專利名稱：寡核苷酸芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種寡核苷酸芯片及其應(yīng)用，尤其涉及一種基于biotin-avidin-cy3反 應(yīng)系統(tǒng)的隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增標(biāo)記的寡核苷酸芯片及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病原體檢測(cè)中的應(yīng) 用，屬生物芯片和診斷試劑等技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病是一種由多種病原體引起的嚴(yán)重威脅人類生命健康的病 癥，該種類型的疾病發(fā)病急，診斷困難，致死率高，這就要求對(duì)腦脊液中病原體進(jìn)行快 速準(zhǔn)確的檢測(cè)鑒定，以期早期采取有效的針對(duì)性治療措施。由于不同的病原體感染，病 變范圍、程度相差懸殊，臨床表現(xiàn)十分復(fù)雜，給診斷帶來(lái)困難，確診的主要依據(jù)是腦脊 液的病原學(xué)診斷，長(zhǎng)期以來(lái)病原體診斷主要依靠形態(tài)學(xué)檢查、腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)及組織學(xué) 的方法，但腦脊液中病毒含量甚低，其病毒培養(yǎng)檢測(cè)不但費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且敏感性和特異 性很差，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床要求。
生物芯片/微陣列技術(shù)是上個(gè)世紀(jì)末期產(chǎn)生的高通量平行檢測(cè)技術(shù)，它一經(jīng)產(chǎn)生就顯 示了極大的優(yōu)勢(shì)，寡核苷酸微陣列已經(jīng)在基因表達(dá)和人類疾病的研究中取得了廣泛的成 果。
在芯片雜交檢測(cè)過(guò)程中，樣品的熒光標(biāo)記是極其關(guān)鍵的一個(gè)步驟，特別是對(duì)于RNA 樣品由于其易于降解造成的引物區(qū)的缺失也會(huì)增加檢測(cè)的假陰性率，探索更快速和有效 的標(biāo)記技術(shù)將對(duì)基因芯片技術(shù)的應(yīng)用和推廣具有重要的實(shí)用價(jià)值。生物素-親和素系統(tǒng) 是七十年代后期發(fā)展起來(lái)的一種生物反應(yīng)放大系統(tǒng)，具有很多優(yōu)越性，通過(guò)隨機(jī)引物摻 入標(biāo)記將生物素插入到靶序列，然后與avidin-cy3反應(yīng)，可以明顯地提高信號(hào)強(qiáng)度。然 而，在檢索的寡核苷酸芯片中，還未見(jiàn)用隨機(jī)引物的方法對(duì)多種引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病 的病原體靶序列進(jìn)行biotin-11-dUTP的同時(shí)標(biāo)記，采用biotin-avidin-cy3信號(hào)放大系 統(tǒng)提高雜交信號(hào)強(qiáng)度，來(lái)檢測(cè)多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的常見(jiàn)病原體的寡核苷酸芯片。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足和臨床診斷的需要，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種能同時(shí)擴(kuò) 增多種能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病原體靶序列并提高標(biāo)記效率的寡核苷酸芯片及其 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病原體檢測(cè)中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是用隨機(jī)引物的方法對(duì)能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的多種病原體 耙序列進(jìn)行biotin-11-dUTP的同時(shí)標(biāo)記，并與本發(fā)明的70mer長(zhǎng)片段寡核苷酸探針制 備檢測(cè)芯片雜交，釆用biotin-avidin-cy3信號(hào)放大系統(tǒng)提高雜交信號(hào)強(qiáng)度，增加標(biāo)記 效率來(lái)提高病原體檢測(cè)的敏感性，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)多種引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病原體的目 的。
