靶組織特異性抗原結(jié)合分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，通過發(fā)明包含抗原結(jié)合活性依賴于靶組織特異性化合物的濃度而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，可以解決上述課題。通過使用本申請發(fā)明的抗原結(jié)合分子，可以靶組織特異性地治療起因于靶組織的各種疾病。
【專利說明】靶組織特異性抗原結(jié)合分子

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供：包含抗原結(jié)合活性根據(jù)靶組織特異性化合物的濃度而變化的抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子、該抗原結(jié)合分子的制造方法和篩選方法、以及包含該抗原結(jié)合 分子的藥物組合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 抗體在血漿中的穩(wěn)定性高、副作用也少，因此作為藥品而受到關(guān)注。其中，有多種 IgG型的抗體藥物已上市，目前還有多種抗體藥物正在開發(fā)中（非專利文獻(xiàn)1、和非專利文 獻(xiàn)2)。
[0003] 作為使用了抗體藥物的癌治療藥，迄今為止針對CD20抗原的利妥昔單 抗（Rituxan)、針對EGFR抗原的西妥昔單抗（cetuximab)、針對HER2抗原的赫賽汀 (herceptin)等已得到認(rèn)可(非專利文獻(xiàn)3)。這些抗體分子與表達(dá)于癌細(xì)胞的抗原結(jié)合，通 過ADCC等發(fā)揮對癌細(xì)胞的傷害活性。已知這種基于ADCC等的細(xì)胞毒性依賴于表達(dá)于治療 用抗體的靶細(xì)胞的抗原的數(shù)目（非專利文獻(xiàn)4)，因此從治療用抗體的效果的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選 作為靶的抗原的表達(dá)量高。但是，即使抗原的表達(dá)量高，若抗原表達(dá)于正常組織，則會對正 常細(xì)胞發(fā)揮ADCC等的傷害活性，因而造成副作用大的問題。因此，作為癌治療藥的治療用 抗體的靶抗原優(yōu)選特異性地表達(dá)于癌細(xì)胞。例如，針對已知作為癌抗原的EpCAM抗原的抗 體分子被認(rèn)為有望作為癌治療藥，但已知EpCAM抗原在胰腺也有表達(dá)，實(shí)際上據(jù)報道，在臨 床試驗(yàn)中，通過給予抗EpCAM抗體，由于對胰腺的細(xì)胞毒性，觀察到了胰腺炎的副作用（非 專利文獻(xiàn)5)。
[0004] 獲得發(fā)揮基于ADCC活性的細(xì)胞毒性的抗體藥物的成功后，報道了通過下述等而 發(fā)揮強(qiáng)效的細(xì)胞毒性的第二代的改良抗體分子：通過除去天然型人IgGl的Fc區(qū)的N型糖 鏈的巖藻糖而實(shí)現(xiàn)的ADCC活性的增強(qiáng)(非專利文獻(xiàn)6)、通過天然型人IgGl的Fc區(qū)的氨基 酸替換而增強(qiáng)對Fe γ RIIIa的結(jié)合所實(shí)現(xiàn)的ADCC活性的增強(qiáng)（非專利文獻(xiàn)7)等。作為通 過上述的NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC活性以外的機(jī)制而對癌細(xì)胞發(fā)揮傷害活性的抗體藥物，還報 道了通過下述等而發(fā)揮強(qiáng)效的細(xì)胞毒性的改良分子抗體：將具有強(qiáng)效的細(xì)胞毒性的藥物與 抗體形成綴合物的Antibody Drug Conjugate (ADC)(非專利文獻(xiàn)8)、和通過將T細(xì)胞補(bǔ) 充至癌細(xì)胞而發(fā)揮對癌細(xì)胞的傷害活性的低分子抗體(非專利文獻(xiàn)9)等。
[0005] 如此發(fā)揮強(qiáng)效細(xì)胞毒性的抗體分子即使對抗原的表達(dá)不多的癌細(xì)胞也可發(fā)揮細(xì) 胞毒性，另一方面，對抗原的表達(dá)少的正常組織卻也同樣地發(fā)揮細(xì)胞毒性。實(shí)際上，與針 對EGFR抗原的天然型人IgGl即西妥昔單抗相比，針對CD3和EGFR的雙特異性抗體即 EGFR-BiTE通過將T細(xì)胞補(bǔ)充至癌細(xì)胞而對癌細(xì)胞發(fā)揮強(qiáng)效的細(xì)胞毒性，從而可發(fā)揮抗腫 瘤效果。另一方面，EGFR在正常組織中也有表達(dá)，因此在將EGFR-BiTE給予食蟹猴時也確 認(rèn)到出現(xiàn)了嚴(yán)重的副作用（非專利文獻(xiàn)10)。另外，使針對癌細(xì)胞中大量表達(dá)的CD44v6的抗 體與mertansine結(jié)合而成的ADC即bivatuzumab mertansine，由于CD44v6在正常組織中 也有表達(dá)，因而在臨床上觀察到嚴(yán)重的皮膚毒性和肝毒性(非專利文獻(xiàn)11)。
[0006] 如此，在使用對抗原的表達(dá)少的癌細(xì)胞也可以發(fā)揮強(qiáng)效的細(xì)胞毒性的抗體時，需 要靶抗原高度癌特異性地表達(dá)，但如赫賽汀的靶抗原即HER2或西妥昔單抗的靶抗原即 EGFR在正常組織中也有表達(dá)那樣，認(rèn)為高度癌特異性地表達(dá)的癌抗原的數(shù)目是有限的。因 此，雖然能夠強(qiáng)化對癌的細(xì)胞毒性，但對正常組織的細(xì)胞毒性作用導(dǎo)致的副作用也成為問 題。
[0007] 另外，最近，通過抑制有助于癌中的免疫抑制的CTLA4而增強(qiáng)腫瘤免疫的易普利 姆瑪（ipilimumab)對轉(zhuǎn)移性黑素瘤顯示出總存活期的延長(非專利文獻(xiàn)12)。然而由于易 普利姆瑪全身性地抑制CTLA4,因而雖然腫瘤免疫得到增強(qiáng)，但顯示全身性地免疫受到活化 所致的自身免疫疾病樣的嚴(yán)重副作用卻成為問題(非專利文獻(xiàn)13)。
[0008] 另一方面，作為針對癌以外的疾病的抗體藥物，已知在炎性·自身免疫疾病中通過 抑制炎性細(xì)胞因子來發(fā)揮治療效果的抗體藥物(非專利文獻(xiàn)14)。還已知，例如以TNF作為 革巴的Remicade或Humira、以及以IL-6R為祀的Actemra雖然對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)揮高的治療 效果，但另一方面，由于全身性地中和這些細(xì)胞因子而觀察到感染疾病的副作用（非專利文 獻(xiàn) 15)。
