一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法
【專利摘要】一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法，本發(fā)明涉及一種用于殼寡糖分離的色譜固定相的制備方法。本發(fā)明要解決現(xiàn)有所用于分離殼寡糖的色譜柱的數(shù)量較少，分離效果不理想，難以獲得高純度單一組分殼寡糖的問題。方法：一、制備活化后的硅膠；二、制備氯代硅膠；三、制備苯硼酸化硅膠，即一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法。本發(fā)明用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法。
【專利說明】
一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種用于殼寡糖分離的色譜固定相的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]殼寡糖也稱幾丁寡糖，是將殼聚糖經(jīng)過特殊處理降解而得到的聚合度(DP)為2?10的氨基葡萄糖低聚物。由于殼寡糖糖鏈較短，所以其具有溶解性好，生理條件下粘度低的特點。和大多數(shù)多糖不同，殼寡糖結(jié)構(gòu)中由于脫乙?；饔枚哂杏坞x氨基基團(tuán)，是自然界中唯一帶正電荷的堿性低聚糖。殼寡糖的這些特性引起了越來越多研究者的關(guān)注。已有大量文獻(xiàn)報道了殼寡糖的生物活性，而這些生物活性被廣泛應(yīng)用在食品、藥物、農(nóng)業(yè)和環(huán)境領(lǐng)域。但是目前，所用于分離殼寡糖的色譜柱的數(shù)量較少，分離效果也多不理想。殼寡糖生物活性研究中多使用了混合組分殼寡糖對其生物活性進(jìn)行研究，由于組分的復(fù)雜，使得研究其分子水平機(jī)理就顯得有些困難，所以殼寡糖領(lǐng)域面臨一個問題，就是獲得高純度單一組分殼寡糖，同時進(jìn)一步加強(qiáng)殼寡糖生物活性機(jī)理在分子水平的研究，這可能會為殼寡糖未知的生物活性提供新的見解，可以推動殼寡糖在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決現(xiàn)有所用于分離殼寡糖的色譜柱的數(shù)量較少，分離效果不理想，難以獲得高純度單一組分殼寡糖的問題，而提供一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法。
[0004]—種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法，具體是按照以下步驟進(jìn)行的:
[0005]—、制備活化后的硅膠:
[0006]將硅膠加入到體積百分?jǐn)?shù)為10%?30 %的鹽酸溶液中，然后在溫度為100°C?120°(:的條件下，回流5h?8h，回流后冷卻至室溫，再水洗反應(yīng)后的硅膠直至洗滌液為中性，在溫度為100°C?120°C的條件下，將洗滌后的硅膠真空干燥Sh?12h，得到活化后的硅膠；
[0007]所述的硅膠的質(zhì)量與體積百分?jǐn)?shù)為10%?30%的鹽酸溶液的體積比為Ig:(20?50)mL；
[0008]二、制備氯代硅膠:
[0009]將活化后的硅膠置于圓底燒瓶中，向圓底燒瓶中加入N，N_二甲基甲酰胺，混合均勻，再向圓底燒瓶中加入γ-氯丙基三乙氧基硅烷，搖勻并充氮氣保護(hù)，然后在溫度為65°C?145°C的條件下，磁力攪拌反應(yīng)12h?24h，反應(yīng)結(jié)束，靜置至室溫，得到反應(yīng)后的產(chǎn)物A，用離心機(jī)以3000r/min?8000r/min的速度，將反應(yīng)后的產(chǎn)物A離心5min?20min，棄上層清液后，得到分離后的產(chǎn)物A，將分離后的產(chǎn)物A分別用N，N-二甲基甲酰胺和乙醇各洗滌3次?6次，最后置于溫度為30°C?70°C的真空干燥箱中干燥4h?Sh，得到氯代硅膠；
[0010]所述的活化后的硅膠的質(zhì)量與N，N-二甲基甲酰胺的體積比為Ig: (100?400)mL;所述的活化后的硅膠的質(zhì)量與γ-氯丙基三乙氧基硅烷的體積比為Ig: (10?40)mL;
[0011]三、制備苯硼酸化硅膠:
[0012]將氯代硅膠置于圓底燒瓶中，先向圓底燒瓶中加入溶劑，然后加入3-氨基苯硼酸，超聲混勻后，再加入吡啶，室溫下反應(yīng)4h?Sh，反應(yīng)結(jié)束，得到反應(yīng)后的產(chǎn)物B，用離心機(jī)以3000r/min?8000r/min的速度，將反應(yīng)后的產(chǎn)物B離心5min?20min，棄上層清液后，得到分離后的產(chǎn)物B，將分離后的產(chǎn)物B用洗滌液洗滌2次?6次，最后置于溫度為30°C?70°C的真空干燥箱中干燥4h?8h，得到苯硼酸化硅膠，即完成一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法；
[0013]所述的氯代硅膠的質(zhì)量與溶劑的體積比為Ig:(100?400)mL;所述的氯代硅膠與3-氨基苯硼酸的質(zhì)量比為1: (I?4);所述的氯代硅膠的質(zhì)量與吡啶的體積比為Ig: (I?4)mL；
[0014]所述的溶劑為氯仿或四氫呋喃，所述的洗滌液為氯仿或四氫呋喃，且溶劑與洗滌液為同種物質(zhì)。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
[0016]本發(fā)明涉及液相色譜固定相，鍵合相為3-氨基苯硼酸，首先在硅膠表面引入芐基氯基團(tuán)制備氯代硅膠中間體;然后通過鹵代烴與氨基反應(yīng)，將苯硼酸基團(tuán)鍵合到氯代硅膠的表面。本發(fā)明提供的色譜分離材料結(jié)構(gòu)新穎，分離度高。該固定相用作液相色譜分離材料能在親水色譜模式下對強(qiáng)極性化合物有很好的分離效果。
[0017]本發(fā)明用于一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法。
【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明苯硼酸化硅膠合成路線；
[0019]圖2為殼寡糖混合物在實施例一制備的苯硼酸化硅膠膠柱上的分離圖，I為殼二糖，2為殼三糖，3為殼四糖，4為殼五糖，5為殼六糖。
【具體實施方式】
[0020]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉的【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】之間的任意組合。
[0021]【具體實施方式】一:本實施方式所述的一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法，具體是按照以下步驟進(jìn)行的:
[0022]一、制備活化后的硅膠:
[0023]將硅膠加入到體積百分?jǐn)?shù)為10%?30%的鹽酸溶液中，然后在溫度為100°C?120°(:的條件下，回流5h?8h，回流后冷卻至室溫，再水洗反應(yīng)后的硅膠直至洗滌液為中性，在溫度為100°C?120°C的條件下，將洗滌后的硅膠真空干燥Sh?12h，得到活化后的硅膠；
[0024]所述的硅膠的質(zhì)量與體積百分?jǐn)?shù)為10%?30%的鹽酸溶液的體積比為Ig:(20?50)mL；
[0025]二、制備氯代硅膠:
[0026]將活化后的硅膠置于圓底燒瓶中，向圓底燒瓶中加入N，N_二甲基甲酰胺，混合均勻，再向圓底燒瓶中加入γ-氯丙基三乙氧基硅烷，搖勻并充氮氣保護(hù)，然后在溫度為65°C?145°C的條件下，磁力攪拌反應(yīng)12h?24h，反應(yīng)結(jié)束，靜置至室溫，得到反應(yīng)后的產(chǎn)物A，用離心機(jī)以3000r/min?8000r/min的速度，將反應(yīng)后的產(chǎn)物A離心5min?20min，棄上層清液后，得到分離后的產(chǎn)物A，將分離后的產(chǎn)物A分別用N，N-二甲基甲酰胺和乙醇各洗滌3次?6次，最后置于溫度為30°C?70°C的真空干燥箱中干燥4h?Sh，得到氯代硅膠；
[0027]所述的活化后的硅膠的質(zhì)量與N，N-二甲基甲酰胺的體積比為Ig: (100?400)mL;所述的活化后的硅膠的質(zhì)量與γ-氯丙基三乙氧基硅烷的體積比為Ig: (10?40)mL;
[0028]三、制備苯硼酸化硅膠:
[0029]將氯代硅膠置于圓底燒瓶中，先向圓底燒瓶中加入溶劑，然后加入3-氨基苯硼酸，超聲混勻后，再加入吡啶，室溫下反應(yīng)4h?Sh，反應(yīng)結(jié)束，得到反應(yīng)后的產(chǎn)物B，用離心機(jī)以3000r/min?8000r/min的速度，將反應(yīng)后的產(chǎn)物B離心5min?20min，棄上層清液后，得到分離后的產(chǎn)物B，將分離后的產(chǎn)物B用洗滌液洗滌2次?6次，最后置于溫度為30°C?70°C的真空干燥箱中干燥4h?8h，得到苯硼酸化硅膠，即完成一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法；
[0030]所述的氯代硅膠的質(zhì)量與溶劑的體積比為Ig:(100?400)mL;所述的氯代硅膠與3-氨基苯硼酸的質(zhì)量比為1: (I?4);所述的氯代硅膠的質(zhì)量與吡啶的體積比為Ig: (I?4)mL；
[0031]所述的溶劑為氯仿或四氫呋喃，所述的洗滌液為氯仿或四氫呋喃，且溶劑與洗滌液為同種物質(zhì)。
[0032]圖1為本發(fā)明苯硼酸化硅膠合成路線，本【具體實施方式】制備的用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的合成方法包括以下步驟:I)硅膠活化;2)氯代硅膠(S12OCl)的合成;3)用3-氨基苯硼酸對合成的S12OCl進(jìn)行改性;利用苯硼酸與殼寡糖的可形成可逆共價鍵與氫鍵的協(xié)同效應(yīng)來加大填料對苯硼酸的選擇性。
[0033]本實施方式的有益效果是:
[0034]本實施方式涉及液相色譜固定相，鍵合相為3-氨基苯硼酸，首先在硅膠表面引入芐基氯基團(tuán)制備氯代硅膠中間體;然后通過鹵代烴與氨基反應(yīng)，將苯硼酸基團(tuán)鍵合到氯代硅膠的表面。本發(fā)明提供的色譜分離材料結(jié)構(gòu)新穎，分離度高。該固定相用作液相色譜分離材料能在親水色譜模式下對強(qiáng)極性化合物有很好的分離效果。
[0035]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟一中所述的硅膠的質(zhì)量與體積百分?jǐn)?shù)為10%?30%的鹽酸溶液的體積比為Ig: (35?50)mL。其它與【具體實施方式】一相同。
[0036]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二之一不同的是:步驟二中所述的活化后的硅膠的質(zhì)量與N，N-二甲基甲酰胺的體積比為lg:400mL。其它與【具體實施方式】一或二相同。
[0037]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一至三之一不同的是:步驟二中所述的活化后的硅膠的質(zhì)量與γ-氯丙基三乙氧基硅烷的體積比為Ig: (10?30)mL。其它與【具體實施方式】一至三相同。
[0038]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一至四之一不同的是:步驟三中所述的氯代硅膠的質(zhì)量與溶劑的體積比為lg:400mL。其它與【具體實施方式】一至四相同。
[0039]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一至五之一不同的是:步驟三中所述的氯代硅膠與3-氨基苯硼酸的質(zhì)量比為1:1。其它與【具體實施方式】一至五相同。
[0040]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一至六之一不同的是:步驟三中所述的氯代硅膠的質(zhì)量與吡啶的體積比為Ig: (I?3)mL。其它與【具體實施方式】一至六相同。[0041 ]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一至七之一不同的是:步驟一中在溫度為120°C的條件下，回流5h。其它與【具體實施方式】一至七相同。
[0042]【具體實施方式】九:本實施方式與【具體實施方式】一至八之一不同的是:步驟二中在溫度為105°C的條件下，磁力攪拌反應(yīng)24h。其它與【具體實施方式】一至八相同。
[0043]【具體實施方式】十:本實施方式與【具體實施方式】一至九之一不同的是:步驟三中將氯代硅膠置于圓底燒瓶中，先向圓底燒瓶中加入溶劑，然后加入3-氨基苯硼酸，超聲混勻后，再加入吡啶，室溫下反應(yīng)6h。其它與【具體實施方式】一至九相同。
[0044]采用以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果:
[0045]實施例一:
[0046]—種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法是按以下步驟進(jìn)行:
[0047]—、制備活化后的硅膠:
[0048]將1.5g硅膠加入到40mL體積百分?jǐn)?shù)為20%的鹽酸溶液中，然后在溫度為120°C的條件下，回流5h，回流后冷卻至室溫，再水洗反應(yīng)后的硅膠直至洗滌液為中性，在溫度為120°(:的條件下，將洗滌后的硅膠真空干燥12h，得到活化后的硅膠；
[0049]二、制備氯代硅膠:
[0050]將200mg活化后的硅膠置于圓底燒瓶中，向圓底燒瓶中加入80mL N，N_二甲基甲酰胺，混合均勻，再向圓底燒瓶中加入2mLy-氯丙基三乙氧基硅烷，搖勻并充氮氣保護(hù)，然后在溫度為105°C的條件下，磁力攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束，靜置至室溫，得到反應(yīng)后的產(chǎn)物A，用離心機(jī)以4500r/min的速度，將反應(yīng)后的產(chǎn)物A離心1min，棄上層清液后，得到分離后的產(chǎn)物A，將分離后的產(chǎn)物A分別用N，N-二甲基甲酰胺和乙醇各洗滌3次，最后置于溫度為40°C的真空干燥箱中干燥6h，得到氯代硅膠；
[0051 ]三、制備苯硼酸化硅膠:
[0052]將200mg氯代娃膠置于圓底燒瓶中，先向圓底燒瓶中加入80mL氯仿，然后加入200mg 3-氨基苯硼酸，超聲混勻后，再加入0.2mL吡啶，室溫下反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束，得到反應(yīng)后的產(chǎn)物B，用離心機(jī)以4500r/min的速度，將反應(yīng)后的產(chǎn)物B離心lOmin，棄上清液后，得到分離后的產(chǎn)物B，將分離后的產(chǎn)物B用氯仿洗滌3次，最后置于溫度為40 °C的真空干燥箱中干燥6h，得到苯硼酸化硅膠，即完成一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法。
[0053]將本實施例制備的苯硼酸化硅膠膠柱，即用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相，用勻漿法填裝4.6 X 150mm不銹鋼色譜柱，在親水色譜模式下分離殼寡糖。圖2為殼寡糖混合物在實施例一制備的苯硼酸化硅膠膠柱上的分離圖，I為殼二糖，2為殼三糖，3為殼四糖，4為殼五糖，5為殼六糖；圖2所用色譜條件為:流動相為乙腈和質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1.8%三乙胺-磷酸水溶液的混合物，其中乙腈占流動相的體積百分?jǐn)?shù)為75%，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1.8%三乙胺-磷酸水溶液占流動相的體積百分?jǐn)?shù)為25%;流速為lmL/min，柱溫:25°C;檢測器:示差檢測器。由圖2可知，制備的用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相能將殼二糖至殼六糖的混合物分開，且分離度良好。
【主權(quán)項】
1.一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法，其特征在于一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法是按照以下步驟進(jìn)行的: 一、制備活化后的硅膠: 將娃膠加入到體積百分?jǐn)?shù)為1 %?30 %的鹽酸溶液中，然后在溫度為100 °C?120 °C的條件下，回流5h?8h，回流后冷卻至室溫，再水洗反應(yīng)后的硅膠直至洗滌液為中性，在溫度為100 °C?120 °C的條件下，將洗滌后的硅膠真空干燥Sh?12h，得到活化后的硅膠； 所述的硅膠的質(zhì)量與體積百分?jǐn)?shù)為1 %?30 %的鹽酸溶液的體積比為lg:(20?50)mL； 二、制備氯代硅膠: 將活化后的硅膠置于圓底燒瓶中，向圓底燒瓶中加入N，N-二甲基甲酰胺，混合均勻，再向圓底燒瓶中加入γ_氯丙基三乙氧基硅烷，搖勻并充氮氣保護(hù)，然后在溫度為65°C?145°(:的條件下，磁力攪拌反應(yīng)12h?24h，反應(yīng)結(jié)束，靜置至室溫，得到反應(yīng)后的產(chǎn)物A，用離心機(jī)以3000r/min?8000r/min的速度，將反應(yīng)后的產(chǎn)物A離心5min?20min，棄上層清液后，得到分離后的產(chǎn)物A，將分離后的產(chǎn)物A分別用N，N-二甲基甲酰胺和乙醇各洗滌3次?6次，最后置于溫度為30°C?70°C的真空干燥箱中干燥4h?8h，得到氯代硅膠； 