本發(fā)朋的基于biotin-avidin-cy3反應(yīng)系統(tǒng)的隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增標(biāo)記的寡核苷酸芯 片，由基片和陣列涂布于其上的CMV(巨細(xì)胞病毒)、HSVI (單純皰疹病毒I型)、RV (風(fēng) 疹病毒)、EBV (EB病毒)或TB (結(jié)核分枝桿菌)病原體探針以及陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、 空白對(duì)照制成，其特征在于所述基片是表面醛基化修飾的載玻片；所述病原體探針是10條70mer的、點(diǎn)樣濃度均為10y M的CMV-1、 CW-2、 FBVI-1、 FBVI-2、 RV1、 RV2、 EBV1、 EBV2、 TB1和TO2探針(每種病原體的探針為兩條；探針的5'端合成有一個(gè)氨基，6碳臂，15 個(gè)T);所述陰性對(duì)照為點(diǎn)樣濃度為10nM的JEV (乙腦病毒)探針；所述陽(yáng)性對(duì)照為點(diǎn) 樣濃度為10ix M的合成標(biāo)記探針，探針的序列為,(Cffi) 6"R)ly(dT)15"Tanra;所述空白對(duì)
照為雙蒸水；所述芯片的陣列布局如圖1所示；其中上述CW-1、 CW-2、 1、 fBVI-2、 RV1、 RV2、 TB1、 TO2 、 EBV1和EBV2探針具體序列為 CMV-1:艦-咖)6"ft3ly(dT)15
0GTCTCADGGlUroGGG/OGG(niGGADG0GKAGCAGAADC/OGGAMGAG000GADGTCI7O線 (W-2: (,Cffi)6"ft)ly(dr)15
固OTiAAADGGGrQGA0G/^DGAGGTGGKmGO3/WO(OGCrGAAGGaTGGGAGGAGA; ■-1: , (Cffi) 6"ft)ly(d1)15
GACAAAO0CAAO0GT000GTAGTOCXMnn]GAT00CAACMCT00CCOGOGOGO0CCGAGAOCAGTC; ■-2: ,( CH2) 6"ft)ly(dT)15
C000GCTGTTCTOGTTOClDOG0CKmnnrrcGACA00CTCTT0GTOGTCAGCA00GTCAT0CA; RV1: NH2- (CH2) 6~Poly(dT)15
OCA眼CAO0GTGATGAGOGTGnTG00CT0GOCAGCTA0GT0CAGCAQXTCACMGAO0GTOCG; RV2: NH2-咖)&"Poly(dT)15
OOOOGACrGGGCCrOOCCGGTTroCCMOGOCATTCarrGACrccrOGOGGCTCGTGGG; TBI: NH2-腿)6"Poly(dT)15
GCCMCATA000G0CGAGnurrcMGAACTTCGTT0GTAGCAGCMCCrGMGTTOCAGGATG0GTACA; TB2: NH2- (CH2) 6"Poly節(jié)5
CTCOCAGACTTACMGTGGGAMOCTTOCTGAOCAGOGAGCTGOOGCAATGGTTGTOOGaMCAG; 匪NH2-咖)6"Poly(dT)15
OGTOOCGTAGTOOCATOOOOCGATOOCMCMCTCOOCOGCGCGCOOOGAGAOCAGTOGOOOGAAGACAC; 匿NH2- (鵬6"Poly(dT)15
CCACGACACACTGATGAACAOCA0CAOGATGACTC0Cr0CCGCAO0CTCMCAAGCrAO0GAOGATIUrA 。
所述陰性對(duì)照探針具體序列為 NH2- (CH2) 6"Poly(dT)15
本發(fā)明所述基于biotin-avidin-cy3反應(yīng)系統(tǒng)的隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增標(biāo)記的寡核苷酸
芯片在檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性病原體中的應(yīng)用。
其中所述芯片應(yīng)用方法是基于biotin-avidin-cy3反應(yīng)系統(tǒng)的隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增標(biāo) 記靶序列實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性病原體特異基因同時(shí)擴(kuò)增標(biāo)記，然后與經(jīng)37"C 水合、3600mJ條件下紫外交聯(lián)、2.6g/L的NaBH4還原過(guò)程處理后的寡核苷酸芯片雜交反 應(yīng)，再于雜交盒中與Avidin-cy3反應(yīng)，之后將芯片洗脫甩干用掃描儀掃描，進(jìn)行病原體 檢測(cè)。
