專利名稱：高通量蛋白質(zhì)多維陣列色譜分離系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是高通量蛋白質(zhì)多維陣列色譜分離系統(tǒng)，及運用該系統(tǒng)的分離方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)組學(xué)是目前科學(xué)研究最熱點領(lǐng)域之一。其研究實質(zhì)是在細胞水平上對蛋白質(zhì)進行大規(guī)模的分離和分析。與靜態(tài)的基因組不同，蛋白質(zhì)有著復(fù)雜的翻譯后修飾，在細胞內(nèi)的表達是多樣的、動態(tài)的。由于蛋白質(zhì)組樣品的高度復(fù)雜性，蛋白質(zhì)組學(xué)的興起和發(fā)展對現(xiàn)有的分析技術(shù)提出了新的需求和挑戰(zhàn)。發(fā)展高通量、高分離能力的技術(shù)平臺成為當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的瓶頸。
當(dāng)前國際上蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)是雙向凝膠電泳—質(zhì)譜技術(shù)。盡管雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組分離最常用的工具，但此技術(shù)本身在分析通量、靈敏度、分辨率以及自動化程度上還存在許多局限，難以滿足大規(guī)模進行蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需要。研究可替代或補充雙向凝膠電泳的新技術(shù)成為發(fā)展蛋白質(zhì)組研究技術(shù)的主要目標(biāo)。國內(nèi)外在這方面開展了許多探索性工作，多種分離方法得到廣泛應(yīng)用和發(fā)展，如高效液相色譜，毛細管電泳及多維液相色譜等。由于蛋白質(zhì)組樣品的高度復(fù)雜性，二維乃至多維分離聯(lián)用技術(shù)與質(zhì)譜鑒定技術(shù)的結(jié)合被普遍認為是最具潛力的蛋白質(zhì)組研究技術(shù)，在蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域得到廣泛的關(guān)注和重視。
目前國內(nèi)外在蛋白質(zhì)的色譜高效分離方面只限于單通道一維和二維色譜系統(tǒng)的研究，多通道多維色譜分離系統(tǒng)(多于4個通道)尚無報道。盡管二維色譜系統(tǒng)在去年已有商品化的儀器推出，但其在分析通量上還存在極大的限制，一個樣品需多次(多鹽度梯度和反相梯度)的洗脫循環(huán)，使分析時間大大延長，一般分析一個經(jīng)預(yù)分級處理簡化的蛋白質(zhì)組樣品需2-3天。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是獲得一種高通量蛋白質(zhì)多維陣列色譜分離系統(tǒng)。
本發(fā)明的目的是獲得用上述系統(tǒng)進行高通量蛋白質(zhì)多維陣列色譜分離的方法。
本發(fā)明的分析系統(tǒng)用如下方式實現(xiàn)
系統(tǒng)由并行陣列色譜柱(1)、單一色譜柱(4)和多通道點樣裝置構(gòu)成，其特征是陣列色譜柱(1)通過多通道色譜連接口(5)與單一色譜柱(4)連接，陣列色譜柱尾均有柱開關(guān)(6)，色譜泵I(3)、單一色譜柱(4)、多通道色譜連接口(5)、色譜泵II(8)依次串連連接，以上構(gòu)成系統(tǒng)的多維色譜陣列分離部分；微型三通混合室(10)、注射泵(9)、點樣毛細管(2)、點樣板(11)和三維自動移動平臺(12)構(gòu)成系統(tǒng)的多通道點樣裝置，微型三通混合室上(15)、下(17)兩端口分別與陣列色譜柱柱出口和點樣毛細管(2)連接，側(cè)端口(16)與輸送基質(zhì)溶液的注射泵(9)連接，微型三通混合室(15)與陣列柱一一對應(yīng)，點樣毛細管(2)下是點樣板(11)，點樣板置于三維自動移動平臺(12)上，上述各部件集成于一體。