[0009] 作為可適用于第二代抗體藥物的技術(shù)，開發(fā)有各種技術(shù)，報道了使效應(yīng)功能、抗原 結(jié)合能力、藥物動力學(xué)、穩(wěn)定性提高，或者使免疫原性風(fēng)險降低的技術(shù)等(非專利文獻(xiàn)16)， 但基本沒有報道用于解決如上所述的副作用的、能夠靶組織特異性地使抗體藥物作用的技 術(shù)。例如，對于癌組織或炎性組織之類的病變部位，報道有利用了這些靶組織中的pH為酸 性條件的PH依賴性抗體(專利文獻(xiàn)1、和2)。然而，癌組織或炎性組織中的相比于正常組織 的PH的降低（即氫離子濃度的上升）很小，檢測分子量極小的氫離子的濃度的微小上升而 作用的抗體的制作困難，同時破骨細(xì)胞骨吸收區(qū)等正常組織或?qū)ο蟛∽円酝獾慕M織中也有 PH為酸性條件的情形，將pH的條件作為對病變部位特異性的環(huán)境因子來利用被認(rèn)為還具 有許多問題。另一方面，報道有通過被在癌組織或炎性組織之類的病變部位表達(dá)的蛋白酶 切斷從而開始發(fā)揮抗原結(jié)合活性的抗體的制作方法(專利文獻(xiàn)3)。但是，利用蛋白酶的抗體 的切斷是不可逆的，因此在該病變部位被切斷的抗體隨著血流返回到正常組織，在正常組 織中也可以與抗原結(jié)合，這被認(rèn)為是問題。另外，認(rèn)為這樣的蛋白酶的癌特異性方面也存在 問題。因此，還不知道為了在避免副作用的同時發(fā)揮藥效而在正常組織或血液中不全身性 地作用，在作為病變部位的癌或炎性部位中可逆性地作用那樣的技術(shù)。
[0010] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)1 :國際公開第W02003/105757號 專利文獻(xiàn)2 :國際公開第W02012/033953號 專利文獻(xiàn)3 :國際公開第W02010/081173號 非專利文獻(xiàn)

【權(quán)利要求】
1. 抗原結(jié)合分子，其含有抗原結(jié)合活性根據(jù)靶組織特異性化合物的濃度而變化的抗原 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
2. 權(quán)利要求1所述的抗原結(jié)合分子，其中，靶組織是癌組織。
3. 權(quán)利要求2所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述癌組織特異性化合物是癌細(xì)胞特異性 代謝產(chǎn)物、浸潤于癌組織的免疫細(xì)胞特異性代謝產(chǎn)物、癌組織的基質(zhì)細(xì)胞特異性代謝產(chǎn)物。
4. 權(quán)利要求1所述的抗原結(jié)合分子，其中，靶組織是炎性組織。
5. 權(quán)利要求4所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述炎性組織特異性化合物是浸潤于炎性 組織的免疫細(xì)胞特異性代謝產(chǎn)物、在炎性組織中受傷害的正常細(xì)胞特異性代謝產(chǎn)物。
6. 權(quán)利要求1所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述化合物是選自下述中的至少一種化合 物：具有嘌呤環(huán)結(jié)構(gòu)的核苷、氨基酸及其代謝產(chǎn)物、脂質(zhì)及其代謝產(chǎn)物、或糖代謝的一次代 謝產(chǎn)物、煙酰胺及其代謝產(chǎn)物。
7. 權(quán)利要求6所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述化合物是選自下述中的至少一種化合 物：腺苷、三磷酸腺苷、肌苷、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、犬尿氨酸、前列腺素 E2、琥珀酸、檸 檬酸、或1-甲基煙酰胺。
8. 權(quán)利要求1至7中任一項所述的抗原結(jié)合分子，其中，抗原是膜型分子。
9. 權(quán)利要求1至8中任一項所述的抗原結(jié)合分子，其為具有中和活性的抗原結(jié)合分子。
10. 權(quán)利要求1至9中任一項所述的抗原結(jié)合分子，其為具有細(xì)胞毒性的抗原結(jié)合分 子。
11. 權(quán)利要求1至10中任一項所述的抗原結(jié)合分子，其含有Fc區(qū)。
12. 權(quán)利要求11所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)是SEQ ID NO:5、6、7或8中記 載的恒定區(qū)所含的Fc區(qū)。
13. 權(quán)利要求11所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)包括Fc y R結(jié)合改變Fc區(qū)，該 Fc y R結(jié)合改變Fc區(qū)的Fc Y受體結(jié)合活性比天然型人IgG的Fc區(qū)的Fc Y受體結(jié)合活性 商。
14. 權(quán)利要求13所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc y R結(jié)合改變Fc區(qū)的氨基酸序列 中，選自以EU編號表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249 位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266 位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279 位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293 位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305 位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327 位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376 位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421位、427位、428位、429位、434位、436位或440位的氨基酸中的至少一個以上的氨 基酸包含與天然型人IgG的Fc區(qū)的氨基酸不同的氨基酸。
