專利名稱：可溶性血小板t細(xì)胞活化抗原1(cd226)的定量檢測(cè)方法
一、所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及可溶性免疫細(xì)胞膜分子的一種免疫學(xué)檢測(cè)方法，特別涉及可溶性血小板T細(xì)胞活化抗原1(PTA1，CD226)的一種定量檢測(cè)方法。
此方法的包被mAb為L(zhǎng)eoA1，工作濃度為5mg/L。夾心抗體為兔多抗血清，工作濃度為20mg/L。操作流程用包被mAb包被ELISA板，保濕，4℃放置24h；洗板后加入標(biāo)準(zhǔn)品CD226/Fc融合蛋白，37℃孵育1h；洗板后加兔多抗血清，37℃孵育1h；洗板后加辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體，37℃孵育1h；洗板后以ABTS底物顯色，于波長(zhǎng)405nm測(cè)定光吸收值。檢測(cè)敏感性為100ng/L根據(jù)申請(qǐng)人所進(jìn)行的資料檢索，國(guó)內(nèi)外尚無其他有關(guān)檢測(cè)sCD226/PTA1夾心ELISA方法的報(bào)道。
CD226是2000年在第7屆人類白細(xì)胞分化抗原國(guó)際協(xié)作組會(huì)議和專題討論會(huì)上被命名的新的CD分子，是金伯泉研究小組主要參與申請(qǐng)并為我國(guó)首次獲準(zhǔn)的新的CD分子，被評(píng)為我國(guó)2000年十大科技新聞之一。CD226原名血小板T細(xì)胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen 1，PTA1)，表達(dá)于活化T細(xì)胞、NK細(xì)胞、血小板和活化內(nèi)皮細(xì)胞。CD226/PTA1參與調(diào)節(jié)CTL分化以及CTL和NK細(xì)胞的殺傷，參與細(xì)胞之間的黏附以及血小板的活化與凝集，并可能參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。CD226/PTA1在血清中存在著可溶性形式(sCD226/PTA1)。以往研究發(fā)現(xiàn)，CD226/PTA1與多種自身免疫性疾病、病毒感染性疾病和血小板功能異常性疾病相關(guān)，正常人血清中存在sCD226/PTA1，某些病毒感染性疾病以及自身免疫病患者血清sCD226/PTA1升高。因此，建立檢測(cè)sCD226/PTA1 ELISA試劑盒在科研和臨床上都具有應(yīng)用價(jià)值。
多抗血清用于夾心ELISA，主要不足之處是兔多抗血清效價(jià)個(gè)體間差異較大，給檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化帶來一定困難；此外，檢測(cè)步驟較多，操作時(shí)間較長(zhǎng)。
為實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是用兩株針對(duì)CD226/PTA1胞膜外區(qū)不同表位的mAb替代一株mAb與兔多抗的搭配，用HRP-mAb替代兔多抗及其同HRP-羊抗兔抗體的結(jié)合反應(yīng)；制備了多株可識(shí)別CD226/PTA1分子胞膜外區(qū)的不同表位的mAb，并通過交叉配對(duì)選擇出可用于夾心ELISA的最佳搭配，然后對(duì)工作條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過簡(jiǎn)化的實(shí)施步驟測(cè)得標(biāo)本的sCD226/PTA1水平。
本發(fā)明的其他一些特點(diǎn)是，包被mAb為L(zhǎng)eoA1，夾心抗體為HRP標(biāo)記的mAbFMU3，即HRP-FMU3。
優(yōu)化的工作條件是①包被mAb的工作濃度為2.5mg/L；②標(biāo)準(zhǔn)品抗原為CD226/Fc融合蛋白，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為0.1％BSA-0.1％Tween20-PBS；標(biāo)準(zhǔn)品最高工作濃度約為1.8μg/L，倍比稀釋7個(gè)梯度作標(biāo)準(zhǔn)曲線；③HRP-FMU3的稀釋液為3％PEG-PBS，最佳工作濃度為1.36mg/L(按mAbFMU3的量計(jì)算)。
