專利名稱：頭花蓼及其提取物和制品生物活性測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域中的中藥生物活性定性定量測定方法，具體而言，本發(fā)明涉及一種用生物檢定法測定頭花蓼及其提取物生物和制品活性的方法。
生物檢定法是利用藥物對生物體的作用以測定其效價或生物活性的方法，它以藥物的藥理作用為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、通過供試品和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吩谝欢l件下比較產(chǎn)生特定生物反應(yīng)的劑量關(guān)系，來測得供試品的效價。在一定范圍內(nèi)，藥物的劑量和藥理作用間存在著量效關(guān)系，即劑量增大，藥理作用會隨著增強(qiáng)。將劑量和反應(yīng)經(jīng)過適當(dāng)轉(zhuǎn)換之后，量效關(guān)系可以轉(zhuǎn)化成以反應(yīng)或其函數(shù)為縱坐標(biāo)、劑量或其函數(shù)為橫坐標(biāo)的直線關(guān)系。
頭花蓼(Polygonum capitatum Buch-Ham.ex D.Don)，又名四季紅，蓼科蓼屬植物，多年生草本，為苗族常用藥材。在中國的貴州、云南、廣西、四川、西藏、湖北、湖南、江西均有分布，主要生長在山坡、山谷及富含煤層的砂頁巖地帶。頭花蓼主要具有清熱解毒，利尿通淋等功效。始載于1963年《廣西中藥志》第二冊，主要用于風(fēng)濕痛。1977年《中藥大辭典》上冊收載，民間將其用于治療痢疾、腎炎、膀胱炎、尿路結(jié)石等?！顿F州省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》1988年版及《貴州苗族醫(yī)藥研究與開發(fā)》均有收載，以其為原料的熱淋清顆粒劑于2002年進(jìn)入中國基本用藥目錄。頭花蓼具有抗炎和抗菌等多種活性，其含有的有效成分也非常復(fù)雜，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)頭花蓼中含有黃酮類和沒食子酸等有效成分，但是，由于含有的成分復(fù)雜或者是協(xié)同作用因素，頭花蓼及其提取物的活性與其中的黃酮類或沒食子酸類有效成分沒有明確的量效關(guān)系，因而，通過測定頭花蓼及其提取物中的某個有效成分含量的結(jié)果很難反映被測定物的生物活性，因此，人們客觀上需要一種直接、快速地測定頭花蓼及其提取物的生物活性的方法，本發(fā)明正是為解決該問題而提出的。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種測定頭花蓼及其提取物生物活性的方法。
本發(fā)明中所述的頭花蓼及其提取物和制品，包括頭花蓼原藥和用水、75％乙醇和95％乙醇和二氧化碳超臨界條件分別對頭花蓼全草、地上部分、葉、種子、莖和根部分別進(jìn)行了提取得到的提取物及其制品，本發(fā)明的目的是提供一種方法對頭花蓼及其提取物和制品進(jìn)行生物活性測定，以便對它們的效價進(jìn)行評價。
本發(fā)明涉及的頭花蓼及其提取物和制品可以通過下列方法得到的實(shí)施例1制備頭花蓼地上部分水提取物(編號w-2-1)取頭花蓼地上部分220kg，洗凈，加入7倍量水，加熱煮沸1.5小時，過濾，藥渣中加入6倍量水，煮沸1.0小時，過濾。合并濾液，濃縮至相對密度為1.2(20℃)得到浸膏，噴霧干燥得到浸膏粉23kg，收率是10.45％。
采用分光光度計(jì)法測定w-2-1中的總黃酮含量，將本發(fā)明的方法制備得到的w-2-1提取物和輔料均勻混和，制粒，干燥，即得到新方法制備的熱淋清顆粒。