15. 權(quán)利要求14所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述FcyR結(jié)合改變Fc區(qū)的氨基酸序列 中，包含以EU編號表示的選自下述中的至少一個以上的氨基酸： 221位的氨基酸為Lys或Tyr中的任一者， 222位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一者， 223位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中的任一者， 224位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一者， 225位的氨基酸為Glu、Lys或Trp中的任一者， 227位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一者， 228位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一者， 230位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一者， 231位的氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一者， 232位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一者， 233 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、 Val、Trp或Tyr中的任一者， 234 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、 Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一者， 235 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、 Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一者， 236 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、 Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一者， 237 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Th;r、 Val、Trp或Tyr中的任一者， 238 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、 Val、Trp或Tyr中的任一者， 239 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、 Val、Trp或Tyr中的任一者， 240位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一者， 241位的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一者， 243位的氨基酸為Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp或Tyr中的任一者， 244位的氨基酸為His， 245位的氨基酸為Ala， 246位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一者， 247 位的氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一者， 249位的氨基酸為Glu、His、Gin或Tyr中的任一者， 250位的氨基酸為Glu或Gin中的任一者， 251位的氨基酸為Phe， 254位的氨基酸為Phe、Met或Tyr中的任一者， 255位的氨基酸為Glu、Leu或Tyr中的任一者， 256位的氨基酸為Ala、Met或Pro中的任一者， 258位的氨基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一者， 260位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一者， 262位的氨基酸為Ala、Glu、Phe、lie或Thr中的任一者， 263位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一者， 264 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、 Thr、Trp或Tyr中的任一者， 265 位的氨基酸為 Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、 Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一者， 266位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一者， 267 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、 Trp或Tyr中的任一者， 268 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Trp中的任一者， 269 位的氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一者， 270 位的氨基酸為 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或 Tyr中的任一者， 271 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、 Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一者， 272 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一者， 273位的氨基酸為Phe或lie中的任一者， 274 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、 Trp或Tyr中的任一者， 275位的氨基酸為Leu或Trp中的任一者， 276 位的氨基酸為、六8卩、6111、卩116、617、1118、116、1^11、]^七、？