待測樣品首先在單一色譜柱(4)上洗脫，洗脫流出物通過多通道色譜連接口(5)運用陣列柱開關(guān)(6)被逐柱依次富集至陣列色譜柱的各柱頭(7)上，陣列色譜柱通過色譜泵II(8)進行色譜洗脫，與此同時通過多通道點樣裝置，色譜陣列各通道的洗脫流出物分別與基質(zhì)溶液通過注射泵(9)在相應(yīng)的微型三通混合室(10)內(nèi)在線混合，洗脫物與基質(zhì)混合物按設(shè)定間距被離散地點在點樣板(11)上，樣品供基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜檢測。
因此本發(fā)明分析系統(tǒng)由兩維色譜構(gòu)成，第一維色譜分離利用一根色譜柱，可采用離子交換(或體積排阻)色譜柱；第二維色譜分離利用多根色譜柱(多至50根)，可采用反相色譜柱。兩分離系統(tǒng)通過多通道并行式多維色譜接口連接。
第一維分離通過離子交換(或體積排阻)色譜快速實現(xiàn)(每個組分只需幾分鐘)，洗脫組分經(jīng)多通道色譜接口或多位閥被切換順次分別富集在第二維色譜陣列反相柱的柱頭或富集柱上，此多個洗脫組分在第二維的分離通過并行色譜的方式一次洗脫完成。此兩維陣列色譜系統(tǒng)的分析通量可表示為分析通量(2D-LC array)＝N1DfractionxT1D+1xT2D，而通常的單通道兩維色譜系統(tǒng)的分析通量為分析通量(2D-LC)＝N1DfractionxT1D+ N1DfractionxT2D，(N為樣品經(jīng)第一維洗脫所分的組數(shù)，通常N＝2-50；T1D為第一維的洗脫時間，一般為幾分鐘；T2D為第二維的洗脫時間，一般為1-3小時)，由此可見，運用陣列色譜作為系統(tǒng)的第二維可極大地提高系統(tǒng)的樣品分析通量。第二維多通道陣列色譜洗脫的流出組分通過微型點樣系統(tǒng)被收集在MALDI板上進行TOF/TOF或Q/TOF質(zhì)譜鑒定。
與陣列色譜柱相應(yīng)的微型三通混合室陣列，點樣毛細管陣列，毛細管固定夾，輸送基質(zhì)毛細管陣列構(gòu)成系統(tǒng)的微型點樣部分。微型三通混合室陣列由與陣列色譜柱相應(yīng)的微體積混合室構(gòu)成，每個微體積混合室有三個端口上端口、下端口和側(cè)端口。每個上端口分別和第二維色譜柱連接，下端口分別和點樣毛細管連接，側(cè)端口和基質(zhì)輸送泵連接。毛細管固定夾內(nèi)刻有等間距的槽道，用來固定點樣毛細管陣列。
本發(fā)明中，陣列色譜柱柱頭連有富集柱(14)，柱開關(guān)(6)連接在富集柱尾。
本發(fā)明中，并行陣列色譜柱是2-50根色譜柱。
本發(fā)明中，陣列色譜柱(1)通過多位閥(13)與單一色譜柱(4)連接。
本發(fā)明中，單一色譜柱洗脫液富集后并行陣列色譜柱是同時進行色譜洗脫。
本發(fā)明中，切換至陣列色譜柱的洗脫流出物富集在各富集柱上(14)。
本發(fā)明中，系統(tǒng)與基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜聯(lián)用。
本發(fā)明獲得了如下良好效果多個通道同時進行第二維色譜分離，實現(xiàn)了超高分析通量，運用多通道并行式多維色譜接口，使系統(tǒng)獲得了多維切換技術(shù)，并使多個色譜柱能同時分離，將多維分離流份通過點樣機轉(zhuǎn)移至MALDI板上進行TOF/TOF或Q/TOF質(zhì)譜鑒定，可實現(xiàn)蛋白質(zhì)高通量、快速、高效分析。
本發(fā)明用色譜-色譜為主的分離平臺，充分發(fā)揮色譜分離能力強、分離模式多，易于與質(zhì)譜鑒定方式聯(lián)用、易于自動化等優(yōu)勢，構(gòu)建基于多維高效色譜分離的陣列蛋白質(zhì)組多維分離技術(shù)平臺，使蛋白質(zhì)組技術(shù)平臺在分離效率和分析通量上有大幅度的提高。目前用2D-gel分析一個樣品至少需幾天時間，單通道2D-LC需幾十個小時。由于二維LC分離平臺的分辨率和分析通量主要由第二維的分離決定，在第二維采用多個通道同時進行分析，可極大地提高整個系統(tǒng)的分析通量。另外用兩列色譜柱交替進行洗脫，會有更充足的時間進行第二維梯度分離，從而進一步提高2D-LC的分辨率。用多個通道構(gòu)建的陣列多維平臺，其分析通量同剛商品化的單通道2D-LC比，將會有十幾倍乃至幾十倍的提高，突破蛋白質(zhì)/肽的分析在分辨率，靈敏度，特別是分析通量等方面的局限性，為蛋白質(zhì)組的研究提供更加有效的技術(shù)手段，從而進一步促進此領(lǐng)域的研究進程。