實(shí)施例2制備頭花蓼全草水提取物(噴霧干燥)(編號w-1-2)根據(jù)與實(shí)施例1相同的方法，用頭花蓼全草代替頭花蓼地上部分進(jìn)行提取。
取w-1-2浸膏粉按實(shí)施例1相同的方法，制得樣品(w-1-12)。
實(shí)施例3制備頭花蓼全草水提取物(減壓干燥)(編號w-1-3)根據(jù)與實(shí)施例2相同的方法，將干燥方法改為減壓干燥。
實(shí)施例4制備頭花蓼根95％乙醇提取物(編號w-1-4)取頭花蓼根10kg，洗凈，置不銹鋼濃縮罐內(nèi)，加入7.5倍量的95％乙醇，回流提取1.5小時，過濾。藥渣加入7.5倍量95％乙醇，回流提取1.0小時，過濾。合并兩次濾液，濃縮得浸膏，減壓干燥得到提取物0.215kg。
實(shí)施例5制備頭花蓼莖95％乙醇提取物(編號w-1-5)根據(jù)與實(shí)施例4相同的方法，用頭花蓼莖進(jìn)行提取。
實(shí)施例6制備頭花蓼葉95％乙醇提取物(編號w-1-6)根據(jù)與實(shí)施例4相同的方法，用頭花蓼葉進(jìn)行提取。
實(shí)施例7制備頭花蓼種子95％乙醇提取物(編號w-1-7)根據(jù)與實(shí)施例4相同的方法，用頭花蓼種子進(jìn)行提取。
實(shí)施例8制備頭花蓼鮮品95％乙醇提粉(編號w-1-8)根據(jù)與實(shí)施例4相同的方法，用頭花蓼鮮品進(jìn)行提取。
實(shí)施例9制備頭花蓼鮮品水提粉(編號w-1-9)根據(jù)與實(shí)施例3相同的方法，用頭花蓼鮮品進(jìn)行提取。
實(shí)施例10制備頭花蓼全草75％乙醇提取物(編號W-1-10)取頭花蓼全草10kg，洗凈，置不銹鋼濃縮罐內(nèi)，加入7-8倍量75％乙醇，回流提取1.5小時，過濾。藥渣加入5倍量75％乙醇，回流提取1.0小時，過濾。合并兩次濾液，濃縮得浸膏，減壓干燥得到提取物0.694kg。
實(shí)施例11制備頭花蓼全草水煎醇沉溶液粉(W-1-14a)和頭花蓼全草水煎醇沉沉淀粉(W-1-14b)取頭花蓼全草10.60kg，洗凈，加入350kg水，加熱煮沸1.5小時，轉(zhuǎn)移上清液，殘?jiān)屑尤?50kg水，煮沸1.0小時。合并煎煮液，過濾濃縮至相對密度為1.04(24℃)得浸膏16.1kg。加入95％乙醇調(diào)至含醇量為60％，靜至24小時，分取溶液。向沉淀加入95％乙醇調(diào)至含醇量為60％，靜至24小時，分取溶液，合并兩次溶液，揮去乙醇，80℃減壓干燥得頭花蓼全草水煎醇沉溶液粉(W-1-14a)0.755kg；沉淀于80℃減壓干燥得頭花蓼全草水煎醇沉沉淀粉(W-1-14b)0.465kg。
實(shí)施例12制備頭花蓼原藥粉二氧化碳超臨界萃取提取物(編號W-1-15a)取頭花蓼原藥粉10kg，洗凈，投入超臨界萃取釜中，對萃取釜和兩個解析釜加熱，對貯罐進(jìn)行冷卻，當(dāng)溫度達(dá)到預(yù)定的溫度時，打開CO2氣瓶送氣，當(dāng)壓力達(dá)到預(yù)定壓力時，開始循環(huán)萃取，調(diào)節(jié)流量，并加入夾帶劑，恒溫恒壓萃取2小時。將得到的液體減壓濃縮得到浸膏0.135kg。
實(shí)施例13制備頭花蓼藥渣二氧化碳超臨界萃取提取物(編號W-1-15b)取頭花蓼藥渣10kg，洗凈，投入超臨界萃取釜中，對萃取釜和兩個解析釜加熱，對貯罐進(jìn)行冷卻，當(dāng)溫度達(dá)到預(yù)定的溫度時，打開CO2氣瓶送氣，當(dāng)壓力達(dá)到預(yù)定壓力時，開始循環(huán)萃取，調(diào)節(jié)流量，并加入夾帶劑，恒溫恒壓萃取2小時。將得到的液體減壓濃縮得到浸膏0.119kg。
