專利名稱：熱淋清顆粒和頭花蓼tof-ms指紋圖譜測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，特別涉及中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)領(lǐng)域，具體涉及一種熱淋清顆粒及其原料藥材頭花寥的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，特別涉及熱淋清顆粒及其原料藥材頭花寥指紋圖譜的測(cè)定方法，更特別地具體涉及一種通過(guò)超高效液相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜聯(lián)用法(在本發(fā)明中可簡(jiǎn)稱為UPLC-T0F-MS)對(duì)熱淋清顆粒及藥材頭花寥進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)的方法。
背景技術(shù)：
頭花寥為寥科植物頭花寥Polygonum capitatum Buch. -Ham. ex D. Don的干燥全草或地上部分，收載于《貴州省中藥材民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003年版，具清熱利濕、抗菌消炎、利尿通淋等功效(貴州省食品藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[M].貴陽(yáng)貴州科技出版社，2003:147)。
頭花寥是貴州常用苗藥，是貴州省中藥現(xiàn)代化重點(diǎn)發(fā)展的“六大苗藥”和重點(diǎn)培育發(fā)展的“七大中藥產(chǎn)業(yè)鏈”的品種之一。本發(fā)明的申請(qǐng)人已在貴州施秉及貴陽(yáng)烏當(dāng)區(qū)建立了頭花寥規(guī)范化種植基地，并通過(guò)國(guó)家GAP認(rèn)證?，F(xiàn)在有關(guān)頭花寥GAP種植及化學(xué)成分等方面的研究已取得一定成果(孫長(zhǎng)生，韓見(jiàn)宇，楊錦綱，等.頭花寥GAP種植基地的環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].中藥研究與信息，2005, 7 (2) : 27^30)，但頭花寥藥材現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為簡(jiǎn)單，僅以單一成分槲皮素為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，無(wú)法達(dá)到真實(shí)、全面反應(yīng)藥材內(nèi)在品質(zhì)的目的。CN101091749A公開(kāi)了一種頭花寥藥材、提取物及其質(zhì)量控制方法，其中的頭花寥藥材具有如HPLC指紋圖譜，含有13個(gè)特征峰，其中色譜條件為色譜柱依利特HYPERSILODS色譜柱(4.6mmX150mm，5ym);柱溫25°C ;流動(dòng)相乙腈(A)-O. 4%磷酸⑶溶液二元梯度洗脫，重量百分比為0-30%: 100-70% ;流速0. 8mL · min—1 ;檢測(cè)波長(zhǎng)3IOnm ;進(jìn)樣量
20μ L0該發(fā)明質(zhì)控制方法對(duì)不同產(chǎn)地頭花寥進(jìn)行了考察比較，構(gòu)建了頭花寥HPLC的指紋圖譜。CN102296118A公開(kāi)了一種DNA分子標(biāo)記鑒別技術(shù)鑒別頭花寥與尼泊爾寥的方法，在該發(fā)明中，以貴州具有代表性的民族藥頭花寥為研究對(duì)象，探索使用RAro分析方法對(duì)頭花寥與尼泊爾寥進(jìn)行遺傳多樣性分析；并在RAPD的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將RAPD方法轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，為頭花寥與尼泊爾寥的藥材鑒定提供了準(zhǔn)確可靠、快速穩(wěn)定的方法。DNA分子標(biāo)記鑒別技術(shù)同樣不適合藥材的常規(guī)質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制。中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜。在現(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒(méi)有明確的情況下，中藥指紋圖譜對(duì)于有效控制中藥材或中成藥的質(zhì)量具有重要的意義。日本漢方藥主要生產(chǎn)企業(yè)在20世紀(jì)80年代就已經(jīng)在企業(yè)內(nèi)部采用高效液相指紋圖譜控制質(zhì)量。