶。76.權(quán)利要求65-68任一項(xiàng)的方法，其中定位尋址陣列包含生物體的122種激酶。77.權(quán)利要求65-68任一項(xiàng)的方法，其中定位尋址陣列包含生物體的基本上全部激酶。78.權(quán)利要求65-68任一項(xiàng)的方法，其中定位尋址陣列包含生物體的所有激酶，所述激酶由長(zhǎng)度小于4.5kb的核酸編碼序列編碼。79.權(quán)利要求65-68任一項(xiàng)的方法，其中蛋白/探針相互作用通過(guò)檢測(cè)酶促活性來(lái)檢測(cè)。80.權(quán)利要求79的方法，其中酶促活性是激酶活性。81.權(quán)利要求1的定位尋址陣列，其中陣列包含生物體的50種蛋白，所述蛋白具有相同類型的生物活性。82.權(quán)利要求1的定位尋址陣列，其中陣列包含生物體的100種蛋白，所述蛋白具有相同類型的生物活性。83.權(quán)利要求1的定位尋址陣列，其中陣列包含生物體的100種激酶。84.權(quán)利要求1的定位尋址陣列，其中陣列包含生物體的119種激酶。85.權(quán)利要求81-84的定位尋址陣列，其中激酶是酵母激酶。86.權(quán)利要求57的定位尋址陣列，其中不同蛋白在陣列上的密度是至少100種蛋白/cm2。87.權(quán)利要求57的定位尋址陣列，其中不同蛋白在陣列上的密度是至少400種蛋白/cm2。88.權(quán)利要求57的定位尋址陣列，其中不同蛋白在陣列上的密度是至少1000種蛋白/cm2。全文摘要本發(fā)明涉及用于大規(guī)模研究蛋白功能的蛋白芯片，其中所述芯片包含密集反應(yīng)孔。本發(fā)明還涉及使用蛋白芯片同時(shí)測(cè)定蛋白樣品中或一個(gè)蛋白芯片上蛋白的有無(wú)、多少和/或功能的方法，或者使用蛋白芯片測(cè)定該芯片上每種蛋白的探針混合物中每種探針的存在與否、相對(duì)特異性和結(jié)合親和性的方法。本發(fā)明還涉及使用蛋白芯片進(jìn)行高密度微量化學(xué)反應(yīng)的方法。此外，本發(fā)明還涉及用作蛋白芯片支持物的聚合物和蛋白芯片的制備方法。本發(fā)明還涉及用于衍化蛋白芯片支持物的化合物。文檔編號(hào)G01N33/566GK1654956SQ200510009560公開日2005年8月17日申請(qǐng)日期2001年5月4日優(yōu)先權(quán)日2000年5月4日發(fā)明者M(jìn)·斯尼德爾,M·雷德,H·朱,J·F·克勒米克申請(qǐng)人:耶魯大學(xué)