更進(jìn)一步的是所述芯片應(yīng)用方法是先將biotin—ll-dUTP通過(guò)隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增 摻入到靶序列，然后與陣列涂布有病原體探針的寡核苷酸芯片在雜交盒中65'C雜交6 8h，洗脫甩干后、在雜交盒中與Avidin-cy3在37。C下反應(yīng)30min 40min，將芯片洗脫 甩千用Scanarray 4000掃描儀掃描，用Quantarray 3. 0定量分析軟件分析掃描圖像的
5熒光強(qiáng)度值。
其中所述將biotin—ll-dUTP通過(guò)隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增摻入到靶序列的方法是將 選擇的CMV、 HSVI、 RV、 EBV或TB病原體靶序列基因{CMV的UL8基因和UL32 (BK000394) ，HSVI的UL4基因(NP—044666 ) , RV的RVE1基因(AB080733) , EBV的 LMP1基因(AY60133)， TB的AG85b基因(AY207396)}擴(kuò)增標(biāo)記，使biotin-11-dUTP 摻入到靶序列中去；其中反應(yīng)體系中的引物為random primer (6mer)(隨機(jī)引物)，dNTP 為TTP:Biotin-U-dUTP =4 : 1混合，解鏈溫度為42。C。
所述雜交中使用的雜交液成分優(yōu)選是50%甲酰胺、5XSSC、 0.5%SDS、 0. 1%鮭負(fù) 精DNA。
所述洗脫中使用的洗脫液成分優(yōu)選是2XSSC、 0.2%SDS。
所述avidin-cy3的濃度為0. 05raM (lmM的avidin-cy3用PBS按1: 20稀釋)。
所述掃描儀掃描的參數(shù)優(yōu)選為激光強(qiáng)度100%， PMT100%。
本發(fā)明的長(zhǎng)片斷寡核苷酸芯片能同時(shí)檢測(cè)多種引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病原體，極 適用于基層的臨床檢測(cè)應(yīng)用。應(yīng)用本發(fā)明所述的biotin-avidin-cy3系統(tǒng)隨機(jī)引物PCR 擴(kuò)增標(biāo)記寡核苷酸芯片技術(shù)體系能進(jìn)一歩研究開(kāi)發(fā)包括檢測(cè)其他病原體的寡核苷酸芯 片及相應(yīng)的應(yīng)用。
試驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明的寡核苷酸芯片檢測(cè)結(jié)果與臨床檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異，兩 者具有較高的符合率；說(shuō)明采用作為終點(diǎn)信號(hào)的檢測(cè)是可行的。
本發(fā)明建立的基于biotin-avidin-cy3反應(yīng)系統(tǒng)的隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增標(biāo)記的長(zhǎng)片段 寡核苷酸芯片技術(shù)體系與現(xiàn)有的寡核苷酸芯片技術(shù)相比，具有靈敏度、特異性高的特點(diǎn)， 是一種具有廣泛應(yīng)用前景的技術(shù)體系，能廣泛適用于臨床檢測(cè)，衛(wèi)生監(jiān)督，海關(guān)檢疫及 科研等領(lǐng)域。


圖1為本發(fā)明的寡核苷酸芯片陣列分布圖^
其中(^):陽(yáng)性對(duì)照;④陰性對(duì)照 :空白對(duì)照；①， :為CMV探針； ②，⑦:HSVI探針；③，⑧RV探針； ， : TB探針；⑤， : EBV探針。 圖2不同濃度的熒光標(biāo)記產(chǎn)物的雜交結(jié)果；
其中A F依次為核酸濃度依次為lng/u 1、100pg/"、10pg/u l、lpg/u 1 、0. lpg/
Ul、 0.01pg/u;左上角四個(gè)點(diǎn)為陽(yáng)性對(duì)照。 圖3不同探針濃度的對(duì)熒光強(qiáng)度的影響；
其中1-5為五個(gè)平行樣，從上往下順序?yàn)?0yM 、 25yM 、 lOnM 、 5yM 、 ly M 、 0. lyM 、 0. OlyM七個(gè)濃度。
圖4隨機(jī)引物標(biāo)記與PCR插入標(biāo)記的雜交結(jié)果；
其中A為隨機(jī)引物擴(kuò)增結(jié)果；B為PCR擴(kuò)增標(biāo)記雜交結(jié)果C為隨機(jī)引物標(biāo)記結(jié)果； 1: DL2000; 2:隨機(jī)引物擴(kuò)增結(jié)果；3， 7:陽(yáng)性對(duì)照；4, 5, 8， 9:探針雜交結(jié)果； 6, 10:陰性對(duì)照。