所述簡(jiǎn)化的實(shí)施步驟為①用50m mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖液稀釋包被mAb LeoA1，加入96孔板，100μl/孔，保濕，4℃放置24h；②用洗滌液洗板3次，加入工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品CD226/Fc融合蛋白和待測(cè)標(biāo)本，100μl/孔，37℃孵育45min；③洗板3次，加入工作濃度的HRP-FMU3，100μl/孔，37℃孵育45min；洗板3次，以TMB底物顯色，2.5mol/L H2SO4終止；④于波長(zhǎng)450nm測(cè)定光吸收(A)值；⑤以標(biāo)準(zhǔn)品的A值和相應(yīng)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)標(biāo)本的A值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，計(jì)算待測(cè)標(biāo)本的sCD226/PTA1水平。
本發(fā)明提高了檢測(cè)sCD226/PTA1的敏感性和特異性，有良好的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性，縮短了操作時(shí)間，降低了成本。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
按照本發(fā)明的技術(shù)方案，可溶性血小板T細(xì)胞活化抗原1(CD226)的定量檢測(cè)方法，用兩株針對(duì)CD226/PTA1胞膜外區(qū)不同表位的mAb替代一株mAb與兔多抗的搭配，用HRP-mAb替代兔多抗及其同HRP-羊抗兔抗體的結(jié)合反應(yīng)。
1.首先制備了多株可識(shí)別CD226/PTA1分子胞膜外區(qū)的不同表位的mAb，并通過交叉配對(duì)選擇出可用于夾心ELISA的最佳搭配包被mAb為L(zhǎng)eoA1，夾心抗體為HRP標(biāo)記的mAb FMU3，即HRP-FMU3。
2.然后對(duì)本發(fā)明的工作條件進(jìn)行了優(yōu)化①包被mAb的工作濃度為2.5mg/L；②標(biāo)準(zhǔn)品抗原為CD226/Fc融合蛋白，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為0.1％BSA-0.1％Tween20-PBS；標(biāo)準(zhǔn)品最高工作濃度約為1.8μg/L，倍比稀釋7個(gè)梯度作標(biāo)準(zhǔn)曲線；③HRP-FMU3的稀釋液為3％PEG-PBS，最佳工作濃度為1.36mg/L(按mAbFMU3的量計(jì)算)。
3.本發(fā)明的具體實(shí)施步驟用50m mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖液稀釋包被mAbLeoA1，加入96孔板(Nunc.公司Maxisorp)，100μl/孔，保濕，4℃放置24h。用洗滌液(0.1％ Tween20-PBS，下同)洗板3次，加入工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品CD226/Fc融合蛋白和待測(cè)標(biāo)本，100μl/孔，37℃孵育45min。洗板3次，加入工作濃度的HRP-FMU3，100μl/孔，37℃孵育45min。洗板3次，以TMB底物顯色(100μl/孔，37℃約5□10min)，2.5mol/L H2SO4終止。于波長(zhǎng)450nm測(cè)定光吸收(A)值。以標(biāo)準(zhǔn)品的A值和相應(yīng)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)標(biāo)本的A值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，計(jì)算待測(cè)標(biāo)本的sCD226/PTA1水平。
以下是發(fā)明人按本發(fā)明的技術(shù)方案所完成的實(shí)施例1.銀屑病患者30例，正常人15例。結(jié)果 銀屑病患者血清中sCD226/PTA1水平(823.9±569.9ng/L)顯著高于正常人(120.5±58.4ng/L)，t＝4.41，p＜0.001。活動(dòng)期患者血清中sCD226/PTA1水平(1036.1±599.0ng/L)明顯高于靜止期患者(546.4±399.3ng/L)?；颊咧委熀笱逅?263.2±207.3ng/L)顯著低于治療前血清水平(751.5±648.1ng/L)，t＝3.425，p＜0.005。
2.腎綜合征出血熱患者69例，正常人52例。結(jié)果正常人血清sCD226/PTA1的平均水平為143□55ng/L，腎綜合征出血熱患者血清sCD226/PTA1的水平明顯升高，平均為317□223ng/L，為正常人水平的2.2倍(P＜0.01)。
