專利名稱：熱淋清顆粒和頭花蓼的薄層色譜指紋圖譜的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，特別涉及中藥質(zhì)量評價領(lǐng)域，具體涉及一種熱淋清顆粒及其原料藥材頭花寥的質(zhì)量評價方法，特別涉及熱淋清顆粒及其原料藥材頭花寥指紋圖譜的測定方法，更特別地具體涉及一種通過薄層色譜指紋圖譜對熱淋清顆粒及不同產(chǎn)地頭花寥進(jìn)行質(zhì)量評價的方法。
背景技術(shù)：
頭花寥為寥科植物頭花寥Polygonum capitatum Buch. -Ham. ex D. Don的干燥全草或地上部分，收載于《貴州省中藥材民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003年版，具清熱利濕、抗菌消炎、利尿通淋等功效(貴州省食品藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[M]. 貴陽:貴州科技出版社，2003 :147)。頭花寥是貴州常用苗藥，是貴州省中藥現(xiàn)代化重點(diǎn)發(fā)展的“六大苗藥”和重點(diǎn)培育發(fā)展的“七大中藥產(chǎn)業(yè)鏈”的品種之一。本發(fā)明的申請人已在貴州施秉及貴陽烏當(dāng)區(qū)建立了頭花寥規(guī)范化種植基地，并通過國家GAP認(rèn)證?，F(xiàn)在有關(guān)頭花寥GAP種植及化學(xué)成分等方面的研究已取得一定成果(孫長生，韓見宇，楊錦綱，等.頭花寥GAP種植基地的環(huán)境質(zhì)量評價[J].中藥研究與信息，2005，7 (2) 27 30)，但頭花寥藥材現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為簡單，僅以單一成分槲皮素為指標(biāo)進(jìn)行評價，無法達(dá)到真實、全面反應(yīng)藥材內(nèi)在品質(zhì)的目的。CN101091749A公開了一種頭花寥藥材、提取物及其質(zhì)量控制方法，其中的頭花寥藥材具有如HPLC指紋圖譜，含有13個特征峰，其中色譜條件為色譜柱依利特HYPERSIL ODS色譜柱(4.6mmX150mm，5iim);柱溫25°C ;流動相乙腈(A)-O. 4%磷酸⑶溶液二元梯度洗脫，重量百分比為0-30% 100-70% ;流速0. 8mL min—1 ;檢測波長3IOnm ;進(jìn)樣量20yL。該發(fā)明質(zhì)控制方法對不同產(chǎn)地頭花寥進(jìn)行了考察比較，構(gòu)建了頭花寥HPLC的指紋圖譜。CN102296118A公開了一種DNA分子標(biāo)記鑒別技術(shù)鑒別頭花寥與尼泊爾寥的方法， 在該發(fā)明中，以貴州具有代表性的民族藥頭花寥為研究對象，探索使用RAro分析方法對頭花寥與尼泊爾寥進(jìn)行遺傳多樣性分析；并在RAPD的實驗基礎(chǔ)上，將RAPD方法轉(zhuǎn)化為SCAR 標(biāo)記，為頭花寥與尼泊爾寥的藥材鑒定提供了準(zhǔn)確可靠、快速穩(wěn)定的方法。DNA分子標(biāo)記鑒別技術(shù)同樣不適合藥材的常規(guī)質(zhì)量評價和控制。中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜。在現(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下，中藥指紋圖譜對于有效控制中藥材或中成藥的質(zhì)量具有重要的意義。日本漢方藥主要生產(chǎn)企業(yè)在20 世紀(jì)80年代就已經(jīng)在企業(yè)內(nèi)部采用高效液相指紋圖譜控制質(zhì)量。德國、法國在對銀杏葉提取物聯(lián)合開發(fā)的過程中，發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物的醫(yī)療作用是提取物所得物質(zhì)群的整體作用結(jié)果，而對這樣一個整體的質(zhì)量控制，亦采用高效液相指紋圖譜方法。美國FDA最近幾年制定的植物草藥指南中已經(jīng)明確把指紋圖譜作為混合物質(zhì)群的質(zhì)量控制方法(FDA. Guidanceof Industy Botanical Drug(Draft). 2000August)。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，作為中醫(yī)理論的實踐產(chǎn)物，中藥，尤其是復(fù)方中藥，其中所含的任一成分都不能代表其整體療效。人們逐漸認(rèn)識到，現(xiàn)行的參照西藥(合成藥)質(zhì)量控制模式的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能恰當(dāng)?shù)胤从持兴巸?nèi)在的質(zhì)量。從發(fā)展趨勢看，從現(xiàn)行的質(zhì)量控制模式向一種綜合的、宏觀的、可量化的鑒別與主要有效成分含量測定結(jié)合已是發(fā)展的趨勢。中藥質(zhì)量評價的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是利用光譜或色譜手段鑒別和測定某一種或幾種有效成分、活性成分或指標(biāo)成分，以及藥典規(guī)定的常規(guī)檢查項目。