圖1是本發(fā)明分析系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是本發(fā)明系統(tǒng)運用多位閥13、富集柱14的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3是本發(fā)明多通道色譜陣列接口圖。
圖4是本發(fā)明微型三通混合室結(jié)構(gòu)圖。
上述圖中1是陣列色譜柱，2是點樣毛細管，3是色譜泵I，4是單一色譜柱，5是多通道接口，6是柱開關(guān)，7是陣列色譜柱的柱頭，8是色譜泵II，9是注射泵，10是微型三通混合室，11是點樣板，12是三維自動移動平臺，13是多位閥，14是富集柱，15、17分別是微型三通混合室上、下兩端口，16是水平端口。
具體實施例方式
一.高通量蛋白質(zhì)多維陣列色譜分離系統(tǒng)的建立1.多通道色譜接口的制作取一長5cm內(nèi)徑為500μm的聚醚醚酮(PEEK)毛細管，在PEEK毛細管的一側(cè)用380μm的鉆頭鉆出直徑為380μm的小孔30個，孔與孔的間距為1mm，洗去PEEK管內(nèi)的碎屑并用氮氣將其吹干。順著PEEK毛細管插入一根外徑為480μm的石英毛細管，將30根長5cm外徑為380μm的石英毛細管(75μm i.d.；380μm o.d.)分別插入小孔內(nèi)與內(nèi)置毛細管相抵，抽取出PEEK中心通道的內(nèi)置毛細管，隨后在石英毛細管與PEEK毛細管相交處的四周用膠固定，如圖3。
2.多通道點樣裝置的制作多通道點樣裝置由三通微體積混合室陣列，點樣毛細管陣列，毛細管固定夾，輸送基質(zhì)毛細管陣列構(gòu)成。微體積混合室陣列由30個微體積混合室構(gòu)成，微體積混合室結(jié)構(gòu)如圖4所示。
3.陣列式兩維色譜分離系統(tǒng)的建立第一維用一根離子交換色譜柱(3cm×320μm)，分別與進樣器和多通道色譜接口的PEEK管出口的一端相連，如圖2所示。多通道色譜接口的PEEK管出口的另一端與梯度泵相連，接口上石英毛細管的出口分別與反相色譜柱相連(250μm i.d×25cm，5μm，C8)；色譜陣列的出口分別與PEEK開關(guān)相連，以一石英毛細管將開關(guān)的下出口與微體積混合室陣列的上入口相連。10個水平通道分別與10個注射泵相連(或通過分流裝置與一個注射泵連接)。將多通道點樣系統(tǒng)置于自動點樣機(或自動三維移動平臺)的上方10cm，MALDI樣品板放置在三維移動平臺上。
二.用所建高通量蛋白質(zhì)多維陣列色譜分離系統(tǒng)進行蛋白質(zhì)組樣品分析細胞或組織的全蛋白質(zhì)提取液于100℃水浴加熱變性。降至室溫，以胰蛋白酶酶解。
所建兩維色譜陣列分離系統(tǒng)平衡后，將色譜陣列中的一根色譜柱(柱1)的柱后開關(guān)旋開，其它關(guān)閉。將水解的蛋白酶解肽段混合物經(jīng)進樣器全部載入兩維色譜陣列分離系統(tǒng)中第一維離子交換色譜柱上(SCX，320μm i.d×3cm)，用色譜泵1以5％ACN/0.1％TFA為流動相，3μl/min的流量洗脫，洗脫下的肽段組分被轉(zhuǎn)移至柱1并富集在柱頭。關(guān)閉柱1柱后開關(guān)，打開柱2開關(guān)，用進樣器進10mM醋酸銨溶液，此鹽溶液洗脫下來的肽段組份經(jīng)兩維接口被富集在柱2柱頭。如上相同操作分別將50，100，150，200，250，300，500和1000mM醋酸銨洗脫的肽組分富集在反相柱3-10的柱頭。隨后關(guān)閉色譜泵1，將所有柱后開關(guān)打開，觸發(fā)色譜泵2，用流動相(流動相A5％ACN/0.1％TFA和流動相B80％ACN/0.1％TFA)洗脫色譜陣列。
注射泵(LC Packing，Amsterdam，The Netherlands)和微體積混合室陣列通過10通路的分流器連接。在色譜陣列洗脫的同時，基質(zhì)溶液通過注射泵被分別輸入各混合室內(nèi)。色譜陣列洗脫的流出物與基質(zhì)溶液在混合室內(nèi)混合，混合物以設(shè)置的時間間隔被自動點在MALDI樣品板上。
