專利名稱：以膠體晶體為模板的蛋白質(zhì)傳感敏感膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種高效、高密度蛋白質(zhì)傳感敏感膜的制備方法，特別是作為一種免疫傳感器，以提高抗體在固相表面反應(yīng)的有效性的高密度蛋白質(zhì)微陣列及其制備方法。
背景技術(shù)：
人類基因組計劃(HGP)的提前完成是科學(xué)發(fā)展史上的重要里程碑，它標志著人類對自身的認識上升到了一個新的層次。然而基因芯片雖然可以在mRNA水平上分析整個基因組的表達情況，并得到了迅猛發(fā)展，但是生命活動的主體是人體內(nèi)存在的10萬種以上的蛋白質(zhì)-幾乎所有的生化反應(yīng)都發(fā)生在復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子之間，因此發(fā)展包括蛋白質(zhì)芯片在內(nèi)的高效蛋白質(zhì)傳感器件已經(jīng)成為蛋白組學(xué)領(lǐng)域的挑戰(zhàn)性課題。基于蛋白質(zhì)的傳感器件主要通過物理吸附或者共價交聯(lián)的方式來制備蛋白質(zhì)敏感膜。然而目前為止基于蛋白質(zhì)的固定技術(shù)的傳感技術(shù)仍然存在諸多問題。如蛋白的吸附變性問題、蛋白的堆積問題使得通過常規(guī)的蛋白固定所獲得的傳感器的效率低下，其所固定的傳感蛋白分子能夠發(fā)揮作用的占總的固定量的比例不足百分之五，這使得一方面非常難以獲得的蛋白分子常常被浪費在無用的蛋白堆積或者變性上，而另一方面由于蛋白堆積及變性使得只有極少量的蛋白質(zhì)能夠用于蛋白傳感，所以傳感的靈敏度大大下降，由此帶來的高成本及靈敏度低的問題在很大程度上限制了蛋白傳感器的應(yīng)用范圍。導(dǎo)致蛋白堆積失效的主要原因是蛋白通常通過其特定的功能位點發(fā)揮作用，而目前常用的通過物理吸附或者共價交聯(lián)的蛋白質(zhì)常常會由于變性或者密度過高而將蛋白質(zhì)的功能位點包埋或者阻擋，從而使蛋白質(zhì)材料失去功效。對于這個問題，人們主要寄希望于通過取向性固定蛋白質(zhì)材料的方法來解決，然而研究表明取向性蛋白的固定與非取向性蛋白的固定在蛋白傳感器件上的表現(xiàn)并沒有明顯的差異，這可能主要由于蛋白的固定仍然高密度過高的，因此非頂端的蛋白傳感位點仍然被包埋或者阻擋，結(jié)果大部分蛋白材料仍然不能發(fā)揮作用。
另外一種可能的解決辦法是疏散蛋白材料的固定位點，從而降低固定密度，再結(jié)合取向蛋白固定技術(shù)，從而盡最大可能減少蛋白間的重疊、包埋與阻擋。然而蛋白的大小一般在幾納米至一百多納米，特別地免疫蛋白及親和素等絕大多數(shù)蛋白材料其大小在幾十納米以下，通過常規(guī)的微電子刻蝕技術(shù)難以達到這樣的精度，結(jié)果人們由于不能精確控制蛋白的固定間隔使得相應(yīng)的實驗不能有效地實現(xiàn)預(yù)期的目的，因此蛋白材料的固定中所存在的重疊、包埋與阻擋仍然是蛋白傳感器件中尚未解決的問題。