顯然，這些質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)置是模仿了化學(xué)藥品的模式。其它國家如英國、印度、美國草藥典、日本藥局方中的漢藥及德國 Commission E編輯的德國草藥專論等也采用了基本相同的內(nèi)容。對于化學(xué)藥品而言,其藥效成分為結(jié)構(gòu)清晰的單一化合物，構(gòu)效關(guān)系明確，其含量和純度直接表達(dá)其有效及安全性。 然而，中醫(yī)用藥的特點(diǎn)是復(fù)方配伍，任何單一的有效或活性成分的含量高低均不能表達(dá)其整體的療效。例如，黃芪所含的黃芪甲苷(aastraga loside IV)是當(dāng)前被選擇為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的鑒別和含量測定的最為常見的目標(biāo)，但并沒有依據(jù)證明黃芪甲苷與黃芪的功能主治的明確聯(lián)系。同樣，黃連、黃柏、三棵針均含小檗堿，一般都以它作為檢測的目標(biāo)，但是三者的功能主治卻截然不同。復(fù)方制劑的情況就更加復(fù)雜。中醫(yī)這種不是一對一的非線性的理論和實踐說明中藥質(zhì)量應(yīng)該采用某種宏觀的綜合的質(zhì)量評價手段。然而就頭花寥藥材的質(zhì)量評價，例如就產(chǎn)地差異對頭花寥藥材進(jìn)行質(zhì)量評價，或者對藥材的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，以及就由頭花寥制備得到的提取物或者制劑，例如熱淋清顆粒， 迄今為止尚無一從整體上控制樣品質(zhì)量的適用的常規(guī)檢驗方法。因此，本領(lǐng)域仍然需要有一從整體上控制頭花寥藥材提取物或者制劑例如熱淋清顆粒質(zhì)量評價的方法，特別是可以用于頭花寥藥材真?zhèn)舞b別以及藥材、提取物或制劑簡便、宏觀、可行的質(zhì)量判定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適合常規(guī)使用的用于熱淋清顆粒及其原料藥材頭花寥質(zhì)量評價的方法，特別是可以用于熱淋清顆粒及其頭花寥藥材真?zhèn)舞b別和/或初步質(zhì)量判定的方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)采用一種獨(dú)特的薄層色譜法(TLC)方法可以有效地實現(xiàn)至少一個上述的目的，該方法可以有效地為客觀、準(zhǔn)確地評價熱淋清顆粒及其頭花寥藥材的品質(zhì)， 為熱淋清顆粒及頭花寥藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升以及頭花寥藥材優(yōu)良種源選育、規(guī)范化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。為此，本發(fā)明第一方面提供了一種頭花寥藥材指紋圖譜的測定方法，其是照薄層色譜法測定，包括以下步驟(a)薄層點(diǎn)樣液制備稱取頭花寥藥材粉末，加水超聲處理，過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酸萃取液蒸干，殘渣用乙酸乙酯使溶解，作為頭花寥供試品溶液；以及任選地分別制備蘆丁、槲皮苷和沒食子酸的對照品溶液；(b)薄層層析采用聚酰胺薄層板，取上述供試品溶液和任選的對照品溶液點(diǎn)樣于薄層板上，用體積比為7 6.5 2.5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作為展開劑進(jìn)行展開；(c)顯色向揮干的薄層板上噴以顯色液AlCl3試液，揮盡薄層板上的殘余溶劑， 置320nm的紫外光燈下檢視熒光薄層色譜，得到頭花寥藥材的指紋圖譜。
在本發(fā)明中，所述“薄層色譜法”的一般操作規(guī)范可以不作限定。在第一方面方法的一個實施方案中，所述的薄層色譜法可以是記載于包括但不限于下列文件中的方法中華人民共和國藥典2010年版一部附錄VI B、中華人民共和國藥典2010年版二部附錄VB、 中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VI B、中華人民共和國藥典2005年版二部附錄VB
坐寸o根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(a)中，所述頭花寥供試品溶液是用如下方法配制的取頭花寥藥材粉末，至容量瓶中，加水適量，超聲處理，放冷，用水定容至刻度， 濾過，濾液用乙酸乙酯萃取，使乙酸乙酯液蒸干，殘渣加乙酸乙酯使溶解，即得供試品溶液。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(a)中超聲處理是以功率250W、頻率33kHz 的條件超聲處理15 60min,優(yōu)選20 40min,例如約30min。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(a)中，所述頭花寥供試品溶液是用如下方法配制的取頭花寥藥材粉末2g，至25mL容量瓶中，加水25mL，以功率250W、頻率33kHz 超聲處理30min，放冷，用水定容至刻度，濾過，濾液用乙酸乙酯萃取3次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加5mL乙酸乙酯使溶解，即得供試品溶液。