綜上所述，本發(fā)明提高了檢測(cè)sCD226/PTA1的敏感性和特異性，有良好的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性，縮短了操作時(shí)間，降低了成本。
權(quán)利要求
1.可溶性血小板T細(xì)胞活化抗原1(CD226)的定量檢測(cè)方法，其特征在于用兩株針對(duì)CD226/PTA1胞膜外區(qū)不同表位的mAb替代一株mAb與兔多抗的搭配，用HRP-mAb替代兔多抗及其同HRP-羊抗兔抗體的結(jié)合反應(yīng)，制備了多株可識(shí)別CD226/PTA1分子胞膜外區(qū)的不同表位的mAb，并通過交叉配對(duì)選擇出可用于夾心ELISA的最佳搭配，然后對(duì)工作條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過簡(jiǎn)化的實(shí)施步驟后測(cè)得標(biāo)本的sCD226/PTA1水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溶性血小板T細(xì)胞活化抗原1(CD226)的定量檢測(cè)方法，其特征在于所述夾心ELISA的最佳搭配包被mAb為L(zhǎng)eoA1，夾心抗體為HRP標(biāo)記的mAb FMU3，即HRP-FMU3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溶性血小板T細(xì)胞活化抗原1(CD226)的定量檢測(cè)方法，其特征在于所述優(yōu)化的工作條件是①包被mAb的工作濃度為2.5mg/L；②標(biāo)準(zhǔn)品為CD226/Fc融合蛋白，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為0.1％BSA-0.1％Tween20-PBS；標(biāo)準(zhǔn)品最高工作濃度約為1.8μg/L，倍比稀釋7個(gè)梯度作標(biāo)準(zhǔn)曲線；③HRP-FMU3的稀釋液為3％PEG-PBS，最佳工作濃度為1.36mg/L(按mAbFMU3的量計(jì)算)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溶性血小板T細(xì)胞活化抗原1(CD226)的定量檢測(cè)方法，其特征在于所述簡(jiǎn)化的實(shí)施步驟為①用50m mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖液稀釋包被mAb LeoA1，加入96孔板，100μl/孔，保濕，4℃放置24h；②洗板，加入工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)標(biāo)本，100μl/孔，37℃孵育45min；③洗板，加入工作濃度的HRP-FMU3，100μl/孔，37℃孵育45min；洗板，以TMB底物顯色，2.5mol/L H2SO4終止；④于波長(zhǎng)450nm測(cè)定光吸收(A)值；⑤以標(biāo)準(zhǔn)品的A值和相應(yīng)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)標(biāo)本的A值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，計(jì)算待測(cè)標(biāo)本的sCD226/PTA1水平。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可溶性血小板T細(xì)胞活化抗原1(CD226)雙mAb夾心ELISA定量檢測(cè)方法。首先制備了多株可識(shí)別CD226/PTA1分子胞膜外區(qū)的不同表位的mAb,并通過交叉配對(duì)選擇出可用于夾心ELISA的最佳搭配,然后對(duì)工作條件進(jìn)行了優(yōu)化,具體步驟是:用緩沖液稀釋包被mAb LeoA1,保濕,4℃放置24h。用洗滌液洗板,加入工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品CD226/Fc融合蛋白和待測(cè)標(biāo)本,37℃孵育45min。洗板,加入工作濃度的HRP－FMU3,37℃孵育45min。洗板,以TMB底物顯色,2.5mol/LH
文檔編號(hào)G01N33/50GK1387043SQ0211462
公開日2002年12月25日 申請(qǐng)日期2002年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月11日
發(fā)明者金伯泉, 賈衛(wèi), 寧雙飛 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)