1'0、六作、361'、1'111'、/81、1'印 或Tyr中的任一者， 278 位的氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、 Val或Trp中的任一者， 279位的氨基酸為Ala， 280 位的氨基酸為 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一者， 281位的氨基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一者， 282位的氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一者， 283 位的氨基酸為 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一者， 284位的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一者， 285位的氨基酸為Asp、Glu、Lys、Gin、Trp或Tyr中的任一者， 286位的氨基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一者， 288位的氨基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一者， 290 位的氨基酸為 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一者， 291位的氨基酸為Asp、Glu、Gly、His、lie、Gin或Thr中的任一者， 292位的氨基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一者， 293 位的氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一者， 294 位的氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一者， 295 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、 Trp或Tyr中的任一者， 296 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr 或Val中的任一者， 297 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、 Val、Trp或Tyr中的任一者， 298 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一者， 299 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、 Ser、Val、Trp 或 Tyr 中的任一者， 300 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、 Thr、Val或Trp中的任一者， 301位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一者， 302位的氨基酸為lie， 303位的氨基酸為Asp、Gly或Tyr中的任一者， 304位的氨基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一者， 305位的氨基酸為Glu、lie、Thr或Tyr中的任一者， 311位的氨基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一者， 313位的氨基酸為Phe， 315位的氨基酸為Leu， 317位的氨基酸為Glu或Gln， 318 位的氨基酸為 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一者， 320 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中 的任一者， 322 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任 一者， 323位的氨基酸為lie， 324 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中 的任一者， 325 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、 Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一者， 326 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一者， 327 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、 Val、Trp或Tyr中的任一者， 328 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、 Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一者， 329 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、 Val、Trp或Tyr中的任一者， 330 位的氨基酸為 Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Th;r、 Val、Trp或Tyr中的任一者， 331 位的氨基酸為 Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任 一者， 332 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、 Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一者， 333 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val 