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(a)中，還包括分別制備蘆丁、槲皮苷和沒食子酸的對照品溶液的操作，其步驟是分別精密稱取干燥至恒重的蘆丁、槲皮苷、沒食子酸對照品適量，用甲醇制成濃度分別為0. 5±0. 05mg/mL、0. 1±0. 02mg/mL、0. 1±0. 02mg/mL 的對照品溶液。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)中，點(diǎn)樣液的體積為2 IOii L，優(yōu)選 2 ~ 6 u L,例如 4 u L，例如 5 u I。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)中，點(diǎn)樣液點(diǎn)樣于距薄層板底邊IOmm 處。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)中，展開距離為7 15cm，例如7 12cm,例如7 IOcm,優(yōu)選8cm。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)中，使用體積比為7 6.5 2.5 3 的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液進(jìn)行二次展開。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)中，所述展開是在雙槽展開箱的一側(cè)加入上述展開溶劑進(jìn)行預(yù)平衡，溫度20°C，相對濕度至小于88% (優(yōu)選小于72%，更優(yōu)選小于50% )的條件下進(jìn)行的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)是以如下方式操作的采用聚酰胺薄層板，取供試品溶液、對照品溶液各4yL，用半自動點(diǎn)樣儀點(diǎn)于距薄層板底邊IOmm處；用體積比為7 6.5 2.5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作為展開劑；在溫度20°C、相對濕度至小于88%的條件下于雙槽展開箱的一側(cè)加入上述展開溶劑預(yù)平衡 15min，上行展開，展距8cm;用體積比為7 6. 5 2. 5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作為展開劑進(jìn)行二次展開，即可。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(C)中，所述檢視可以是肉眼觀察、照相處理和/或掃描儀掃描。照相處理和/或掃描儀掃描可以容易獲得展開的薄層板上的斑點(diǎn)和色譜峰，對于進(jìn)一步對結(jié)果進(jìn)行評價是有益的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中還包括步驟(d)對薄層色譜圖進(jìn)行分析包括5個共有峰/斑點(diǎn)的薄層色譜指紋圖譜所對應(yīng)的藥材可初步判定為頭花寥藥材正品，無5個共有峰/斑點(diǎn)則可判定為偽品。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(d)中，如果藥材的第3、4號峰/斑點(diǎn)與蘆丁顯示的峰/斑點(diǎn)對應(yīng)，則可初步判定該藥材為頭花寥藥材正品，否則可判定為偽品。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(d)中，如果藥材的第4號峰/斑點(diǎn)與槲皮苷顯示的峰/斑點(diǎn)對應(yīng)，則可初步判定該藥材為頭花寥藥材正品，否則可判定為偽品。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(d)中，如果藥材的第3、4號峰/斑點(diǎn)與蘆丁顯示的峰/斑點(diǎn)對應(yīng)，并且第4號峰/斑點(diǎn)與槲皮苷顯示的峰/斑點(diǎn)對應(yīng)，則可初步判定該藥材為頭花寥藥材正品，否則可判定為偽品。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(d)中，相同取樣量、相同點(diǎn)樣量的條件下，如果某批次藥材的5個共有峰/斑點(diǎn)強(qiáng)度與同時展開的其它批次藥材相比更強(qiáng)，則表明該批次藥材質(zhì)量比其它批次藥材更好。由于本發(fā)明第一方面的方法中制備供試液時是使用水為溶劑作為提取液，而現(xiàn)有的頭花寥制劑以及制備該制劑的頭花寥提取物多是使用水或者含水乙醇作為溶劑提取得到，因此本發(fā)明第一方面的方法在供試品溶液的制備過程中作微小的變化即可適用于現(xiàn)有的頭花寥制劑以及制備該制劑的頭花寥提取。例如，中國藥典2010年版收載的熱淋清顆粒，其制備方法中記載了頭花寥的提取方法，使用該方法，由藥材提取至獲得浸膏(即頭花寥提取物)，加上適量淀粉和/或蔗糖可以進(jìn)一步制成無糖型或者含糖型的熱淋清顆粒。