最后用AB 4700 Proteomics Analyzer對每個樣品點進行MALDI/MS和MALDI/MS/MS的測定。用GPS軟件對所得全部MS/MS數(shù)據(jù)進行處理，并在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫內(nèi)進行搜索，從而得到蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種高通量蛋白質(zhì)多維陣列色譜分離系統(tǒng)，系統(tǒng)由并行陣列色譜柱(1)、單一色譜柱(4)和多通道點樣裝置構(gòu)成，其特征是陣列色譜柱(1)通過多通道色譜連接口(5)與單一色譜柱(4)連接，陣列色譜柱尾均有柱開關(guān)(6)，色譜泵I(3)、單一色譜柱(4)、多通道色譜連接口(5)、色譜泵II(8)依次串連連接，以上構(gòu)成系統(tǒng)的多維色譜陣列分離部分；微型三通混合室(10)、注射泵(9)、點樣毛細管(2)、點樣板(11)和三維自動移動平臺(12)構(gòu)成系統(tǒng)的多通道點樣裝置，微型三通混合室上(15)、下(17)兩端口分別與陣列色譜柱柱出口和點樣毛細管(2)連接，側(cè)端口(16)與輸送基質(zhì)溶液的注射泵(9)連接，微型三通混合室(15)與陣列柱一一對應(yīng)，點樣毛細管(2)下是點樣板(11)，點樣板置于三維自動移動平臺(12)上，上述各部件集成于一體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量多維陣列色譜分離系統(tǒng)的分離方法，其特征是待測樣品首先在單一色譜柱(4)上洗脫，洗脫流出物通過多通道色譜連接口(5)運用陣列柱開關(guān)(6)被逐柱依次富集至陣列色譜柱的各柱頭(7)上，陣列色譜柱通過色譜泵II(8)進行色譜洗脫，與此同時通過多通道點樣裝置，色譜陣列各通道的洗脫流出物分別與基質(zhì)溶液通過注射泵(9)在相應(yīng)的微型三通混合室(10)內(nèi)在線混合，洗脫物與基質(zhì)混合物按設(shè)定間距被離散地點在點樣一板(11)上，樣品供基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量多維陣列色譜分離系統(tǒng)，其特征是陣列色譜柱柱頭連有富集柱(14)，柱開關(guān)(6)連接在富集柱尾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量蛋白質(zhì)多維陣列色譜分離系統(tǒng)，其特征是并行陣列色譜柱是2-50根色譜柱。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量蛋白質(zhì)多維陣列色譜分離系統(tǒng)，其特征是陣列色譜柱(1)通過多位閥(13)與單一色譜柱(4)連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高通量蛋白質(zhì)多維陣列色譜分離系統(tǒng)的分離方法，其特征是并行陣列色譜柱是同時進行色譜洗脫。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高通量蛋白質(zhì)多維陣列色譜分離系統(tǒng)的分離方法，其特征是切換至陣列色譜柱的洗脫流出物富集在各富集柱上(14)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高通量蛋白質(zhì)多維陣列色譜分離系統(tǒng)，其特征是該系統(tǒng)與基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜聯(lián)用。
全文摘要
本發(fā)明是一種高通量蛋白質(zhì)多維陣列色譜分離系統(tǒng)?，F(xiàn)有技術(shù)僅限于單通道一維或兩維色譜方法用于蛋白質(zhì)組的色譜分析，存在分析周期長、操作復(fù)雜等不足。本發(fā)明在第一維色譜分離的基礎(chǔ)上，將多通道色譜陣列用于色譜分離第二維的方法，使分析效率得到很大提高。多通道色譜陣列可擴展2－50個色譜通道，通過多通道接口與第一維色譜連接，可高效完成逐柱富集、梯度洗脫的分離過程，為蛋白質(zhì)組樣品分析提供了有效手段。本發(fā)明方法所用各部件集成于一體，并與基質(zhì)輔助激光電離質(zhì)譜聯(lián)用，可實現(xiàn)自動化的蛋白質(zhì)組色－質(zhì)儀。
文檔編號G01N30/46GK1563977SQ20041001703
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月18日
發(fā)明者張祥民, 劉春麗 申請人:復(fù)旦大學(xué)