圖5五種病原體探針特異性檢驗(yàn)結(jié)果；
其中A為CMV兩條探針雜交結(jié)果；B為HSVI兩條探針雜交結(jié)果；C為RV兩條探針 雜交結(jié)果；D為TB兩條探針雜交結(jié)果；E為EBV兩條探針雜交結(jié)果，左上角四個(gè)點(diǎn)位陽(yáng) 性對(duì)照。圖6為以CMV探針為對(duì)象同批次寡核苷酸芯片重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果。
其中A、 B、 C為標(biāo)記產(chǎn)物在同一批次的雜交結(jié)果；右上角四個(gè)點(diǎn)為陽(yáng)性對(duì)照，中間
四個(gè)點(diǎn)和下面四個(gè)點(diǎn)分別為巨細(xì)胞病毒的兩條探針。
圖7為以CMV探針為對(duì)象不同批次寡合苷酸芯片重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果。
其中A為標(biāo)記產(chǎn)物第一次的雜交結(jié)果；B第二次的標(biāo)記產(chǎn)物與芯片的雜交結(jié)果；
C第三次的標(biāo)記產(chǎn)物與芯片的雜交結(jié)果。陣列分布同圖6。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 biotin-avidin-cy3系統(tǒng)隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增標(biāo)記寡核苷酸芯片
1. 探針的設(shè)計(jì)合成
利用探針設(shè)計(jì)軟件ArrayDesigner4.2，按照探針設(shè)計(jì)原則G+ C含量為50%-70%; Tm值在(78士5廣C;連續(xù)重復(fù)的堿基《6個(gè)；探針?lè)肿觾?nèi)部互補(bǔ)堿基《6個(gè)；每一個(gè)探 針與非靶基因的相似性必須〈70%，探針連續(xù)同源的堿基數(shù)《18個(gè)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體及 錯(cuò)配盡可能少、解鏈溫度(TM值)值盡可能接近的探針；按每種病原體各設(shè)計(jì)兩條探針 (CMV-1、 CW-2、 ffiVI-1、 tBVI-2、 RV1 、 RV2、 EBV1 、 EBV2、 TBI和1B2)，同時(shí)設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照探針(PC )、 陰性對(duì)照探針(NO各一條；探針序列如下所示
CMV-1:艦-咖)6"ft)ly(dT)15
OGTCTCADGGIOOGGGOGGOCrGGADGOGTOmGAmGTGGAAAGAGOOOGADGTCWCrACA; CW-2: (ME"OE) 6"Fbly(cff)15
GAG0GGCAGAMJGGGraGADGA0GAGGTGGmG0GTGAGAAOGQraMmTQGGAGGAGA; ■-1: , (OE) frfbly(dT)15
GACMAO0CMO0GTO00GTAGTO0CAT0C0COGATOOCMCMCT00C0CGOGOGO0C0GAGACCAGTC; FBVI-2: ,( CH2) 64bly(dl)15
0CraOGTIUr0GTTOCTCACrG0Cro000CG00CTGGACACCCTCTT0GTOGTCAGCA0CGTCAT0CA; RV1: NH2- (CH2) 6"Poly(dT)15
OCAC0GACAO0GTGATGAGCGTGnTGO0CT0GOCAGCrACGT0CAGCAarrCACMGAO0GTO0G; RV2: NH2-咖)6~Poly(dT)15
OOOCGACrGGGCCrOOOCGGTmnMOGCCATroOOCTGACTGCTOGOGGCroGTGGG; TBI: NH2- (CH2) 6"Poly(dT)15
G0CMCATACGCG0CGAGTIOTGAAGAACTT0GTT0GTAGCAGCM0CTGMGrT0CAGGATGCGTACA; TB2: NH2-咖)6"Poly(dT)15
CTGOCAGAOTACAAGrGGGAMOCTTOCrGACCAGOGAGCrcCOGCMTGGTTGTOOGOCMCAG; EBV1: NH2- (CH2) &"Poly(dT)15
OGTCDCGTAGTOOCAT00O0CGAT00CMCMCT0CC0CGOGOGC000GAGAOCAGTOGO00GMGACAC; EBV2: NH2- (CH2) &"Poly(dT)15
OCAOGACACACTCATGMCAOCAOCAOGATGACTarroOOGCAOOCTCMCMGCTACOGAOGATICrA ; PC:, (OE) 6"fbly(dT) 15^Tanra 。 NC: NH2- (CH2) 6~Poly(dT)15