或 Tyr中的任一者， 334位的氨基酸為Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro或Thr中的任一者， 335 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr中的任一者， 336位的氨基酸為Glu、Lys或Tyr中的任一者， 337位的氨基酸為Glu、His或Asn中的任一者， 339 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser 或 Thr 中的任一者， 376位的氨基酸為Ala或Val中的任一者， 377位的氨基酸為Gly或Lys中的任一者， 378位的氨基酸為Asp， 379位的氨基酸為Asn， 380位的氨基酸為Ala、Asn或Ser中的任一者， 382位的氨基酸為Ala或lie中的任一者， 385位的氨基酸為Glu， 392位的氨基酸為Thr， 396位的氨基酸為Leu， 421位的氨基酸為Lys， 427位的氨基酸為Asn， 428位的氨基酸為Phe或Leu中的任一者， 429位的氨基酸為Met， 434位的氨基酸為Trp， 436位的氨基酸為lie、或者 440位的氨基酸為Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一者。
16. 權(quán)利要求11所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)是以結(jié)合于Fc區(qū)的EU編號 297位的糖鏈的組成中結(jié)合有巖藻糖缺陷糖鏈的Fc區(qū)的比例變高的方式、或添加有平分型 N-乙酰葡糖胺的Fc區(qū)的比例變高的方式進(jìn)行了修飾的Fc區(qū)。
17. 權(quán)利要求11或13至16中任一項所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)的在pH酸 性范圍條件下的FcRn結(jié)合活性與SEQ ID N0:5、6、7或8中任一者所示的Fc區(qū)的FcRn結(jié) 合活性相比增強(qiáng)。
18. 權(quán)利要求17所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)是在SEQ ID NO:5、6、7或8中 記載的恒定區(qū)所含的Fc區(qū)的氨基酸序列中，選自以EU編號表示的238位、244位、245位、 249 位、250 位、251 位、252 位、253 位、254 位、255 位、256 位、257 位、258 位、260 位、262 位、 265 位、270 位、272 位、279 位、283 位、285 位、286 位、288 位、293 位、303 位、305 位、307 位、 308 位、309 位、311 位、312 位、314 位、316 位、317 位、318 位、332 位、339 位、340 位、341 位、 343 位、356 位、360 位、362 位、375 位、376 位、377 位、378 位、380 位、382 位、385 位、386 位、 387 位、388 位、389 位、400 位、413 位、415 位、423 位、424 位、427 位、428 位、430 位、431 位、 433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位或447位中的至少一個以上的 氨基酸被替換的Fc區(qū)。
19. 權(quán)利要求18所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)在SEQ ID NO: 5、6、7或8中記 載的恒定區(qū)所含的Fc區(qū)的氨基酸序列中，包含以EU編號表示的選自下述中的至少一個以 上的氨基酸： 238位的氨基酸為Leu， 244位的氨基酸為Leu， 245位的氨基酸為Arg， 249位的氨基酸為Pro， 250位的氨基酸為Gin或Glu中的任一者，或者 251位的氨基酸為Arg、Asp、Glu、或Leu中的任一者， 252位的氨基酸為Phe、Ser、Thr、或Tyr中的任一者， 254位的氨基酸為Ser或Thr中的任一者， 255位的氨基酸為Arg、Gly、lie、或Leu中的任一者， 256 位的氨基酸為 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro、或 Thr 中的任一者， 257位的氨基酸為Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中的任一者， 258位的氨基酸為Asp， 260位的氨基酸為Ser， 262位的氨基酸為Leu， 270位的氨基酸為Lys， 272位的氨基酸為Leu、或Arg中的任一者， 279位的氨基酸為△]^、六8卩、617、把8、]^1:、六811、6111、六找、361'、1111'、1'印、或了5^中的任 一者， 283 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Th;r、 Trp、或Tyr中的任一者， 285位的氨基酸為Asn， 286位的氨基酸為Phe， 288位的氨基酸為Asn、或Pro中的任一者， 293位的氨基酸為Val， 307位的氨基酸為Ala、Glu、Gin、或Met中的任一者， 311 位的氨基酸為 Ala、Glu、lie、Lys、Leu、Met、Ser、Val、或 Trp 中的任一者， 309位的氨基酸為Pro， 312位的氨基酸為Ala、Asp、或Pro中的任一者， 314位的氨基酸為Ala或Leu中的任一者， 316位的氨基酸為Lys， 317位的氨基酸為Pro， 318位的氨基酸為Asn、或Thr中的任一者， 332 位的氨基酸為 Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或 Trp 中的任一者， 339位的氨基酸為Asn、Thr、或Trp中的任一者， 341位的氨基酸為Pro， 343位的氨基酸為Glu、His、Lys、Gin、Arg、Thr、或Tyr中的任一者， 375位的氨基酸為Arg， 376位的氨基酸為Gly、lie、Met、Pro、Thr、或Val中的任一者， 377位的氨基酸為Lys， 378位的氨基酸為Asp、Asn、或Val中的任一者， 380位的氨基酸為Ala、Asn、Ser、或Thr中的任一者 382 位的氨基酸為 