實(shí)施例14制備頭花蓼地上部分70％乙醇提取物(編號W-2-2)取頭花蓼地上部分30kg，洗凈，置不銹鋼濃縮罐內(nèi)，加入8-9倍量70％乙醇，回流提取1.5小時，過濾。藥渣加入4-5倍量70％乙醇，回流提取1.0小時，過濾。藥渣再加入4-5倍量70％乙醇，回流提取1.0小時，過濾。合并三次濾液，濃縮得浸膏，減壓干燥得到提取物3.75kg。
具體而言，本發(fā)明利用小鼠耳腫脹法測定頭花蓼提取物的生物活性，具體實(shí)驗(yàn)方法是試驗(yàn)一利用小鼠耳腫脹法，設(shè)計(jì)4個劑量，分別為10、20、40、80mg/kg，單次靜脈注射給藥(iv)，同時設(shè)立陽性藥組和模型組。
步驟如下樣品配制精確稱量10、20、40、80mg的編號為W-1-2頭花蓼提取物粉末，置10ml刻度離心管中，加入少許生理鹽水，超聲振蕩至少3分鐘，優(yōu)選5-10分鐘，最優(yōu)選10分鐘，使W-1-2粉末均勻分散在生理鹽水中，隨后準(zhǔn)確添加生理鹽水至10ml刻度，備用；給藥每小鼠按體重尾單次靜脈注射0.2-1.0ml/20g，優(yōu)選0.2ml/20g上述藥液，單次靜脈注射5分鐘后，優(yōu)選10分鐘后，每只小鼠右耳內(nèi)側(cè)均勻涂抹1％(w/w)巴豆油致炎劑(溶媒為V乙醇∶水∶乙醚＝25∶5∶70)；測定4小時后準(zhǔn)時處死小鼠，取二耳，用直徑8mm打孔器沖下左右二耳片，分別稱重，二耳重量差值為腫脹度(mg)，再按下公式計(jì)算腫脹抑制率％。
試驗(yàn)結(jié)果劑量與腫脹抑制率(％)關(guān)系見下表1和表2。
表1 靜注W-1-2劑量與腫脹制率(％)量效關(guān)系劑量(mg/kg)腫脹抑制率(％)統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果10 14.9 P＞0.0520 20.3 P＜0.0140 29.8 P＜0.0180 31.0 P＜0.01由此可見，10mg/kg劑量抗炎作用不明顯(P＞0.05)，20mg/kg起開始有效，雖然當(dāng)劑量增加至80mg/kg，其腫脹抑制率(％)有明顯提高，但無明顯線性關(guān)系(見附

圖1)。經(jīng)計(jì)算γ＝0.885，P＞0.05，表明頭花蓼浸膏粉靜脈給藥的抗炎作用的劑量與藥效之間有一定量效關(guān)系，但無線性關(guān)系，況且劑量增至80mg/kg，小鼠經(jīng)靜注給藥后已出現(xiàn)輕度不良反應(yīng)(活動減少，伏臥不動，呼吸急促等)。
表2 靜注W-1-2劑量與腫脹制率(％)量效關(guān)系原料劑量 給藥途徑 次數(shù)腫脹抑制率(％)致炎劑W-1-2 10g/kgiv1 19.4(P＜0.01) 巴豆油W-1-2 40g/kgiv1 29.8(P＜0.01) 巴豆油W-1-2 20g/kgiv1 20.3(P＜0.05) 巴豆油W-1-2 40g/kgiv1 30.6(P＜0.05) 巴豆油可見，雖然只進(jìn)行二次試驗(yàn)，但二次試驗(yàn)結(jié)果一致性得到肯定，結(jié)果提示頭花蓼浸膏粉中的抗炎活性成份由于采用靜注方式而全部進(jìn)入體內(nèi)起到抗炎作用。劑量由原先口服的克級單位降至毫克級單位，大大降低用藥量。并且用藥時間也大大縮短，從而每批試驗(yàn)時間也明顯縮短，即在一天時間內(nèi)可完成一次試驗(yàn)，對樣品的抗炎療效很快得出評判。
試驗(yàn)二用小鼠耳部巴豆油炎癥模型，根據(jù)小鼠耳腫脹生物活性測定法，測定不同藥用部位和不同提取工藝得到的提取物的抗炎活性。實(shí)驗(yàn)采用小鼠靜脈注射給藥，給藥劑量為40mg/kg，在同等劑量下，比較各提取物樣品的抗炎活性大小。以此來對不同藥用部位，不同提取工藝樣品的療效作出評判。