2. 芯片的制備
選擇上述設(shè)計(jì)的10條(MH、 CMV-2、 ffiVI-1、 2、 RV1、 RV2、 EBV1、 EBV2、 TBI和1B2探針用3XSSC分別稀釋成20mM,采用Cartisan5500點(diǎn)樣儀將探針點(diǎn)至到醛基化修飾的玻 片表面上，每個(gè)探針點(diǎn)四個(gè)重復(fù)，以Tamara修飾的探針(PC)為陽(yáng)性對(duì)照，以乙腦探 針(NC)為陰性對(duì)照，雙蒸水為空白對(duì)照。每個(gè)對(duì)照也點(diǎn)四個(gè)重復(fù)，陣列上探針的分布 如圖l所示.在濕盒中進(jìn)行水合溫育,水和溫度為37'C。過(guò)夜干燥。UV交聯(lián)，紫外能量 為3600 mj，將芯片放于2. 6g/L的NaBH4還原10min，洗脫后4 。C避光保存?zhèn)溆谩?3.靶基因的標(biāo)記
DNA隨機(jī)引物生物素間接標(biāo)記隨機(jī)引物PCR將選擇CMV的UL8基因和UL32 (BK000394) ,HSVI的UL4基因(NP—044666 ) ， RV的RVE1基因(AB080733) , EBV的 LMP〗基因(AY60133)， TB的AG85b基因(AY207396)擴(kuò)增標(biāo)記。擴(kuò)增體系10Xbuffer5 nl ， 25 mmol/L MgCl23ul， 0. 25,1 / L dNTP(TTP:Biotin-11-dUTP =4: 1比例混 合)混合物lul ， random primer (6mer) {隨機(jī)引物，購(gòu)于寶生物公司} 2ul， DNA模 板5ul. rTaq DNA聚合酶0.5ul， ddH2035pl ,短暫離心。擴(kuò)增程序94。C5min， 94 。C45s， 42。C45s, 72。C延伸lmin。擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min。
將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果，余下進(jìn)行芯片雜交。 4.樣品檢測(cè)
將熒光標(biāo)記的靶DNA序列溶于雜交液中(5XSSC 、 0. 5%SDS、 50%甲酰胺、0. 1%鮭 魚精DNA)，取標(biāo)記的DNA溶液加到芯片的表面，加蓋玻片(小心不要有氣泡)放入雜 交盒中，雜交溫度65'C，雜交時(shí)間為8h;取出后，先用2XSSC(0. 2WSDS)沖洗，再離 心。將avidin-cy3與芯片陣列雜交半小時(shí)，然后洗滌離心甩干。將芯片用Scanarray 4000 掃描儀掃描，掃描參數(shù)為激光強(qiáng)度100%,PMT100 %。用Quantarray 3. 0定量分析軟件 分析掃描圖像的熒光強(qiáng)度值。計(jì)算出每個(gè)陣列中陰性對(duì)照點(diǎn)4個(gè)重復(fù)點(diǎn)的平均值(mean) 和標(biāo)準(zhǔn)差(s)，得出95%的參考范圍(mean土2s)然后統(tǒng)計(jì)出每種探針的4個(gè)重復(fù)點(diǎn)熒 光值的平均值，若此平均值高于》-2s為陽(yáng)性，低于之-2s則為陰性，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。 實(shí)施例2芯片制備條件的優(yōu)化
1.1水合溫度的優(yōu)化選用CMV標(biāo)準(zhǔn)株DNA擴(kuò)增標(biāo)記，采用醛基化玻片為基片，水 合的溫度選用了 37°C、 55'C和65°C3個(gè)溫度紫外交聯(lián)的能量強(qiáng)度。選擇雜交效果最好的 溫度為水合溫度。
經(jīng)過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)表明水合的溫度用37。C雜交效果最好。
1.2紫外交聯(lián)的優(yōu)化選用CMV標(biāo)準(zhǔn)株DNA擴(kuò)增標(biāo)記，采用醛基化玻片為基片，紫 外交聯(lián)的能量分別選擇600mJ、 1200mJ和3600mJ，選擇雜交效果最好的能量結(jié)果。
經(jīng)過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)表明紫外交聯(lián)的能量選擇3600mJ雜交效果最好。
1. 3雜交液的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)如表1所示的12種雜交液在不同溫度(溫度分 別為42 °C、 55 。C、 65 。C)、不同雜交時(shí)間(雜交時(shí)間分別為2 h、 8 h、 16 h)的條 件下雜交信號(hào)的比較，來(lái)選擇長(zhǎng)片段探針最優(yōu)化的雜交條件。