此外，市售的熱淋清片、膠囊劑等頭花寥制劑，它們均是用或者類似地用中國藥典2010年版收載的熱淋清顆粒所記載的頭花寥提取方法獲得浸膏，再加入常規(guī)藥用輔料制備成片劑和膠囊劑，這些常規(guī)藥用輔料通常在本發(fā)明TLC方法下不會顯示色譜斑點(diǎn)，因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，術(shù)語“頭花寥制劑”，其在為實現(xiàn)本發(fā)明目的的意義方面，其含義與頭花寥提取物、熱淋清顆粒、熱淋清片、熱淋清膠囊等術(shù)語等同(即這些樣品均適合使用本發(fā)明方法來測定薄層色譜指紋圖譜)。因此，本發(fā)明第二方面提供了一種頭花寥制劑(例如熱淋清顆粒)以及制備該制劑的頭花寥提取物的指紋圖譜的測定方法，其是照薄層色譜法測定，包括以下步驟(a)薄層點(diǎn)樣液制備稱取頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物，用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酸萃取液蒸干，殘渣用乙酸乙酯使溶解，作為供試品溶液；以及任選地分別制備蘆丁、槲皮苷和沒食子酸的對照品溶液；以及如本發(fā)明第一方面任一實施方案所述的步驟(b)、步驟(C)、和任選的步驟 ⑷。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其包括以下步驟(a)薄層點(diǎn)樣液制備稱取頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物，用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酸萃取液蒸干，殘渣用乙酸乙酯使溶解，作為供試品溶液；以及任選地分別制備蘆丁、槲皮苷和沒食子酸的對照品溶液；(b)薄層層析采用聚酰胺薄層板，取上述供試品溶液和任選的對照品溶液點(diǎn)樣于薄層板上，用體積比為7 :6. 5 2.5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作為展開劑進(jìn)行展開；(c)顯色向揮干的薄層板上噴以顯色液AlCl3試液，揮盡薄層板上的殘余溶劑，置320nm的紫外光燈下檢視熒光薄層色譜，得到頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物的指紋圖譜。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中所述步驟(a)中還任選地包括在萃取之前用水溶解所述頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物的步驟。在此溶解步驟之后再如步驟
(a)所述用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中步驟(a)中，所述供試品溶液是用如下方法配制的取頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物，至容量瓶中，加水溶解，用水定容至刻度，濾過，濾液用乙酸乙酯萃取，使乙酸乙酯液蒸干，殘渣加乙酸乙酯使溶解，即得供試品溶液。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中步驟(a)中，還包括分別制備蘆丁、槲皮苷和沒食子酸的對照品溶液的操作，其步驟是分別精密稱取干燥至恒重的蘆丁、槲皮苷、沒食子酸對照品適量，用甲醇制成濃度分別為0. 5±0. 05mg/mL、0. 1±0. 02mg/mL、0. 1±0. 02mg/mL 的對照品溶液。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中步驟(b)中，點(diǎn)樣液的體積為2 IOii L，優(yōu)選 2 ~ 6 u L,例如 4 u L，例如 5 u I。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中步驟(b)中，點(diǎn)樣液點(diǎn)樣于距薄層板底邊IOmm 處。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中步驟(b)中，展開距離為7 15cm，例如7 12cm,例如7 IOcm,優(yōu)選8cm。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中步驟(b)中，使用體積比為7 6.5 2.5 3 的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液進(jìn)行二次展開。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中步驟(b)中，所述展開是在雙槽展開箱的一側(cè)加入上述展開溶劑進(jìn)行預(yù)平衡，溫度20°C，相對濕度至小于88% (優(yōu)選小于72%，更優(yōu)選小于50% )的條件下進(jìn)行的。