樣品配制方法用5％丙二醇作溶媒，將樣品稱量后，先加入0.5ml丙二醇超聲處理，待樣品粉末分散均勻后，再用生理鹽水稀釋至刻度(10ml)。
其他試驗(yàn)條件和處理與試驗(yàn)一相同。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果共進(jìn)行三批實(shí)驗(yàn)，每批實(shí)驗(yàn)均在同時相同的實(shí)驗(yàn)條件(室溫、濕度)下進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3
表3不同頭花蓼樣品抗炎活性的比較內(nèi)含總黃 內(nèi)含沒食劑量 第一次實(shí)驗(yàn)(n＝10) 第二次實(shí)驗(yàn)(n＝10) 第三次實(shí)驗(yàn)(n＝11)編號名稱 酮量 子酸量(mg/kg) (mg) (mg)腫脹度(mg) 腫脹率(％)腫脹度(mg)腫脹率(％) 腫脹度(mg) 腫脹率(％)W-1-2全草水提(噴霧) 40 0.728 0.86413.1±5.0*(30.7) 77.8±36.8*10.8±2.5*(33.7) 72.2±22.5**11.5±3.4*(33.1) 64.0±20.2**全草水提(減壓) 40 0.584 1.09813.1±4.7*(30.7) 82.6±30.9 11.5±2.5**{29.4} 75.1±20.3**11.3±2.8**(34.3) 64.0±17.0**W-1-3W-1-4 根95％醇提 40 0.901 0.59213.6±4.7*(28.0) 86.1±29.9 12.2±3.2**{25.1} 80.6±19.3**14.4±3.1*(16.3) 84.7±24.5*W-1-5 莖95％醇提 40 0.776 0.48014.1±3.5*(25.4) 86.4±26.0 13.9±2.3*(14.7) 96.2±16.7*14.5±4.5(15.7) 80.5±24.7*W-1-6 葉95％醇提 40 2.517 0.30513.0±2.6*(31.2) 82.1±22.7*84±3.1**(48.5)57.9±20.4**9.8±2.8**(43.0) 59.4±17.0**陽性對照 氫化可的松 20 - - 6.7±2.9**(64.6) 45.2±20.7**4.9±2.8**(69.9) 36.4±16.4**4.7±1.6**(72.7) 29.7±12.1*陽性對照 蘆丁 20 20 -11.4±2.7**(30.1) 74.7±17.1**11.4±2.9**(33.3) 65.4±21.3**陽性對照 沒食子酸 20 - 20 15.9±3.4(2.4) 107.0±19.5 15.3±2.2(11.0) 96.6±18.9模型組5％丙二醇18.9±5.3 117.2±43.116.3±2.5 117.8±24.0 17.2±2.8 104.4±16.6W-1-2 全草水提 40 0.728 0.86412.6±3.4**81.1±26.5**7.3±2.5**41.7±15.4**7.8±3.4**47.3±22.2**W-1-8 鮮品醇提 40 1.510 1.31313.0±2.4*(31.2) 86.2±26.3 13.5±3.0*(17.2) 85.1±32.2*13.2±3.1*(23.3) 77.3±23.8**W-1-9 鮮品水提 40 0.770 1.2767.4±2.6**(60.8) 45.8±18.0**9.5±3.7**(41.7) 57.8±29.4**8.8±2.8**(48.8) 55.2±22.8**W-1-15b CO2藥渣 4012.1±3**77.2±19.2**7.6±1.6**40.7±9.7**4.1±1.9**25.8±12.6**W-1-15a CO2藥材 4017.9±2.9 108.8±29.410.4±3.2 57.1±21.9 7.1±3.9**43.8±22.7**陽性對照 氫化可的松 205.0±2.4**34.8±18.0 2.4±1.3**13.8±7.8**2.2±1.4**13.4±8.6模型組5％丙二醇 - 20.4±2.8 124.8±21.113.4±3.3 73.7±20.9 12.5±4.1 82.5±28.9**備注1.