膠體晶體是一種膠體晶體，它是一種由大小均一的單分散的球形粒子的(粒子的直徑一般在幾納米到幾百納米之間，粒徑的分散度要求在5％以內(nèi))顆粒所構(gòu)成的如晶體一樣的有序結(jié)構(gòu)材料。自從上個世紀八十年代被加拿大與美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)以來，膠體晶體由于其在包括信息傳輸?shù)阮I(lǐng)域的重要的潛在應(yīng)用價值，從而引起了人們的廣泛關(guān)注。目前在膠體晶體的制備及應(yīng)用研究方面人們已經(jīng)取得了長足的進展，開發(fā)了多種膠體晶體制備方法并將其應(yīng)用于傳感、自然刻蝕、光信息存儲等領(lǐng)域。本發(fā)明以數(shù)納米至數(shù)百納米的膠體晶體為模板，一方面利用膠體晶體便捷且能夠大范圍制備的特點，另一方面利用顆粒與基體界面接觸的較小區(qū)域及基體上顆粒間較大空白區(qū)域可以依次選擇性處理的特點將蛋白材料固定在膠體晶體顆粒與基體界面接觸的位置而將接觸點之外的周圍區(qū)域作為空間間隔，從而使得單個固定點固定的蛋白盡可能減少甚至消除蛋白之間的重疊、包埋與阻擋最終提高蛋白材料的使用效率及蛋白傳感器件的傳感功能。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種以膠體晶體為模板的蛋白質(zhì)敏感膜的制備方法，該方法防止固定的蛋白之間的重疊、包埋與阻擋以提高蛋白傳感敏感膜上有效蛋白質(zhì)分子的密度及數(shù)量，從而使提高蛋白質(zhì)傳感器件的靈敏度并降低生產(chǎn)成本。
技術(shù)方案本發(fā)明的以膠體晶體為模板的蛋白質(zhì)傳感敏感膜的制備方法在于，蛋白傳感敏感膜位于基片1上，基片1上非蛋白連接部位為無偶聯(lián)功能的弱蛋白吸附材料3，基片上蛋白連接部位為具偶聯(lián)功能的試劑4，基片1上蛋白5點之間的距離約等于膠體晶體中微球2的粒徑，其特征在于制備的方法為1)、首先選取蛋白傳感敏感膜的支持基片，2)、據(jù)基片及單分散顆粒的性質(zhì)選用甩膜法、LB膜法(單分子膜)、提拉法或者溶劑揮發(fā)法在基片上制備膠體晶體，單分散微球粒徑為20納米～100微米，3)、通過硅烷偶聯(lián)劑、鈦酸酯偶聯(lián)劑、鋁酸酯偶聯(lián)劑等偶聯(lián)試劑在玻璃片、硅片、金屬材料片上進行偶聯(lián)反應(yīng)或者反應(yīng)單體在高分子材料片上接枝反應(yīng)來將載有膠體晶體的基片上未接觸膠體晶體的部分連接無偶聯(lián)功能的弱蛋白吸附材料，4)、通過超聲、清洗、機械剝離等物理方法及溶解、分解等化學(xué)方法將基片上膠體晶體顆粒去除，5)、通過硅烷偶聯(lián)劑、鈦酸酯偶聯(lián)劑、鋁酸酯偶聯(lián)劑等偶聯(lián)試劑在玻璃片、硅片、金屬材料片上進行偶聯(lián)反應(yīng)或者反應(yīng)單體在高分子材料片上接枝反應(yīng)來將基片上原先與膠體晶體接觸部分連接具偶聯(lián)功能的蛋白固定材料，6)、需要固定的蛋白分子通過具偶聯(lián)功能的蛋白固定材料固定在基片上，7)、洗去除未偶聯(lián)固定的蛋白分子即可獲得基于膠體晶體模板的蛋白傳感敏感膜。
以膠體晶體為模板蛋白質(zhì)傳感敏感膜的基片包括玻璃、硅片、金屬、陶瓷、高分子材料。制作膠體晶體的單分散微球包括有機微球以及無機微球。
有益效果在本方法中，我們通過在選取的基片表面沉積膠體晶體，并以膠體晶體與基片接觸的部分固定蛋白分子而以膠體晶體與基片未接觸部分作為固定蛋白分子之間的空間間隔來制備蛋白傳感敏感膜。本方法簡單可行，成本低廉，大大提高了蛋白傳感敏感膜的蛋白質(zhì)分子的使用效率、反應(yīng)速度及靈敏度。