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中步驟(b)是以如下方式操作的采用聚酰胺薄層板，取供試品溶液、對照品溶液各4yL，用半自動點(diǎn)樣儀點(diǎn)于距薄層板底邊IOmm處；用體積比為7 6.5 2.5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作為展開劑；在溫度20°C、相對濕度至小于88%的條件下于雙槽展開箱的一側(cè)加入上述展開溶劑預(yù)平衡 15min，上行展開，展距8cm;用體積比為7 6. 5 2. 5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作為展開劑進(jìn)行二次展開，即可。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中步驟(C)中，所述檢視可以是肉眼觀察、照相處理和/或掃描儀掃描。照相處理和/或掃描儀掃描可以容易獲得展開的薄層板上的斑點(diǎn)和色譜峰，對于進(jìn)一步對結(jié)果進(jìn)行評價是有益的。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中還包括步驟(d)對薄層色譜圖進(jìn)行分析包括 5個共有峰/斑點(diǎn)的薄層色譜指紋圖譜所對應(yīng)的藥材可初步判定為該頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物正常，無5個共有峰/斑點(diǎn)則可判定為該頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物異常。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中步驟(d)中，如果該頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物的第3、4號峰/斑點(diǎn)與蘆丁顯示的峰/斑點(diǎn)對應(yīng)，則可初步判定該頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物正常，否則可判定異常?；诖朔椒ǖ慕Y(jié)果可采用其它方法作進(jìn)一步驗證產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中步驟(d)中，如果該頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物的第4號峰/斑點(diǎn)與槲皮苷顯示的峰/斑點(diǎn)對應(yīng)，則可初步判定該頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物正常，否則可判定異常。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中步驟(d)中，如果該頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物的第3、4號峰/斑點(diǎn)與蘆丁顯示的峰/斑點(diǎn)對應(yīng)，并且第4號峰/斑點(diǎn)與槲皮苷顯示的峰/斑點(diǎn)對應(yīng)，則可初步判定該頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物正常，否則可判定異常。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中步驟(d)中，如果某批次頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物的在相同取樣量、相同點(diǎn)樣量的條件下，5個共有峰/斑點(diǎn)強(qiáng)度與同時展開的其它批次頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物相比更強(qiáng)，則表明該批次頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物質(zhì)量比其它批次頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物更好。本發(fā)明任一方面的任一實施方案所具有的特征同樣適用于該方面的其它任一實施方案以及其它方面的任一實施方案，只要它們不會相互矛盾；當(dāng)然在相互之間適用時，必要的話可對相應(yīng)特征作適當(dāng)修飾。本發(fā)明所引述的所有文獻(xiàn)，它們的全部內(nèi)容通過引用并入本文，并且如果這些文獻(xiàn)所表達(dá)的含義與本發(fā)明不一致時，以本發(fā)明的表述為準(zhǔn)。此外， 本發(fā)明使用的各種術(shù)語和短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對這些術(shù)語和短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術(shù)語和短語如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準(zhǔn)。在本發(fā)明中，提及％時，如未另外說明，是指重量/重量百分?jǐn)?shù)。在本發(fā)明中，提及展開劑混合液時，它們的比率是以體積比表示的。