德國(guó)、法國(guó)在對(duì)銀杏葉提取物聯(lián)合開(kāi)發(fā)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物的醫(yī)療作用是提取物所得物質(zhì)群的整體作用結(jié)果，而對(duì)這樣一個(gè)整體的質(zhì)量控制，亦采用高效液相指紋圖譜方法。美國(guó)FDA最近幾年制定的植物草藥指南中已經(jīng)明確把指紋圖譜作為混合物質(zhì)群的質(zhì)量控制方法(FDA. Guidanceof Industy Botanical Drug(Draft). 2000August)。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，作為中醫(yī)理論的實(shí)踐產(chǎn)物，中藥，尤其是復(fù)方中藥，其中所含的任一成分都不能代表其整體療效。人們逐漸認(rèn)識(shí)到，現(xiàn)行的參照西藥(合成藥)質(zhì)量控制模式的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能恰當(dāng)?shù)胤从持兴巸?nèi)在的質(zhì)量。從發(fā)展趨勢(shì)看，從現(xiàn)行的質(zhì)量控制模式向一種綜合的、宏觀的、可量化的鑒別與主要有效成分含量測(cè)定結(jié)合已是發(fā)展的趨勢(shì)。中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是利用光譜或色譜手段鑒別和測(cè)定某一種或幾種有效成分、活性成分或指標(biāo)成分，以及藥典規(guī)定的常規(guī)檢查項(xiàng)目。顯然，這些質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)置是模仿了化學(xué)藥品的模式。其它國(guó)家如英國(guó)、印度、美國(guó)草藥典、日本藥局方中的漢藥及德國(guó)Commission E編輯的德國(guó)草藥專論等也采用了基本相同的內(nèi)容。對(duì)于化學(xué)藥品而言,其藥效成分為結(jié)構(gòu)清晰的單一化合物，構(gòu)效關(guān)系明確，其含量和純度直接表達(dá)其有效及安全性。然而，中醫(yī)用藥的特點(diǎn)是復(fù)方配伍，任何單一的有效或活性成分的含量高低均不能表達(dá)其整體的療效。例如，黃芪所含的黃芪甲苷(aastraga loside IV)是當(dāng)前被選擇為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的鑒別和含量測(cè)定的最為常見(jiàn)的目標(biāo)，但并沒(méi)有依據(jù)證明黃芪甲苷與黃芪的功能主治的明確聯(lián)系。同樣，黃連、黃柏、三棵針均含小檗堿，一般都以它作為檢測(cè)的目標(biāo)，但是三者的功能主治卻截然不同。復(fù)方制劑的情況就更加復(fù)雜。中醫(yī)這種不是一對(duì)一的非線性的理論和 實(shí)踐說(shuō)明中藥質(zhì)量應(yīng)該采用某種宏觀的綜合的質(zhì)量評(píng)價(jià)手段。 然而就頭花寥藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)，例如就產(chǎn)地差異對(duì)頭花寥藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，或者對(duì)藥材的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，以及就由頭花寥制備得到的提取物或者制劑，例如熱淋清顆粒，迄今為止尚無(wú)一種從整體上控制樣品質(zhì)量的適用的常規(guī)檢驗(yàn)方法。因此，本領(lǐng)域仍然需要有一從整體上控制頭花寥藥材、提取物或者制劑例如熱淋清顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)的方法，特別是可以用于頭花寥藥材真?zhèn)舞b別以及藥材、提取物或制劑簡(jiǎn)便、宏觀、可行的質(zhì)量判定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適合常規(guī)使用的用于熱淋清顆粒及其原料藥材頭花寥質(zhì)量評(píng)價(jià)的方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)采用一種獨(dú)特的超高效液相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜聯(lián)用法(在本發(fā)明中可簡(jiǎn)稱為UPLC-T0F-MS)可以有效地實(shí)現(xiàn)至少一個(gè)上述的目的，該方法可以有效地為客觀、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)熱淋清顆粒及其頭花寥藥材的品質(zhì)，為熱淋清顆粒及頭花寥藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升以及頭花寥藥材優(yōu)良種源選育、規(guī)范化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。