其中雜交液成分如表1所示 __表l不同雜交液的成分_
NO. 雜交液 NO. 雜交液
1 50%甲酰胺5xSSC0.5%SDS 1。/o鮭魚精DNA 7 50%甲酰胺5xSSPE0.5%SDS P/。鮭魚精DNA
2 5xSSC 0.5%SDS 8 5xSSPE 0.5%SDS
83 5xSSC 0.5%SDS 5xdenhart
4 5xSSC 0.5%SDS 5xdenhart硫酸葡聚糖
5 5xSSC 0.1%TWEEN 1%鮭魚精DNA
6 5xSSC 0.5%SDS 1%鮭魚精DNA
9 5xSSPE 0.5%SDS 5xdenhart
10 5xSSPE0.5%SDS5xdenhart硫酸葡聚糖
11 5xSSPE 0.1%TWEEN 1%鮭魚精DNA
12 5 x SSPE 0.5%SDS 1 %鮭魚精DNA
經(jīng)過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)表明雜交液選擇為50%甲酰胺、5XSSC、 0.5%SDS、 0. 1%鮭魚精 DNA,雜交時(shí)間為8 h，雜交溫度為65 'C可以獲得最高的熒光強(qiáng)度。 結(jié)果確定
1. 探針濃度的確定
芯片雜交洗脫后，經(jīng)過(guò)掃描得到不同濃度的探針雜交后的掃描熒光強(qiáng)度。掃描結(jié)果 如圖3所示,可以看出探針濃度在10 umol/L時(shí)就可以得到滿意的效果，因此實(shí)驗(yàn)中采 用IO umol/L作為最終探針點(diǎn)樣濃度。
2. 寡核苷酸微陣列對(duì)耙基因檢測(cè)敏感性優(yōu)化
以EBV B95-8為實(shí)驗(yàn)菌株，提取其基因組DNA，各取2 p 1作為模版進(jìn)行熒光標(biāo)記擴(kuò) 增，標(biāo)記產(chǎn)物用核酸定量?jī)x進(jìn)行DNA定量，然后用雙蒸水1: 10定量稀釋為濃度為lng/ lU、 100pg/ul、 10pg/pl、 lpg/ul、 0. lpg/ix、 0.01pg/ixl六個(gè)濃度，與芯片雜 交，結(jié)果顯示在濃度為Ipg/Pl時(shí)，熒光強(qiáng)度值高于陽(yáng)性點(diǎn)熒光值的義-2s，顯示其敏 感性為lpg。
3. 芯片的雜交條件
綜合優(yōu)化條件試驗(yàn)的結(jié)果，采用70mer寡核苷酸探針，探針點(diǎn)樣后37'C水合，然后 在3600mJ條件下進(jìn)行紫外交聯(lián)固定效果最好。優(yōu)化出的雜交液成分為50%甲酰胺、5 XSSC、 0. 5%SDS、 0. 1W鮭魚精DNA，雜交時(shí)間為6-8h，雜交溫度為65。C。
4. 芯片對(duì)血清標(biāo)本的檢測(cè)應(yīng)用結(jié)果
應(yīng)用本發(fā)明的以biotin-avidin-cy3標(biāo)記系統(tǒng)隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增標(biāo)記的寡核苷酸芯 片進(jìn)行臨床中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性病原體標(biāo)本檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2:中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性病原體標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果
CMV HSVI RV TB EBV
+-+-+-+-+ -
Per detection471839181311413332 10
Chip detection45203721915363832 10
=0.167義2 =0.250義2 =2.250 =1.778,2=0.500
Chi-square test
p =0.683p =0,617p =0.134=0.182p =0.479
Kapp理vWucs0.7770.8380.7740.7580.869
sensitivity88.9%88.9%84.3%78.2%90.0%
specificity91.5%94.9%100%94.12%100%
a) Kappa>0.75,oonstatency Is satisfectDry ;b)p>0.05,no significance結(jié)果顯示本發(fā)明的寡合苷酸芯片檢測(cè)結(jié)果與臨床檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異，兩者具 有較高的符合率。