使用本發(fā)明的方法，表明頭花寥藥材薄層色譜由5個共有峰構(gòu)成了薄層色譜指紋圖譜的基本骨架，通過對照品實驗，確定3、4號峰為蘆丁，4號峰為槲皮苷；由于以上共有峰各批藥材均含有，因此上述共有峰應(yīng)作為頭花寥藥材鑒定的特征性成分。同一產(chǎn)地不同批次和不同產(chǎn)地頭花寥樣品的藥材質(zhì)量的差異，可以從這幾個峰的斑點(diǎn)顏色深度得到反映。 貴州施秉產(chǎn)12批頭花寥藥材樣品中這幾個斑點(diǎn)深度相似及峰面積大小相當(dāng)，說明這12批樣品相似性較大，品質(zhì)差異??；不同產(chǎn)地樣品相似性較大，但斑點(diǎn)深度略淺及峰面積差異較大，表明品質(zhì)差異較大；頭花寥的偽品赤驚散沒有上述5個共有峰，表明本發(fā)明的色譜條件和方法可以將偽品區(qū)別。因此頭花寥藥材和熱淋清顆粒的五個峰可以作為特征峰用于頭花寥藥材的真?zhèn)舞b別以及制劑質(zhì)量控制。各樣品在峰高上存在差異，反映了樣品中某些化學(xué)成分上有量的差異；但峰形一致，體現(xiàn)了它們在質(zhì)上沒有大的差別。在本發(fā)明的一個實施方案中，頭花寥藥材薄層色譜指紋圖譜測定條件確定為以水為提取溶劑，超聲處理，乙酸乙酯萃取后為提取溶劑；以正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸(7 : 6. 5 : 2. 5 : 3)作為展開劑，二次展開，預(yù)平衡15min，上行展開；展距8cm;溫度 20°C，控制相對濕度至32% 72%。用三氯化鋁試液顯色。揮盡溶劑后置紫外光燈(320nm) 下檢視熒光薄層色譜。本發(fā)明的結(jié)果顯示，貴州施秉產(chǎn)的12批頭花寥藥材的薄層色譜圖和
9輪廓圖十分相似，均有5個斑點(diǎn)和對應(yīng)的5個峰；對于不同產(chǎn)地的藥材而言，各峰在峰強(qiáng)度上有差異，體現(xiàn)了不同產(chǎn)地頭花寥所含化學(xué)成分在量上有差別。此外，頭花寥的偽品赤驚散沒有上述特征，說明本發(fā)明方法可以很好的區(qū)分頭花寥偽品，可以用于頭花寥藥材的真?zhèn)舞b別。本發(fā)明的薄層色譜指紋圖譜法不僅能反映頭花寥藥材的特征性成分，也能反映不同來源藥材之間的差異，還可以用于鑒別藥材的真?zhèn)?；同時該方法簡單易于操作，便于推廣應(yīng)用?？捎糜诓少徏吧a(chǎn)中的快速檢驗。


圖I描繪的是頭花寥藥材不同提取溶劑、不同展開系統(tǒng)薄層色譜圖(320nm)，S1至 S7的七個薄層色譜圖中，從左至右顯示的八個試樣展開帶分別為1 6.頭花寥不同溶劑提取液(I.乙酸乙酯；2.乙醇；3.甲醇；4.丙酮；5.正丁醇；6.水提乙酸乙酯萃取)；7.蘆丁 ；8.槲皮苷。展開劑運(yùn)行方向上行(在開發(fā)明中，如未另外說明，展開劑運(yùn)行方向均為上行)。圖2描繪了點(diǎn)樣時的相對濕度(RH，32%和88% )對頭花寥藥材和熱淋清顆粒薄層層析行為的影響(320nm)，圖中四條展開帶中從左至右依次是1.頭花寥樣品；2。熱淋清顆粒樣品；3.蘆丁 ；4.槲皮苷。圖3描繪了展開溫度對頭花寥藥材和熱淋清顆粒薄層層析行為的影響(320nm)， 圖中四條展開帶從左至右所對應(yīng)的檢品分別為1.頭花寥樣品；2.熱淋清顆粒樣品；3.蘆丁 ;4.槲皮苷。圖4描繪了預(yù)飽和時間對頭花寥藥材和熱淋清顆粒薄層色譜行為的影響 (320nm)，圖中四個色譜展開帶從左至右依次代表的檢品是1.頭花寥樣品；2.熱淋清顆粒樣品；3.蘆丁 ；4.槲皮苷。圖5描繪了不同顯色劑對頭花寥藥材和熱淋清顆粒薄層色譜行為的影響 (320nm)，圖中四個色譜帶從左至右依次表示1.頭花寥樣品；2.熱淋清顆粒樣品；3.蘆丁 ;4.槲皮苷。圖6描繪了標(biāo)準(zhǔn)品及頭花寥藥材和熱淋清顆粒薄層色譜輪廓掃描圖(320nm)，圖中的薄層展開圖是從左向右展開的。圖7描繪了12批貴州施秉出產(chǎn)的頭花寥藥材薄層色譜圖及輪廓掃描疊加圖 (320nm)，薄層色譜圖中14個色譜帶從左至右依次是12.編號為I 12的12批施秉頭花寥樣品，13.蘆?。?4.槲皮苷。 圖8描繪了 12批不同產(chǎn)地頭花寥藥材薄層色譜圖(a)及輪廓掃描疊加圖(b) (320nm)，薄層色譜圖中14個色譜帶從左至右依次是1.貴州施秉頭花寥樣品；2.貴州興義；3.貴州晴??；4.貴州盤縣；5.貴州畢節(jié)；6.貴州水城；7.貴州羅甸；8.湖南古丈；9.云南師宗；10.廣西田林；11.重慶南川；12.四川南川；13.蘆丁 ；14.槲皮苷。圖9描繪了施秉頭花寥藥材及頭花寥偽品薄層色譜圖及輪廓掃描圖(320nm)，薄層色譜圖中四個色譜帶從左至右依次表示的檢品為1.施秉頭花寥樣品；2.赤脛散；3.蘆丁 ;4.槲皮苷。圖10顯示了 12批含糖熱淋清顆粒薄層色譜圖(a)及輪廓掃描疊加圖(b)。
圖11顯示了 12批無糖熱淋清顆粒薄層色譜圖(a)及輪廓掃描疊加圖(b)。圖12顯示了 12批熱淋清片薄層色譜圖(a)及輪廓掃描疊加圖(b)。