該方法利用膠體晶體的周期性結(jié)構(gòu)來控制固相表面蛋白質(zhì)分子的間距，并以膠體晶體與基體界面接觸位置固定蛋白質(zhì)分子，而以膠體晶體與基體未接觸的位置為空間間隔，從而防止固定的蛋白之間的重疊、包埋與阻擋以提高蛋白傳感敏感膜上有效蛋白質(zhì)分子的密度及數(shù)量，從而使提高蛋白質(zhì)傳感器件的靈敏度并降低生產(chǎn)成本。


圖1是以膠體晶體為模板蛋白質(zhì)敏感膜的俯視示意圖。
圖2是膠體晶體單分散微球在基片表面的排列的示意圖。
圖3是去除膠體晶體后無偶聯(lián)官能團偶聯(lián)試劑分子的排列的示意圖。
圖4是通過膠體晶體模板在基片上交替連接無偶聯(lián)功能的偶聯(lián)試劑、具偶聯(lián)功能的偶聯(lián)試劑及蛋白敏感材料后的效果圖。
以上的圖中有基片1、微球2、弱蛋白吸附材料3、具偶聯(lián)功能的試劑4、蛋白5。
具體實施例方式
本發(fā)明所述的以膠體晶體為模板的蛋白質(zhì)敏感膜的制備包括如下步驟首先選取蛋白傳感敏感膜的支持基片。蛋白傳感敏感膜的支持基片可以根據(jù)需要選用玻璃片、高分子材料片、硅片、金屬材料片。
根據(jù)基片及單分散顆粒的性質(zhì)選用甩膜法、LB膜法(單分子膜)、提拉法或者溶劑揮發(fā)法在基片上制備膠體晶體。
通過硅烷偶聯(lián)劑、鈦酸酯偶聯(lián)劑、鋁酸酯偶聯(lián)劑等偶聯(lián)試劑在玻璃片、硅片、金屬材料片上進行偶聯(lián)反應(yīng)或者反應(yīng)單體在高分子材料片上接枝反應(yīng)來將載有膠體晶體的基片上未接觸膠體晶體的部分連接無偶聯(lián)功能的弱蛋白吸附材料。
通過超聲、清洗、機械剝離等物理方法及溶解、分解等化學(xué)方法將基片上膠體晶體顆粒去除。
通過硅烷偶聯(lián)劑、鈦酸酯偶聯(lián)劑、鋁酸酯偶聯(lián)劑等偶聯(lián)試劑在玻璃片、硅片、金屬材料片上進行偶聯(lián)反應(yīng)或者反應(yīng)單體在高分子材料片上接枝反應(yīng)來將基片上原先與膠體晶體接觸部分連接具偶聯(lián)功能的蛋白固定材料。
將需要固定的蛋白分子通過具偶聯(lián)功能的蛋白固定材料固定在基片上。
清洗去除未偶聯(lián)固定的蛋白分子即可獲得基于膠體晶體模板的蛋白傳感敏感膜。
蛋白傳感敏感膜位于基片1上，基片1上非蛋白連接部位為無偶聯(lián)功能的弱蛋白吸附材料3，基片上蛋白連接部位為具偶聯(lián)功能的試劑4，基片1上蛋白5點之間的距離約等于膠體晶體中微球2的粒徑，
實施例1將5％重量/體積比的20納米二氧化硅單分散微球通過甩膜法在硅片上制備二氧化硅膠體晶體膜。將載有二氧化硅膠體晶體的硅片通過真空氣相沉積縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷。在蒸餾水中通過超聲去除二氧化硅膠體晶體顆粒，清洗、干燥后，浸泡于1％氨丙基三乙氧基硅烷水溶液中2小時后，蒸餾水清洗、干燥后浸泡于10微克/毫升的乙肝抗體溶液中，37度反應(yīng)2小時后清洗，干燥后即得到具有乙肝免疫響應(yīng)應(yīng)答的免疫敏感膜。
實施例2將玻璃片浸泡于1％氨丙基三乙氧基硅烷水溶液中2小時后，蒸餾水清洗、干燥后，涂覆1％瓊脂糖水溶液，干燥后，通過提拉法在瓊脂糖薄膜上沉積一層30納米二氧化硅單分散微球后，置于20mM高碘酸鈉溶液中反應(yīng)30分鐘并清洗后，接枝聚乙二醇，然后清洗去除二氧化硅顆粒并再次浸泡于20mM高碘酸鈉溶液中反應(yīng)30分鐘并清洗后，浸泡于10微克/毫升的葡萄糖氧化酶溶液中，37度反應(yīng)2小時后清洗，干燥后即得到具有對葡萄糖濃度具響應(yīng)應(yīng)答的蛋白敏感膜。