所述的活化后的硅膠的質(zhì)量與N，N-二甲基甲酰胺的體積比為Ig: (100?400)mL;所述的活化后的硅膠的質(zhì)量與γ -氯丙基三乙氧基硅烷的體積比為Ig: (10?40)mL; 三、制備苯硼酸化硅膠: 將氯代硅膠置于圓底燒瓶中，先向圓底燒瓶中加入溶劑，然后加入3-氨基苯硼酸，超聲混勻后，再加入吡啶，室溫下反應(yīng)4h?Sh，反應(yīng)結(jié)束，得到反應(yīng)后的產(chǎn)物B，用離心機(jī)以3000r/min?8000r/min的速度，將反應(yīng)后的產(chǎn)物B離心5min?20min，棄上層清液后，得到分離后的產(chǎn)物B，將分離后的產(chǎn)物B用洗滌液洗滌2次?6次，最后置于溫度為30°C?70°C的真空干燥箱中干燥4h?8h，得到苯硼酸化硅膠，即完成一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法； 所述的氯代娃膠的質(zhì)量與溶劑的體積比為I g:(1 O?4 O O) m L;所述的氯代娃膠與3 -氨基苯硼酸的質(zhì)量比為1: (I?4);所述的氯代硅膠的質(zhì)量與吡啶的體積比為Ig: (I?4)mL; 所述的溶劑為氯仿或四氫呋喃，所述的洗滌液為氯仿或四氫呋喃，且溶劑與洗滌液為同種物質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法，其特征在于步驟一中所述的硅膠的質(zhì)量與體積百分?jǐn)?shù)為10%?30%的鹽酸溶液的體積比為 lg:(35?50)mL。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法，其特征在于步驟二中所述的活化后的硅膠的質(zhì)量與N，N-二甲基甲酰胺的體積比為Ig:400mLo4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法，其特征在于步驟二中所述的活化后的硅膠的質(zhì)量與γ-氯丙基三乙氧基硅烷的體積比為Ig:(10?30)mLo5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法，其特征在于步驟三中所述的氯代娃膠的質(zhì)量與溶劑的體積比為I g: 400mL。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法，其特征在于步驟三中所述的氯代硅膠與3-氨基苯硼酸的質(zhì)量比為1:1。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法，其特征在于步驟三中所述的氯代娃膠的質(zhì)量與卩比啶的體積比為Ig: (I?3 )mL。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法，其特征在于步驟一中在溫度為120°C的條件下，回流5h。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法，其特征在于步驟二中在溫度為105°C的條件下，磁力攪拌反應(yīng)24h。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于殼寡糖分離的苯硼酸化親和色譜固定相的制備方法，其特征在于步驟三中將氯代硅膠置于圓底燒瓶中，先向圓底燒瓶中加入溶劑，然后加入3-氨基苯硼酸，超聲混勻后，再加入吡啶，室溫下反應(yīng)6h。
【文檔編號】C07H1/06GK106076298SQ201610422992
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月13日 公開號201610422992.6, CN 106076298 A, CN 106076298A, CN 201610422992, CN-A-106076298, CN106076298 A, CN106076298A, CN201610422992, CN201610422992.6
【發(fā)明人】楊鑫, 孫敬明, 王靜
【申請人】哈爾濱工業(yè)大學(xué)