具體實施例方式通過下面的實施例可以對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實施例。本領(lǐng)域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾。本發(fā)明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進(jìn)行一般性和/或具體的描述。雖然為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)描述。A、測試儀器與試藥儀器LIN0MAT V半自動點(diǎn)樣儀(瑞士卡瑪公司)、CAMAGR印rostar3薄層色譜成像系統(tǒng)(瑞士卡瑪公司)、CS-9301PC雙波長飛點(diǎn)薄層色譜掃描儀(日本島津公司)、AB204-S 型電子天平(梅特勒-托利多公司)、CH-250型超聲波清洗機(jī)(天津恒奧科技公司，功率 250W，頻率33kHz)、CZX-GFlO 1-4-S-II型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海賀德實驗設(shè)備有限公司)，雙槽展開箱，Chromafinger色譜指紋圖譜解決方案軟件(珠海科曼中藥研究有限公司)。試劑、試藥甲醇、乙醇、氯仿、石油醚、環(huán)己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲酸、正己烷、 丁酮等均為分析純，可作為展開試劑可提取溶劑使用。蘆丁(批號110725-200513， 含量測定用)、槲皮苷(批號111538-200403，含量測定用)、沒食子酸對照品(批號 110831-200302，含量測定用)，均購于中國藥品生物制品檢定所。甲醇、四氫呋喃、乙腈為色譜純；水為純凈水；其它試劑均為分析純。藥材12批頭花寥藥材采自貴州施秉頭花寥規(guī)范化種植研究與GAP試驗示范基地(表I中編號I 12)，其他頭花寥藥材為各地野生(表I中編號13 23)。經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院鑒定為寥科植物頭花寥Polygonum capitatum Buch. -Ham. ex D. Don的干燥全草或地上部分；偽品赤胚散為寥科植物赤胚散Polygonum runcinatum Buch. -Ham. var. sinense Hemsl.的干燥全草或地上部分，樣品來源詳見表I。表I :藥材樣品的來源及編號
權(quán)利要求
1.頭花寥藥材指紋圖譜的測定方法，其是照薄層色譜法測定，包括以下步驟(a)薄層點(diǎn)樣液制備稱取頭花寥藥材粉末，加水超聲處理，過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酸萃取液蒸干，殘渣用乙酸乙酯使溶解，作為頭花寥供試品溶液；以及任選地分別制備蘆丁、槲皮苷和沒食子酸的對照品溶液；(b)薄層層析采用聚酰胺薄層板，取上述供試品溶液和任選的對照品溶液點(diǎn)樣于薄層板上，用體積比為7 6.5 2.5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作為展開劑進(jìn)行展開；(c)顯色向揮干的薄層板上噴以顯色液AlCl3試液，揮盡薄層板上的殘余溶劑，置 320nm的紫外光燈下檢視熒光薄層色譜，得到頭花寥藥材的指紋圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟(a)中，所述頭花寥供試品溶液是用如下方法配制的取頭花寥藥材粉末，至容量瓶中，加水適量，超聲處理，放冷，用水定容至刻度，濾過，濾液用乙酸乙酯萃取，使乙酸乙酯液蒸干，殘渣加乙酸乙酯使溶解，即得供試品溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟(a)中超聲處理是以功率250W、頻率33kHz的條件超聲處理15 60min。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟(a)中，所述頭花寥供試品溶液是用如下方法配制的取頭花寥藥材粉末2g，至25mL容量瓶中，加水25mL，以功率250W、頻率33kHz超聲處理30min，放冷，用水定容至刻度，濾過，濾液用乙酸乙酯萃取3次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加5mL乙酸乙酯使溶解，即得供試品溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟(a)中，還包括分別制備蘆丁、槲皮苷和沒食子酸的對照品溶液的操作，其步驟是分別精密稱取干燥至恒重的蘆丁、槲皮苷、沒食子酸對照品適量，用甲醇制成濃度分別為0. 5±0. 05mg/mL、0. 1±0. 02mg/mL、0. 1±0. 02mg/mL的對照品溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟(b)中，點(diǎn)樣液的體積為2 IOiiL、點(diǎn)樣液點(diǎn)樣于距薄層板底邊IOmm處、和或展開距離為7 15cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟(b)中，使用體積比為7: 6.5 : 2.5 : 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液進(jìn)行二次展開。
8.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟(b)中，所述展開是在雙槽展開箱的一側(cè)加入上述展開溶劑進(jìn)行預(yù)平衡，溫度20°C，相對濕度至小于88%的條件下進(jìn)行的。