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或 Tyr中的任一者， 385 位的氨基酸為 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或 Thr 中的任一者， 386 位的氨基酸為 Arg、Asp、lie、Lys、Met、Pro、Ser、或 Thr 中的任一者， 387位的氨基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中的任一者， 389位的氨基酸為Asn、Pro、或Ser中的任一者， 423位的氨基酸為Asn， 427位的氨基酸為Asn， 428位的氨基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中的任一者 430 位的氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、 或Tyr中的任一者， 431位的氨基酸為His、或Asn中的任一者， 433位的氨基酸為Arg、Gin、His、lie、Lys、Pro、或Ser中的任一者， 434位的氨基酸為Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp、或Tyr中的任一者， 436 位的氨基酸為 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys、Met、或 Thr 中的任一者， 438位的氨基酸為Lys、Leu、Thr、或Trp中的任一者， 440位的氨基酸為Lys、或者， 442位的氨基酸為Lys、308位的氨基酸為lie、Pro、或Thr中的任一者。
20. 權(quán)利要求1至19中任一項所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)槎嗵?異性或多互補(bǔ)位的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
21. 權(quán)利要求20所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，至少一個抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域所結(jié)合的抗原是表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞膜的膜型分子，和至少一個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域 所結(jié)合的抗原是表達(dá)于效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜的膜型分子。
22. 權(quán)利要求21所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述效應(yīng)細(xì)胞是NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、或T 細(xì)胞。
23. 權(quán)利要求21或22所述的抗原結(jié)合分子，其中，表達(dá)于所述效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜的膜 型分子是構(gòu)成 TCR 的多肽、CD2、CD3、CD28、CD44、CD16、CD32、CD64、或 NKG2D。
24. 權(quán)利要求20所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，至少一個抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域所結(jié)合的抗原是表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞膜的膜型分子、和至少一個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域 所結(jié)合的抗原是細(xì)胞毒性物質(zhì)。
25. 權(quán)利要求20至24中任一項所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述抗原結(jié)合分子是抗體 片段。
26. 權(quán)利要求1至24中任一項所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述抗原結(jié)合分子是抗體。
27. 權(quán)利要求1至7中任一項所述的抗原結(jié)合分子，其中，抗原是可溶型分子。
28. 權(quán)利要求27所述的抗原結(jié)合分子，其是具有中和活性的抗原結(jié)合分子。
29. 權(quán)利要求27或28所述的抗原結(jié)合分子，其包含F(xiàn)c區(qū)。
30. 權(quán)利要求29所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)是SEQ ID NO: 5、6、7或8中記 載的恒定區(qū)所含的Fc區(qū)。
31. 權(quán)利要求29所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)的在pH酸性范圍條件下的FcRn 結(jié)合活性與SEQ ID NO: 5、6、7或8中記載的恒定區(qū)所含的Fc區(qū)的FcRn結(jié)合活性相比增強(qiáng)。
32. 權(quán)利要求31所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)是在SEQ ID NO:5、6、7或8中 記載的恒定區(qū)所含的Fc區(qū)的氨基酸序列中，選自以EU編號表示的238位、244位、245位、 249 位、250 位、251 位、252 位、253 位、254 位、255 位、256 位、257 位、258 位、260 位、262 位、 265 位、270 位、272 位、279 位、283 位、285 位、286 位、288 位、293 位、303 位、305 位、307 位、 308 位、309 位、311 位、312 位、314 位、316 位、317 位、318 位、332 位、339 位、340 位、341 位、 343 位、356 位、360 位、362 位、375 位、376 位、377 位、378 位、380 位、382 位、385 位、386 位、 387 位、388 位、389 位、400 位、413 位、415 位、423 位、424 位、427 位、428 位、430 位、431 位、 433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位或447位中的至少一個以上的 氨基酸被替換的Fc區(qū)。