為此，本發(fā)明第一方面提供了一種頭花寥藥材或其提取物或包含該提取物的藥物組合物的指紋圖譜的測(cè)定方法，其是照超高效液相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定，包括以下步驟(i)供試液配制稱取適量頭花寥藥材或其提取物或包含該提取物的藥物組合物粉末，加入甲醇水溶液制成混懸液，超聲處理，過(guò)濾，必要時(shí)稀釋，作為檢測(cè)用試樣；(ii)色譜及質(zhì)譜分析條件色譜柱AcquityBEH C18 柱(2. I X 100mm, I. 7 μ m)，柱溫30_50 V (例如35-45 °C,例如約 40 °C );流速0. 2_2ml/min(例如 O. 2-lml/min,例如 O. 3' 5ml/min,例如O. 35ml/min);進(jìn)樣量1-10 μ I (例如1-5 μ 1，例如2 μ I);質(zhì)譜條件離子源為ESI源；干燥氣體溫度:150-2000C (例如160-1900C ) 1800C ;毛細(xì)管電壓4500eV ;檢測(cè)模式負(fù)離子模式；噴霧壓力2. 5bar ;干燥氣(N2)流速8L/min ;掃描范圍100-2000amu ;碰撞能量IOev ;以O(shè). 1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，O. 1%甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相B，洗脫程序?yàn)樵?5-40分鐘內(nèi)使流動(dòng)相A的比率從95%降到0%并且流動(dòng)相B相應(yīng)地從5%升高到100% ；(iii)將步驟⑴試樣注入液相色譜儀中，以步驟(ii)所述條件進(jìn)行測(cè)定，獲得供試樣品的UPLC-T0F-MS總離子流色譜圖。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)中所述甲醇水溶液是濃度為0-80%的甲醇水溶液，例如濃度10-80%的甲醇水溶液，例如濃度20-80%的甲醇水溶液，例如濃度30-70%的甲醇水溶液，例如濃度40-70%的甲醇水溶液，例如約50%、約60%、約70%的甲醇水溶液。對(duì)于頭花寥水提物或者由該水提物制備的制劑而言，使用水作為步驟(i)的溶解溶劑是可行的，而對(duì)于頭花寥醇提物或者由該醇提物制備的制劑而言，使用含水醇例如含水甲醇是優(yōu)選的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)中所述混懸液的濃度為l-100mg/ml， 例如 2-50mg/ml，例如約 2、5、10、15、20、25、50mg/ml。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)中所述超聲處理的時(shí)間為5-100min，例如10-60min，例如15_50min，例如15、20、30、45、60min。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)中超聲處理是以功率250W、頻率33kHz的條件超聲處理l(T60min，優(yōu)選2(T40min，例如約 30min。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)中所述稀釋是使以藥材計(jì)的溶質(zhì)在溶液中的濃度為 l-10mg/ml,例如 2_15mg/ml,例如 3-10mg/ml,例如約 3、4、5、7· 5、10mg/ml。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)中所述稀釋使用的稀釋液是濃度為30-80%的甲醇水溶液，例如濃度40-70%的甲醇水溶液，例如約50%、約60%、約70%的甲醇水溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(i)中所述稀釋使用的稀釋液是步驟(i)中用于配制混懸液的甲醇水溶液。 根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中使用的液相色譜儀是Waters公司的UPLC系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中使用的飛行時(shí)間質(zhì)譜是Bruker公司的Q-TOF-MS系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)中所述洗脫程序如下
