血小板篩選芯片及其制作方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種血小板篩選芯片及其制作方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 輸注血小板可預(yù)防和治療血小板減少或血小板功能缺陷引起的出血等疾病，但患 者多次輸血后，易產(chǎn)生血小板相關(guān)抗體，導(dǎo)致血小板輸注無(wú)效（PTR)。因此，在血小板輸注 前，對(duì)患者進(jìn)行血小板抗體的檢測(cè)，選擇適當(dāng)?shù)难“遢斪⑹欠浅１匾摹Ｌ貏e是血小板抗 體陽(yáng)性患者進(jìn)行交叉配型以篩選相容性供者，可顯著提高血小板輸注的療效。目前檢測(cè)血 小板抗體與交叉配型實(shí)驗(yàn)主要是MASPA法和Capture-P法，這些方法使用的進(jìn)口試劑昂貴， 檢驗(yàn)成本較高，增加了患者的負(fù)擔(dān)；同時(shí)檢測(cè)的時(shí)間較長(zhǎng)，步驟較多，對(duì)結(jié)果的可靠性產(chǎn)生 一定影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 基于此，有必要提供一種在血小板輸注時(shí)，可快速進(jìn)行輸注血小板配型實(shí)驗(yàn)且成 本較低的血小板篩選芯片及其制作方法和應(yīng)用。
[0004] 一種血小板篩選芯片，包括基板、涂覆在所述基板表面的金層、位于所述金層表面 的引發(fā)劑自組裝單層及位于所述引發(fā)劑自組裝單層上的聚合物層，所述聚合物層的聚合物 修飾有羧基，待篩選的所述血小板可與所述羧基反應(yīng)而被連接在所述聚合物層上。
[0005] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述基板為多孔芯片基板，所述金層涂覆在所述基板的孔 底。
[0006] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述引發(fā)劑自組裝單層的材料為硫醇引發(fā)劑。
[0007] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述聚合物層的聚合物單體為寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯及 甲基丙烯酸羥乙酯中的至少一種。
[0008] -種血小板篩選芯片的制作方法，包括如下步驟：
[0009] 使用自組裝單層技術(shù)在涂覆有金層的基板表面形成引發(fā)劑自組裝單層；
[0010] 無(wú)氧條件下，將含有引發(fā)劑自組裝單層的基板置于聚合物單體溶液中進(jìn)行聚合反 應(yīng)，所述聚合物單體溶液包括〇. 8mmol/12mL的2-2'聯(lián)批陡、5mmol/12mL的聚合物單體、 0. 04mmol/12mL的CuCl2以及0. 04mM/12mL的抗壞血酸，溶劑是體積比為1:1的水與甲醇的 混合溶劑；
[0011] 聚合反應(yīng)結(jié)束后將得到的芯片清洗干凈，置于含有l(wèi)〇mg/mL 丁二酸酐和15mg/ mL4-二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中進(jìn)行羧基功能化處理，在所述聚合物上修飾羧 基。
[0012] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述基板為多孔芯片基板，所述金層涂覆在所述基板的孔 底。
[0013] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述引發(fā)劑自組裝單層為硫醇引發(fā)劑。
[0014] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述聚合物單體為寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯及甲基丙烯酸 羥乙酯中的至少一種。
[0015] 一種血小板的篩選方法，包括如下步驟：
[0016] 按照上述任一實(shí)施例所述的血小板篩選芯片的制作方法制作血小板篩選芯片；
[0017] 將制作好的所述血小板篩選芯片置于0· 2mol/L N-羥基琥珀酰亞胺和0· Imol/ Ll-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的水溶液中進(jìn)行活化修飾；
[0018] 將待篩選的血小板點(diǎn)樣在活化修飾處理后的所述血小板篩選芯片上；
[0019] 將點(diǎn)樣后的所述血小板篩選芯片固定在表面等離子共振儀的流動(dòng)池中，通入PBS 緩沖液直至獲得穩(wěn)定的基線，通入封閉試劑封閉殘余的活化基團(tuán)，最后通入血清樣本，通過(guò) 表面等離子共振儀直接檢測(cè)血清樣本與血小板的相互作用結(jié)果，從而篩選得到符合要求的 血小板。
[0020] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述封閉試劑為濃度lmol/L、pH8. 0的乙醇胺溶液。