33. 權(quán)利要求32所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)在SEQ ID NO: 5、6、7或8中記 載的恒定區(qū)所含的Fc區(qū)的氨基酸序列中，包含以EU編號表示的選自下述中的至少一個以 上氨基酸： 238位的氨基酸為Leu， 244位的氨基酸為Leu， 245位的氨基酸為Arg， 249位的氨基酸為Pro， 250位的氨基酸為Gin或Glu中的任一者，或者 251位的氨基酸為Arg、Asp、Glu、或Leu中的任一者， 252位的氨基酸為Phe、Ser、Thr、或Tyr中的任一者， 254位的氨基酸為Ser或Thr中的任一者， 255位的氨基酸為Arg、Gly、lie、或Leu中的任一者， 256 位的氨基酸為 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro、或 Thr 中的任一者， 257位的氨基酸為Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中的任一者， 258位的氨基酸為Asp， 260位的氨基酸為Ser， 262位的氨基酸為Leu， 270位的氨基酸為Lys， 272位的氨基酸為Leu、或Arg中的任一者， 279位的氨基酸為△]^、六8卩、617、把8、]^1:、六811、6111、六找、361'、1111'、1'印、或了5^中的任 一者， 283 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Th;r、 Trp、或Tyr中的任一者， 285位的氨基酸為Asn， 286位的氨基酸為Phe， 288位的氨基酸為Asn、或Pro中的任一者， 293位的氨基酸為Val， 307位的氨基酸為Ala、Glu、Gin、或Met中的任一者， 311 位的氨基酸為 Ala、Glu、lie、Lys、Leu、Met、Ser、Val、或 Trp 中的任一者， 309位的氨基酸為Pro， 312位的氨基酸為Ala、Asp、或Pro中的任一者， 314位的氨基酸為Ala或Leu中的任一者， 316位的氨基酸為Lys， 317位的氨基酸為Pro， 318位的氨基酸為Asn、或Thr中的任一者， 332 位的氨基酸為 Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或 Trp 中的任一者， 339位的氨基酸為Asn、Thr、或Trp中的任一者， 341位的氨基酸為Pro， 343位的氨基酸為Glu、His、Lys、Gin、Arg、Thr、或Tyr中的任一者， 375位的氨基酸為Arg， 376位的氨基酸為Gly、lie、Met、Pro、Thr、或Val中的任一者， 377位的氨基酸為Lys， 378位的氨基酸為Asp、Asn、或Val中的任一者， 380位的氨基酸為Ala、Asn、Ser、或Thr中的任一者 382 位的氨基酸為 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或 Tyr中的任一者， 385 位的氨基酸為 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或 Thr 中的任一者， 386 位的氨基酸為 Arg、Asp、lie、Lys、Met、Pro、Ser、或 Thr 中的任一者， 387位的氨基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中的任一者， 389位的氨基酸為Asn、Pro、或Ser中的任一者， 423位的氨基酸為Asn， 427位的氨基酸為Asn， 428位的氨基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中的任一者 430 位的氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、 或Tyr中的任一者， 431位的氨基酸為His、或Asn中的任一者， 433位的氨基酸為Arg、Gin、His、lie、Lys、Pro、或Ser中的任一者， 434位的氨基酸為Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp、或Tyr中的任一者， 436 位的氨基酸為 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys、Met、或 Thr 中的任一者， 438位的氨基酸為Lys、Leu、Thr、或Trp中的任一者， 440位的氨基酸為Lys、或者， 442位的氨基酸為Lys、308位的氨基酸為lie、Pro、或Thr中的任一者。
34. 權(quán)利要求29所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)的在pH中性范圍條件下的FcRn 結(jié)合活性與SEQ ID NO: 5、6、7或8中記載的恒定區(qū)所含的Fc區(qū)的FcRn結(jié)合活性相比增強(qiáng)。
35. 權(quán)利要求34所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)是在SEQ ID NO:5、6、7或8中 記載的恒定區(qū)所含的Fc區(qū)的氨基酸序列中，選自以EU編號表示的237位、248位、250位、 252 位、254 位、255 位、256 位、257 位、258 位、265 位、286 位、289 位、297 位、298 位、303 位、 305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312 位、314 位、315 位、317 位、332 位、334 位、360 位、 376 位、380 位、382 位、384 位、385 位、386 位、387 位、389 位、424 位、428 位、433 位、434 位 或436位中的至少一個以上的氨基酸被替換的Fc區(qū)。