氫化可的松、蘆丁、沒食子酸用生理鹽水配制，其余樣品用5％丙二醇配制。2.除根醇提粉樣品在丙二醇中分散較難而超聲4小時外，其余樣品均超聲10分鐘處理。3.“*”“**”分別表示與模型組比較P＜0.05、P＜0.01。
試驗(yàn)表明，本發(fā)明使用小鼠耳部巴豆油炎癥模型，根據(jù)小鼠耳腫脹生物活性測定法，定性定量地測定出頭花蓼及其不同藥用部位和不同提取工藝得到的提取物和制品的抗炎活性。實(shí)驗(yàn)采用小鼠靜脈注射給藥，可以比較出頭花蓼及其各提取物樣品的抗炎活性大小。以此可以用于對頭花蓼不同藥用部位，不同提取工藝樣品的療效作出評判。
權(quán)利要求
1.一種測定頭花蓼及其提取物和制品生物活性的方法，包括如下步驟樣品配制精確稱量10、20、40、80mg頭花蓼或其提取物和其制品粉末，置10ml刻度離心管中，加入少許生理鹽水，超聲振蕩至少3分鐘，使頭花蓼提取物粉末均勻分散在生理鹽水中，隨后準(zhǔn)確添加生理鹽水至10ml刻度，備用；給藥每小鼠按體重尾單次靜脈注射0.2-1.0ml/20g上述藥液，單次靜脈注射5分鐘后，每只小鼠右耳內(nèi)側(cè)均勻涂抹巴豆油致炎劑；測定4小時后準(zhǔn)時處死小鼠，取二耳，用打孔器沖下左右二耳片，分別稱重，二耳重量差值為腫脹度，再按下公式計(jì)算腫脹抑制率％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在樣品配制步驟中超聲振蕩5-10分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2之一的方法，其中的給藥步驟中，每小鼠按體重尾單次靜脈注射0.2ml/20g樣品配制藥液，單次靜脈注射10分鐘后，每只小鼠右耳內(nèi)側(cè)均勻涂抹巴豆油致炎劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中巴豆油致炎劑的濃度是1％(w/w)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中巴豆油致炎劑的溶媒為乙醇∶水∶乙醚＝25∶5∶70的混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定頭花蓼及其提取物和制品生物活性的方法，包括如下步驟a.樣品配制精確稱量頭花蓼或其提取物和其制品粉末，置10ml刻度離心管中，加入少許生理鹽水，超聲振蕩，使頭花蓼提取物粉末均勻分散，隨后準(zhǔn)確添加生理鹽水至10ml刻度，備用；b.給藥每小鼠注射上述藥液，5分鐘后，每只小鼠涂抹巴豆油致炎劑；c.測定4小時后準(zhǔn)時處死小鼠，用打孔器沖下左右二耳片，分別稱重，二耳重量差值為腫脹度，再按公式計(jì)算腫脹抑制率。
文檔編號G01N33/15GK1534285SQ0312150
公開日2004年10月6日 申請日期2003年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月2日
發(fā)明者梁斌, 王子厚, 李孟林, 張麗艷, 莊鎮(zhèn)華, 榮祖元, 張淑華, 葉曉鳴, 梁 斌 申請人:貴州威門藥業(yè)股份有限公司