本發(fā)明專利涉及化工有機(jī)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體是氟氰戊菊酯分子印跡固相萃取柱的制備方法及在煙葉分析中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

氟氰戊菊酯是一種廣譜性擬除蟲菊酯類殺蟲劑，近年來在我國(guó)已被廣泛應(yīng)用于預(yù)防煙草害蟲。

按中國(guó)農(nóng)藥毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，氟氰戊菊酯及其結(jié)構(gòu)類似物屬于低毒殺菌劑，雄性大鼠急性經(jīng)口 LD₅₀為81mg/kg，雌性為67mg/kg。超標(biāo)使用必然會(huì)導(dǎo)致煙草制品及食品的安全出現(xiàn)隱患，相關(guān)檢測(cè)部門給予高度的重視。

氟氯戊菊酯及其結(jié)構(gòu)類似物對(duì)于人體有不良干擾作用。這些物質(zhì)主要導(dǎo)致：

⑴損害神經(jīng)系統(tǒng)；

⑵皮膚黏膜刺激性傷害。

由于煙草成分復(fù)雜，致使干擾成分增加，而分析物處于痕量狀態(tài)，樣品前處理（分離待檢物）成為安全分析的關(guān)鍵步驟。目前傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)存在處理時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣、選擇性差等缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種氟氯戊菊酯分子印跡固相萃取柱的制備方法，克服了現(xiàn)有固相萃取方法的不足，應(yīng)用于煙葉中氟氯戊菊酯及其結(jié)構(gòu)類似物殘留分析中。

本發(fā)明技術(shù)方案步驟如下：

a、選取氟氰戊菊酯與α-甲基丙烯酸的摩爾配比為1:6；將模板分子氟氰戊菊酯0.1mmol和功能單體α-甲基丙烯酸MAA0.6mmol，放入50mL的安瓿瓶中；

b、安瓿瓶中加入18mL四氫呋喃使其反應(yīng)，振搖；

c、將在b步驟得到的溶液中再加乙二醇二甲基丙烯酸酯EDMA 8mmol和偶氮二異丁腈AIBN 0.03g；超聲1h后，通入N₂ 脫氧15min后，抽真空1min后密封；

d、將步驟c得到的反應(yīng)體系在60℃的恒溫水浴中靜置15h，得塊狀白色固體氟氰戊菊酯分子印跡聚合物MIP；

e、將步驟d中所得印跡聚合物經(jīng)研磨、粉碎，過200目篩，再用去離子水沉降聚合物3次除去過細(xì)粉末；將最終得到的MIP顆粒用甲醇:乙酸（體積比95:5）洗脫至無模板分子，最后用甲醇浸泡1h除去殘留的乙酸，洗脫后的聚合物放入真空干燥器中，40℃條件下，干燥10h，得到具有特異性識(shí)別的氟氰戊菊酯分子印跡聚合物MIP；

f、稱取步驟e中所制備的分子印跡聚合物MIP100g，溶于水中裝入內(nèi)徑為1.5cm的固相萃取空柱內(nèi)，用固相萃取裝置將水抽出后，再用水淋洗柱子，最后在上端再加上少許脫脂棉，輕輕擠壓使柱子填充緊實(shí)備用，即制備成氟氰戊菊酯分子印跡固相萃取柱。

進(jìn)一步，所述的致孔劑為四氫呋喃。

進(jìn)一步，所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯。

進(jìn)一步，所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈。

一種采用上述方法制備的氟氰戊菊酯分子印跡固相萃取柱在煙葉分析中的應(yīng)用，具體步驟如下：

a、繪制氟氰戊菊酯的線性關(guān)系曲線及檢測(cè)限

將氟氰戊菊酯分別配制成質(zhì)量濃度為200、100、50、20、10、5、2、1、0.5μg/mL的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制氟氰戊菊酯的線性關(guān)系曲線；

氟氰戊菊酯的線性關(guān)系及檢測(cè)限

b、新鮮煙葉樣品前處理

稱取5.000 g新鮮煙葉樣品，搗碎，加入6.000 g無水硫酸鈉，用以除去樣品中過多的水分，加入10 mL四氫呋喃混勻，超聲15 min，于4000 r/min離心10 min，收集分離液；再加入10 mL四氫呋喃混勻，超聲15 min，于4000 r/min離心10 min，收集分離液與頭次分離液合并，過氟氰戊菊酯分子印跡固相萃取柱，用20 mL水淋洗，待排凈淋洗液后，用10 mL甲醇洗脫，收集洗脫液留待色譜檢測(cè)；

c、色譜檢測(cè)條件

色譜柱：agela C18（4.6×150 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)200nm，流動(dòng)相為甲醇-水，甲醇：水體積比為90:10，流速1 mL/min，柱溫為25℃，進(jìn)樣量20 μL；