權(quán)利要求
1.一種以膠體晶體為模板的蛋白質(zhì)傳感敏感膜的制備方法，其特征在于蛋白傳感敏感膜位于基片(1)上，基片(1)上非蛋白連接部位為無偶聯(lián)功能的弱蛋白吸附材料(3)，基片上蛋白連接部位為具偶聯(lián)功能的試劑(4)，基片(1)上蛋白(5)點之間的距離約等于膠體晶體中微球(2)的粒徑，其制備的步驟為1)、首先選取蛋白傳感敏感膜的支持基片，2)、據(jù)基片及單分散顆粒的性質(zhì)選用甩膜法、LB膜法、提拉法或者溶劑揮發(fā)法在基片上制備膠體晶體，單分散微球粒徑為20納米～100微米，3)、通過硅烷偶聯(lián)劑、鈦酸酯偶聯(lián)劑、鋁酸酯偶聯(lián)劑等偶聯(lián)試劑在玻璃片、硅片、金屬材料片上進行偶聯(lián)反應(yīng)或者反應(yīng)單體在高分子材料片上接枝反應(yīng)來將載有膠體晶體的基片上未接觸膠體晶體的部分連接無偶聯(lián)功能的弱蛋白吸附材料，4)、通過超聲、清洗、機械剝離等物理方法及溶解、分解等化學(xué)方法將基片上膠體晶體顆粒去除，5)、通過硅烷偶聯(lián)劑、鈦酸酯偶聯(lián)劑、鋁酸酯偶聯(lián)劑等偶聯(lián)試劑在玻璃片、硅片、金屬材料片上進行偶聯(lián)反應(yīng)或者反應(yīng)單體在高分子材料片上接枝反應(yīng)來將基片上原先與膠體晶體接觸部分連接具偶聯(lián)功能的蛋白固定材料，6)、需要固定的蛋白分子通過具偶聯(lián)功能的蛋白固定材料固定在基片上，7)、洗去除未偶聯(lián)固定的蛋白分子即可獲得基于膠體晶體模板的蛋白傳感敏感膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以膠體晶體為模板的蛋白質(zhì)傳感敏感膜其特征在于以膠體晶體為模板蛋白質(zhì)傳感敏感膜的基片(1)包括玻璃、硅片、金屬、陶瓷、高分子材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以膠體晶體為模板的蛋白質(zhì)傳感敏感膜的制備方法，其特征在于制作膠體晶體的單分散微球包括有機微球以及無機微球。
全文摘要
以膠體晶體為模板的蛋白質(zhì)傳感敏感膜的制備方法是利用膠體晶體的周期性結(jié)構(gòu)來控制固相表面蛋白質(zhì)分子的間距，并以膠體晶體與基體界面接觸的小面積位置固定蛋白質(zhì)分子，而以膠體晶體與基體未接觸的相對大面積位置為空間間隔，從而防止固定的蛋白之間的重疊、包埋與阻擋以提高蛋白傳感敏感膜上有效蛋白質(zhì)分子的密度及數(shù)量，從而使提高蛋白質(zhì)傳感器件的靈敏度并降低生產(chǎn)成本。蛋白傳感敏感膜位于基片(1)上，基片(1)上非蛋白連接部位為無偶聯(lián)功能的弱蛋白吸附材料(3)，基片上蛋白連接部位為具偶聯(lián)功能的試劑(4)，基片(1)上蛋白(5)點之間的距離約等于膠體晶體中微球(2)的粒徑。
文檔編號G01N33/544GK1700002SQ200510040468
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月10日
發(fā)明者張繼中, 顧忠澤, 趙祥偉, 陸祖宏 申請人:東南大學(xué)