權(quán)利要求
1.一種頭花寥藥材或其提取物或包含該提取物的藥物組合物的指紋圖譜的測(cè)定方法，其是照超高效液相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定，包括以下步驟 (i)供試液配制稱取適量頭花寥藥材或其提取物或包含該提取物的藥物組合物粉末，加入甲醇水溶液制成混懸液，超聲處理，過(guò)濾，必要時(shí)稀釋，作為檢測(cè)用試樣； (ii)色譜及質(zhì)譜分析條件色譜柱Acquity BEH C18 柱(2. I X 100mm，I. 7 μ m)，柱溫30-50O (例如 35_45°C，例如約 40°C );流速0. 2-2ml/min (例如 O. 2_lml/min,例如 O. 3' 5ml/min,例如 O. 35ml/min);進(jìn)樣量1-10μ I (例如1_5μ1，例如2μ1);質(zhì)譜條件離子源為ESI源；干燥氣體溫度:150-2000C (例如160-1900C ) 180°C ;毛細(xì)管電壓4500eV ;檢測(cè)模式負(fù)離子模式；噴霧壓力2. 5bar ;干燥氣(N2)流速8L/min ;掃描范圍100-2000amu ;碰撞能量:IOev ;以O(shè).1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，0. 1%甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相B，洗脫程序?yàn)樵?5-40分鐘內(nèi)使流動(dòng)相A的比率從95%降到0%并且流動(dòng)相B相應(yīng)地從5%升高到100% ； (iii)將步驟(i)試樣注入液相色譜儀中，以步驟(ii)所述條件進(jìn)行測(cè)定，獲得供試樣品的UPLC-TOF-MS總離子流色譜圖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其特征是 步驟(i)中所述甲醇水溶液是濃度為0-80%的甲醇水溶液； 步驟Q)中所述混懸液的濃度為l-100mg/ml ； 步驟(i)中所述超聲處理的時(shí)間為5-100min ； 步驟Q)中所述稀釋是使以藥材計(jì)的溶質(zhì)在溶液中的濃度為l-10mg/ml ； 步驟(i)中所述稀釋使用的稀釋液是濃度為30-80%的甲醇水溶液；和/或 步驟(i)中所述洗脫程序如下
3.一種頭花寥藥材或者頭花寥醇提取物或者頭花寥醇提浸膏或其制劑指紋圖譜的測(cè)定方法，其是照超高效液相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定，包括以下步驟 (i)供試液配制稱取適量頭花寥藥材粉末，加入甲醇水溶液制成混懸液，超聲處理，過(guò)濾，必要時(shí)稀釋，作為檢測(cè)用試樣； (ii)色譜及質(zhì)譜分析條件色譜柱Acquity BEH C18 柱(2· I X 100mm, I. 7 μ m)，柱溫30_5(TC (例如 35_45°C，例如約 40°C );流速0. 2-2ml/min (例如 O. 2_lml/min,例如 O. 3-. 5ml/min,例如 O. 35ml/min);進(jìn)樣量1-10μ I (例如1_5μ1，例如2μ1);質(zhì)譜條件離子源為ESI源；干燥氣體溫度:150-2000C (例如160-1900C ) 180°C ;毛細(xì)管電壓4500eV ;檢測(cè)模式負(fù)離子模式；噴霧壓力2. 5bar ;干燥氣(N2)流速8L/min ;掃描范圍100-2000amu ;碰撞能量:IOev ;以O(shè).1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，0. 1%甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相B，洗脫程序?yàn)樵?5-40分鐘內(nèi)使流動(dòng)相A的比率從95%降到0%并且流動(dòng)相B相應(yīng)地從5%升高到100% ； (iii)將步驟(i)試樣注入液相色譜儀中，以步驟(ii)所述條件進(jìn)行測(cè)定，獲得供試樣品的UPLC-TOF-MS總離子流色譜圖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征是 步驟(i)中所述甲醇水溶液是濃度為30-80%的甲醇水溶液； 步驟⑴中所述混懸液的濃度為l-100mg/ml ； 步驟(i)中所述超聲處理的時(shí)間為5-100min ； 步驟Q)中所述稀釋是使以藥材計(jì)的溶質(zhì)在溶液中的濃度為l-10mg/ml ； 步驟(i)中所述稀釋使用的稀釋液是濃度為30-80%的甲醇水溶液；和/或 步驟(i)中所述洗脫程序如下