36. 權(quán)利要求35所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)在SEQ ID NO:5、6、7或8中的 任一者所示的Fc區(qū)的氨基酸序列中，包含以EU編號表示的選自下述中的至少一個以上氨 基酸： 237位的氨基酸為Met， 248位的氨基酸為lie， 250 位的氨基酸為 Ala、Phe、Ile、Met、Gln、361'、'\^1、1'印、或15^中的任一者， 252位的氨基酸為Phe、Trp、或Tyr中的任一者， 254位的氨基酸為Thr， 255位的氨基酸為Glu， 256位的氨基酸為Asp、Asn、Glu、或Gin中的任一者， 257 位的氨基酸為 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或 Val 中的任一者， 258位的氨基酸為His， 265位的氨基酸為Ala， 286位的氨基酸為Ala或Glu中的任一者， 289位的氨基酸為His， 297位的氨基酸為Ala， 303位的氨基酸為Ala， 305位的氨基酸為Ala， 307 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、 Val、Trp、或Tyr中的任一者， 308 位的氨基酸為 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gin、或 Thr 中的任一者， 309位的氨基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg中的任一者， 311位的氨基酸為Ala、His、或lie中的任一者， 312位的氨基酸為Ala或His中的任一者， 314位的氨基酸為Lys或Arg中的任一者， 315位的氨基酸為Ala、Asp或His中的任一者， 317位的氨基酸為Ala， 332位的氨基酸為Val， 334位的氨基酸為Leu， 360位的氨基酸為His， 376位的氨基酸為Ala， 380位的氨基酸為Ala， 382位的氨基酸為Ala， 384位的氨基酸為Ala， 385位的氨基酸為Asp或His中的任一者， 386位的氨基酸為Pro， 387位的氨基酸為Glu， 389位的氨基酸為Ala或Ser中的任一者， 424位的氨基酸為Ala， 428 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、 Trp、或Tyr中的任一者， 433位的氨基酸為Lys， 434位的氨基酸為Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr中的任一者，或者 436 位的氨基酸為 His、lie、Leu、Phe、Thr、或 Val。
37. 權(quán)利要求29或31至36中任一項所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)是抑制型 Fc Y受體結(jié)合活性比活性型Fc Y受體結(jié)合活性高的Fc區(qū)。
38. 權(quán)利要求37所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述抑制型Fc Y受體是人Fc y Rllb。
39. 權(quán)利要求37或38所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述活性型Fc Y受體是人Fc y RIa、 人 FcyRIIa (R)、人 FcyRIIa (H)、人 FcyRIIIa (V)或人 FcyRIIIa (F)。
40. 權(quán)利要求37至39中任一項所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)的以EU編號表 示的238位或328位的氨基酸包含與天然型人IgG的Fc區(qū)的氨基酸不同的氨基酸。
41. 權(quán)利要求40所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)的以EU編號表示的238位的氨 基酸為Asp、或328位的氨基酸為Glu。
42. 權(quán)利要求40或41所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述Fc區(qū)的氨基酸序列中，包含以 EU編號表不的選自下述中的至少一個以上氨基酸： 233位的氨基酸為Asp， 234位的氨基酸為Trp、或Tyr中的任一者， 237 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Leu、Met、Phe、Trp 或 Tyr 中的任一者， 239位的氨基酸為Asp， 267位的氨基酸為Ala、Gin或Val中的任一者， 268位的氨基酸為Asn、Asp、或Glu中的任一者， 271位的氨基酸為Gly， 326 位的氨基酸為 Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Leu、Met、Ser 或 Thr 中的任一者， 330位的氨基酸為Arg、Lys、或Met中的任一者， 323位的氨基酸為lie、Leu、或Met中的任一者，或者 296位的氨基酸為Asp。
43. 權(quán)利要求27至42中任一項所述的抗原結(jié)合分子，其中，所述抗原結(jié)合分子是抗體。
44. 權(quán)利要求1至43中的任一項所述的抗原結(jié)合分子的制造方法，其包括選擇抗原結(jié) 合活性根據(jù)靶組織特異性化合物的濃度而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
45. 權(quán)利要求1至43中任一項所述的抗原結(jié)合分子的篩選方法，其包括選擇抗原結(jié)合 活性根據(jù)靶組織特異性化合物的濃度而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
46. 藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至43中任一項所述的抗原結(jié)合分子。
【文檔編號】C07K16/46GK104487457SQ201380040397
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月30日
【發(fā)明者】井川智之, 丹波茂郎, 辰巳加奈子, 清水駿, 門野正次郎 申請人:中外制藥株式會社