綜上所述，本發(fā)明的以biotin-avidin-cy3系統(tǒng)隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增標(biāo)記寡核苷酸芯 片與臨床常規(guī)檢測(cè)方法相比符合率較高，說(shuō)明采用biotin-avidin-cy3系統(tǒng)隨機(jī)引物 PCR擴(kuò)增標(biāo)記方法作為終點(diǎn)信號(hào)的檢測(cè)是可行的。建立的70mer長(zhǎng)片段寡核苷酸芯片技 術(shù)體系與現(xiàn)有的芯片技術(shù)相比，具有敏感性、特異性高的特點(diǎn)，是一種具有廣泛應(yīng)用前 景的技術(shù)體系。
權(quán)利要求
1.一種基于biotin-avidin-cy3反應(yīng)系統(tǒng)的隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增標(biāo)記的寡核苷酸芯片，由基片和陣列涂布于其上的CMV、HSVI、RV、EBV或TB病原體探針以及陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照制成，其特征在于所述基片是表面醛基化修飾的載玻片；所述病原體探針是10條70mer的、點(diǎn)樣濃度均為10μM的CMV-1、CMV-2、HSVI-1、HSVI-2、RV1、RV2、EBV1、EBV2、TB1和TB2探針；所述陰性對(duì)照為點(diǎn)樣濃度為10μM的JEV探針；所述陽(yáng)性對(duì)照為點(diǎn)樣濃度為10μM的合成標(biāo)記探針，探針的序列為NH2-(CH2)6-Poly(dT)15-Tamra；所述空白對(duì)照為雙蒸水；所述芯片的陣列布局如圖1所示；其中上述CMV-1、CMV-2、HSVI-1、HSVI-2、RV1、RV2、TB1、TB2、EBV1和EBV2探針具體序列為CMV-1NH2-(CH2)6-Poly(dT)15CGTCTCACGGTCTCGGGACTGGCCTGGACGCGTCAGCAGAACCAGTGGAAAGAGCCCGACGTCTACTACA；CMV-2(NH2-CH2)6-Poly(dT)15GAGCGGCAGAAACGGGTGGACGACGAGGTGGTGCAGCGTGAGAAACAGCAGCTGAAGGCTTGGGAGGAGA；HSVI-1NH2-(CH2)6-Poly(dT)15GACAAACCCAACCGTCCCGTAGTCCCATCCCCCGATCCCAACAACTCCCCCGCGCGCCCCGAGACCAGTC；HSVI-2NH2-(CH2)6-Poly(dT)15CCCCGCTGTTCTCGTTCCTCACTGCCTCCCCCGCCCTGGACACCCTCTTCGTCGTCAGCACCGTCATCCA；RV1NH2-(CH2)6-Poly(dT)15CCACCGACACCGTGATGAGCGTGTTTGCCCTCGCCAGCTACGTCCAGCACCCTCACAAGACCGTCCG；RV2NH2-(CH2)6-Poly(dT)15CCCCGACTGGGCCTCCCCGGTTTGCCAACGCCATTCCCCTGACTGCTCGCGGCTCGTGGG；TB1NH2-(CH2)6-Poly(dT)15GCCAACATACCCGCCGAGTTCTTGAAGAACTTCGTTCGTAGCAGCAACCTGAAGTTCCAGGATGCGTACA；TB2NH2-(CH2)6-Poly(dT)15CTGCCAGACTTACAAGTGGGAAACCTTCCTGACCAGCGAGCTGCCGCAATGGTTGTCCGCCAACAG；EBV1NH2-(CH2)6-Poly(dT)15CGTCCCGTAGTCCCATCCCCCGATCCCAACAACTCCCCCGCGCGCCCCGAGACCAGTCGCCCGAAGACAC；EBV2NH2-(CH2)6-Poly(dT)15CCACGACACACTGATGAACACCACCACGATGACTCCCTCCCGCACCCTCAACAAGCTACCGAGGATTCTA；所述陰性對(duì)照探針具體序列為NH2-(CH2)6-Poly(dT)15GTGCAAACAAGGTTTCACTGATCGTGGGTGGGGCAACGGATGTGGACTTTTCGGGAAGGGAAGCATTGAC。