9.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟(b)是以如下方式操作的采用聚酰胺薄層板，取供試品溶液、對照品溶液各4 u L，用半自動點(diǎn)樣儀點(diǎn)于距薄層板底邊IOmm處；用體積比為 7 : 6.5 : 2.5 : 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作為展開劑；在溫度20°C、相對濕度至小于88%的條件下于雙槽展開箱的一側(cè)加入上述展開溶劑預(yù)平衡15min，上行展開，展距8cm;用體積比為7 6.5 2.5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作為展開劑進(jìn)行二次展開，即可。
10.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟(c)中，所述檢視可以是肉眼觀察、照相處理和/ 或掃描儀掃描。
11.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中還包括步驟(d)對薄層色譜圖進(jìn)行分析包括5個共有峰/斑點(diǎn)的薄層色譜指紋圖譜所對應(yīng)的藥材可初步判定為頭花寥藥材正品，無5個共有峰/斑點(diǎn)則可判定為偽品。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中步驟(d)中，如果藥材的第3、4號峰/斑點(diǎn)與蘆丁顯示的峰/斑點(diǎn)對應(yīng)，則可初步判定該藥材為頭花寥藥材正品，否則可判定為偽品。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中步驟(d)中，如果藥材的第4號峰/斑點(diǎn)與槲皮苷顯示的峰/斑點(diǎn)對應(yīng)，則可初步判定該藥材為頭花寥藥材正品，否則可判定為偽品。
14.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟(d)中，如果藥材的第3、4號峰/斑點(diǎn)與蘆丁顯示的峰/斑點(diǎn)對應(yīng)，并且第4號峰/斑點(diǎn)與槲皮苷顯示的峰/斑點(diǎn)對應(yīng)，則可初步判定該藥材為頭花寥藥材正品，否則可判定為偽品。
15.頭花寥制劑(例如熱淋清顆粒)以及制備該制劑的頭花寥提取的指紋圖譜的測定方法，其是照薄層色譜法測定，包括以下步驟(a)薄層點(diǎn)樣液制備稱取頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物，用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酸萃取液蒸干，殘渣用乙酸乙酯使溶解，作為頭花寥供試品溶液；以及任選地分別制備蘆丁、槲皮苷和沒食子酸的對照品溶液；以及進(jìn)行如權(quán)利要求I至14任一項所述的步驟(b)、步驟(c)、和任選的步驟(d)的處理。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其包括以下步驟(a)薄層點(diǎn)樣液制備稱取頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物，用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酸萃取液蒸干，殘渣用乙酸乙酯使溶解，作為頭花寥供試品溶液；以及任選地分別制備蘆丁、槲皮苷和沒食子酸的對照品溶液；(b)薄層層析采用聚酰胺薄層板，取上述供試品溶液和任選的對照品溶液點(diǎn)樣于薄層板上，用體積比為7 6.5 2.5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作為展開劑進(jìn)行展開；(c)顯色向揮干的薄層板上噴以顯色液AlCl3試液，揮盡薄層板上的殘余溶劑，置 320nm的紫外光燈下檢視熒光薄層色譜，得到頭花寥制劑或者制備該制劑的頭花寥提取物的指紋圖譜。進(jìn)一步地如說明書第二方面任一實施方案所述方法的條件特征。
全文摘要
本發(fā)明涉及熱淋清顆粒和頭花蓼的薄層色譜指紋圖譜的測定方法。該方法是照薄層色譜法測定，包括以下步驟(a)薄層點(diǎn)樣液制備熱淋清顆粒或者頭花蓼藥材用水超聲處理，用乙酸乙酯萃取，得頭花蓼供試品溶液；(b)薄層層析采用聚酰胺薄層板，取上述供試品溶液和對照品溶液點(diǎn)樣于薄層板上，用體積比為7∶6.5∶2.5∶3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作為展開劑進(jìn)行展開；(c)顯色向揮干的薄層板上噴以顯色液AlCl3試液，揮盡薄層板上的殘余溶劑，置320nm的紫外光燈下檢視熒光薄層色譜，即得。本發(fā)明方法為熱淋清顆粒和頭花蓼的質(zhì)量監(jiān)測和評價提供了一種有效的新途徑。
文檔編號G01N30/95GK102608248SQ20121004466
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者唐靖雯, 張麗艷, 李孟林, 梁斌, 潘雯婷, 王尚華, 羅君, 謝宇 申請人:貴州威門藥業(yè)股份有限公司