[0021] 通過(guò)使用上述血小板篩選芯片，可將待篩選血小板點(diǎn)樣于芯片的特定區(qū)域，構(gòu)建 成高通量的血小板芯片，再利用表面等離子共振技術(shù)（SPR)技術(shù)快速、非標(biāo)記、高敏感度的 特點(diǎn)，直接篩查待測(cè)血清樣本，分析待測(cè)血清樣本與待測(cè)血小板的相容性，從而篩選得到符 合要求的血小板。該血小板篩選芯片成本較低，血小板篩選效率高，具有較大的市場(chǎng)推廣潛 力。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為利用血小板篩選芯片進(jìn)行的血小板抗體快速篩選和配型的方法的基本流 程圖；
[0023] 圖2為實(shí)施例部分的血小板陣列芯片圖，利用點(diǎn)樣儀將24個(gè)機(jī)采血小板和PBS(對(duì) 照點(diǎn)）點(diǎn)樣于芯片的特定，構(gòu)成5X5的矩陣；
[0024] 圖3為利用血小板篩選芯片檢測(cè)待測(cè)血清樣本結(jié)果，其中，圖3a為血清樣本與帶 篩選的血小板有相互作用過(guò)程，即陽(yáng)性，圖3b為血清樣本與帶篩選血小板無(wú)相互作用過(guò) 程，即陰性；
[0025] 圖4為利用血小板篩選芯片檢測(cè)血小板抗體的結(jié)果；
[0026] 圖5為利用Capture-P固相捕獲法檢測(cè)血小板抗體的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面主要結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)血小板篩選芯片及其制作方法和應(yīng)用作進(jìn)一 步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0028] 如圖1所示，一實(shí)施方式的血小板篩選芯片100包括基板110、涂覆在基板110表 面的金層120、位于金層120表面的引發(fā)劑自組裝單層130及位于引發(fā)劑自組裝單層130上 的聚合物層140。
[0029] 本實(shí)施方式的基板110可以為多孔芯片基板，多孔形成點(diǎn)陣，如5*5點(diǎn)陣、6*6點(diǎn)陣 等。金層120涂覆在多孔基板的孔底。
[0030] 本實(shí)施方式的引發(fā)劑自組裝單層130為硫醇引發(fā)劑。
[0031] 聚合物層140的聚合物修飾有羧基，待篩選的血小板可與羧基反應(yīng)而被連接在聚 合物層上。進(jìn)一步，在本實(shí)施方式中，聚合物層140的聚合物單體為寡聚乙二醇甲基丙烯酸 酯(如OEGMA526等）及甲基丙烯酸羥乙酯中的至少一種。
[0032] 本實(shí)施方式還提供了一種血小板篩選芯片的制作方法，其包括如下步驟：
[0033] 步驟一：使用自組裝單層技術(shù)在涂覆有金層的基板表面形成引發(fā)劑自組裝單層。
[0034] 步驟二：無(wú)氧條件下，將含有引發(fā)劑自組裝單層的基板置于聚合物單體溶液中進(jìn) 行聚合反應(yīng)，聚合物單體溶液包括〇. 8mmol/12mL的2-2'聯(lián)批陡、5mmol/12mL的聚合物單 體、0. 04mmol/12mL的CuCl2以及0. 04mM/12mL的抗壞血酸，溶劑是體積比為1:1的水與甲 醇的混合溶劑。
[0035] 步驟三：聚合反應(yīng)結(jié)束后將得到的芯片清洗干凈，置于含有10mg/mL 丁二酸酐和 15mg/mL4-二甲氨基吡啶（DMAP )的二甲基甲酰胺（DMF )溶液中進(jìn)行羧基功能化處理，在聚 合物上修飾羧基。
[0036] 此外，本實(shí)施方式還提供了一種血小板的篩選方法，包括如下步驟：
[0037] 步驟一：按照上述任血小板篩選芯片的制作方法制作血小板篩選芯片。
[0038] 步驟二：將制作好的血小板篩選芯片置于0. 2mol/L N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)和 0. lmol/Ll-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)的水溶液中進(jìn)行活化修飾。
[0039] 步驟三：將待篩選的血小板點(diǎn)樣在活化修飾處理后的血小板篩選芯片上。
[0040] 步驟四：將點(diǎn)樣后的血小板篩選芯片固定在表面等離子共振儀的流動(dòng)池中，通入 PBS緩沖液直至獲得穩(wěn)定的基線，通入封閉試劑封閉殘余的活化基團(tuán)，最后通入血清樣本， 通過(guò)表面等離子共振儀直接檢測(cè)血清樣本與血小板的相互作用結(jié)果，從而篩選得到符合要 求的血小板。
[0041] 其中，封閉試劑可以為濃度lmol/L、pH8. 0的乙醇胺溶液。
[0042] 通過(guò)使用上述血小板篩選芯片，可將待篩選血小板點(diǎn)樣于芯片的特定區(qū)域，構(gòu)建 成高通量的血小板芯片，再利用表面等離子共振技術(shù)（SPR)技術(shù)快速、非標(biāo)記、高敏感度的 特點(diǎn)，直接篩查待測(cè)血清樣本，分析待測(cè)血清樣本與待測(cè)血小板的相容性，從而篩選得到符 合要求的血小板。該血小板篩選芯片成本較低，血小板篩選效率高，具有較大的市場(chǎng)推廣潛 力。
[0043] 以下為具體實(shí)施例部分：
[0044] 1、儀器和材料
[0045] I. 1 儀器：
[0046] SPR分析儀(美國(guó)，Plexra)