2. 權(quán)利要求1所述基于biotin-avidin-cy3反應(yīng)系統(tǒng)的隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增標(biāo)記的寡 核苷酸芯片在檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性病原體中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述芯片應(yīng)用方法是基于 biotin-avidin-cy3反應(yīng)系統(tǒng)的隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增標(biāo)記靶序列實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢中樞神經(jīng)系統(tǒng) 感染性病原體特異基因同時(shí)擴(kuò)增標(biāo)記，然后與經(jīng)37'C水合、3600mJ條件下紫外交聯(lián)、 2. 6g/L的NaBH4還原過(guò)程處理后的權(quán)利要求l所述寡核苷酸芯片雜交反應(yīng)，再于雜交盒中 與Avidin-cy3反應(yīng)，之后將芯片洗脫甩干用掃描儀掃描，進(jìn)行病原體檢測(cè)。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述芯片應(yīng)用方法是先將biotin—11-dUTP通過(guò)隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增摻入到靶序列，然后與陣列涂布有病原體探針的寡核苷酸芯片在 雜交盒中65'C雜交6 8h,洗脫甩干后、在雜交盒中與Avidin-cy3在37'C下反應(yīng)30rain 40min，將芯片洗脫甩干用Scanarray 4000掃描儀掃描，用Quantarray 3. 0定量分析軟件分析掃描圖像的熒光強(qiáng)度值。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述將biotin—ll-dUTP通過(guò)隨機(jī)引物 PCR擴(kuò)增摻入到靶序列的方法是將選擇的CMV、 HSVI、 RV、 EBV或TB病原體靶序列基因 擴(kuò)增標(biāo)記，使biotin-11-dUTP摻入到靶序列中去；反應(yīng)體系中的引物為6mer的random primer ， dNTP為TTP:Biotin-11-dUTP =4 : 1混合，解鏈溫度為42。C。
6. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述雜交中使用的雜交液成分是50%甲 酰胺、5XSSC、 0.5%SDS、 0. 1X鮭魚精DNA。
7. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述洗脫中使用的洗脫液成分是2XSSC、 0.2%SDS。
8. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述avidin-cy3的濃度為0.05mM。
9. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述掃描儀掃描的參數(shù)為激光強(qiáng)度100%， PMT100%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于biotin-avidin-cy3反應(yīng)系統(tǒng)的隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增標(biāo)記的寡核苷酸芯片，由基片和陣列涂布于其上的CMV、HSVI、RV、EBV或TB病原體探針以及陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照制成，其中所述基片是表面醛基化修飾的載玻片；所述病原體探針是10條70mer的CMV-1、CMV-2、HSVI-1、HSVI-2、RV1、RV2、EBV1、EBV2、TB1和TB2探針；所述陰性對(duì)照為JEV探針；所述陽(yáng)性對(duì)照為合成標(biāo)記探針；所述空白對(duì)照為雙蒸水；本發(fā)明用隨機(jī)引物同時(shí)對(duì)多種病原體靶序列進(jìn)行biotin-11-dUTP擴(kuò)增標(biāo)記，并采用biotin-avidin-cy3信號(hào)放達(dá)系統(tǒng)增加標(biāo)記效率的方法進(jìn)行病原體的檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)成本和時(shí)間明顯縮短。本發(fā)明的技術(shù)體系能適用于臨床檢測(cè)，衛(wèi)生監(jiān)督，海關(guān)檢疫及科研等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101586149SQ200810016888
公開(kāi)日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2008年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月24日
發(fā)明者龐靖祥, 韓金祥, 高雪芹 申請(qǐng)人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心