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中測(cè)試頭花寥藥材或者其醇提浸膏或該醇提浸膏的制劑所指認(rèn)的色譜峰及其對(duì)應(yīng)物質(zhì)至少包括
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中測(cè)試頭花寥藥材或者其醇提浸膏或該醇提浸膏的制劑所指認(rèn)的色譜峰及其對(duì)應(yīng)物質(zhì)包括
7.一種頭花寥制劑(例如熱淋清顆粒)或者制備該制劑的頭花寥提取物或者頭花寥水提取物的指紋圖譜的測(cè)定方法，其是照超高效液相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定，包括以下步驟 (i)供試液配制稱取適量頭花寥制劑或頭花寥提取物的粉末，加入甲醇水溶液制成混懸液，超聲處理，過(guò)濾，必要時(shí)稀釋，作為檢測(cè)用試樣； (ii)色譜及質(zhì)譜分析條件色譜柱Acquity BEH C18 柱(2. I X 100mm，I. 7 μ m)，柱溫30-50O (例如 35_45°C， 例如約 40°C );流速0. 2-2ml/min (例如 O. 2_lml/min,例如 O. 3' 5ml/min,例如 O. 35ml/ min);進(jìn)樣量1-10μ I (例如1_5μ1，例如2μ1);質(zhì)譜條件離子源為ESI源；干燥氣體溫度:150-2000C (例如160-190°C )180°C ;毛細(xì)管電壓4500eV ;檢測(cè)模式負(fù)離子模式；噴霧壓力2. 5bar ;干燥氣(N2)流速8L/min ;掃描范圍100-2000amu ;碰撞能量:IOev ;以O(shè).1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，0. 1%甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相B，洗脫程序?yàn)樵?5-40分鐘內(nèi)使流動(dòng)相A的比率從95%降到0%并且流動(dòng)相B相應(yīng)地從5%升高到100% ； (iii)將步驟(i)試樣注入液相色譜儀中，以步驟(ii)所述條件進(jìn)行測(cè)定，獲得供試樣品的UPLC-TOF-MS總離子流色譜圖。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征是 步驟(i)中所述甲醇水溶液是濃度為0-80%的甲醇水溶液； 步驟⑴中所述混懸液的濃度為l-100mg/ml ； 步驟(i)中所述超聲處理的時(shí)間為5-100min ； 步驟Q)中所述稀釋是使以藥材計(jì)的溶質(zhì)在溶液中的濃度為l-10mg/ml ； 步驟(i)中所述稀釋使用的稀釋液是濃度為30-80%的甲醇水溶液；和/或 步驟(i)中所述洗脫程序如下
9.如熱淋清顆粒)以及制備該制劑的頭花寥提取物所指認(rèn)的色譜峰及其對(duì)應(yīng)物質(zhì)至少包括
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中測(cè)試頭花寥制劑(例如熱淋清顆粒)以及制備該制劑的頭花寥提取物所指認(rèn)的色譜峰及其對(duì)應(yīng)物質(zhì)包括
全文摘要
本發(fā)明涉及熱淋清顆粒和頭花蓼的指紋圖譜測(cè)定方法。具體地，本發(fā)明頭花蓼藥材或其提取物或包含該提取物的藥物組合物的指紋圖譜的測(cè)定方法，其是照超高效液相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定，包括以下步驟(i)供試液配制稱取適量試樣加入甲醇水溶液制成混懸液，超聲處理；(ii)提供UPLC-TOF-MS色譜及質(zhì)譜分析條件；(iii)將步驟(i)試樣注入液相色譜儀中，以步驟(ii)所述條件進(jìn)行測(cè)定，獲得供試樣品的UPLC-TOF-MS總離子流色譜圖。本發(fā)明方法可以有效地用于頭花蓼藥材或其提取物或制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102809618SQ201210299950
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月22日
發(fā)明者梁斌, 姜志宏, 張麗艷, 李孟林, 謝宇, 唐靖雯, 潘梅 申請(qǐng)人:貴州威門藥業(yè)股份有限公司