d、分析檢測(cè)結(jié)果

利用利用a步驟繪制的氟氰戊菊酯的性關(guān)系曲線線性關(guān)系曲線分析色譜檢測(cè)結(jié)果。

本發(fā)明采用本體聚合方法制備氟氯戊菊酯分子印跡聚合物，所制備的聚合物經(jīng)研磨、漂洗、過篩、洗脫、干燥等一系列處理后，再經(jīng)高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)分析即可得到具有特異性吸附效果的聚合物材料，并制備成分子印跡固相萃取柱，用于樣品凈化，對(duì)煙葉中氟氯戊菊酯進(jìn)行分離和富集，用于對(duì)氟氯戊菊酯的檢測(cè)分析。

本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路為：

固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）具有較多優(yōu)勢(shì)，如具有高的回收率和高的富集倍數(shù)；使用有機(jī)溶劑少，減少了對(duì)環(huán)境的污染；固相分離操作易于收集分析物組分，能處理小體積試樣；操作簡(jiǎn)單快速，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

分子印跡聚合物（Molecularly Imprinted Polymers，MIPs）是指為獲得在空間構(gòu)型和結(jié)合位點(diǎn)上與某一目標(biāo)化合物（模板分子或印跡分子）完全匹配的高分子聚合物，分子印跡技術(shù)被形象的比喻為制造識(shí)別“分子鑰匙”的“人工鎖”技術(shù)。

MIPs作為SPE的吸附劑可以彌補(bǔ)普通吸附劑選擇性差的不足，而且要比免疫吸附劑的穩(wěn)定性好，還可以重復(fù)使用，使痕量被分析物在復(fù)雜樣品中得到分離富集。

選擇分子印跡固相萃取技術(shù)是指為獲得在空間構(gòu)型和結(jié)合位點(diǎn)上與某一目標(biāo)化合物（模板分子或印跡分子）完全匹配的高分子聚合物，分子印跡技術(shù)被形象的比喻為制造識(shí)別“分子鑰匙”的“人工鎖”技術(shù)。

分子印跡固相萃取技術(shù)能夠克服煙葉樣品體系復(fù)雜、預(yù)處理繁瑣等不利因素，達(dá)到分離純化的目的，從而降低檢測(cè)限，提高分析的精密度和準(zhǔn)確性，為痕量組分的富集和分析提供極大的方便。

分子印跡固相萃取技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)對(duì)目標(biāo)物能進(jìn)行特異性吸附；(2)能耐高溫、高壓、有機(jī)溶劑；(3)重復(fù)使用次數(shù)多；⑷穩(wěn)定性好、使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。它克服了樣品體系復(fù)雜、預(yù)處理繁瑣等缺點(diǎn)，因此它已成為分子印跡技術(shù)在分析檢測(cè)中最具應(yīng)用前景的研究熱點(diǎn)。

本發(fā)明的有益效果是所提供的分子印跡固相萃取柱可用于煙葉中氟氰戊菊酯以及結(jié)構(gòu)類似物的選擇性吸附和富集，適合煙草檢測(cè)單位、科研單位及卷煙生產(chǎn)企業(yè)對(duì)產(chǎn)品的監(jiān)控時(shí)使用。與普通的固相萃取柱相比，分子印跡固相萃取柱具有制備過程簡(jiǎn)單、特異性好、重現(xiàn)性高、分離效果好、回收率高、可反復(fù)使用、精密度高等特點(diǎn)。

附圖說明

圖1氟氰戊菊酯與MAA功能單體紫外吸收光譜；

圖2氟氰戊菊酯與AM功能單體紫外吸收光譜；

圖3氟氰戊菊酯分子印跡聚合物300nmSEM圖；

圖4氟氰戊菊酯分子印跡聚合物500nmSEM圖；

圖5氟氰戊菊酯分子印跡聚合物1.00umSEM圖；

圖6新鮮煙葉Ⅰ樣品洗脫液色譜圖；

圖7新鮮煙葉Ⅱ樣品洗脫液色譜圖；

圖8氟氰戊菊酯分子印跡固相萃取柱結(jié)構(gòu)示意圖；

圖9本發(fā)明反應(yīng)中的分子結(jié)構(gòu)圖。

圖中：M為氟氰戊菊酯；MAA為α-甲基丙烯酸；AM為丙烯酰胺；E1為混合物實(shí)際測(cè)定吸光值；E2為混合物理論吸光值；氟氰戊菊酯分子印跡聚合物（未洗脫前空穴狀態(tài)）為具有特異性識(shí)別的分子印跡聚合物；氟氰戊菊酯分子印跡聚合物（洗脫后空穴狀態(tài)）為待重復(fù)利用時(shí)的具有特異性識(shí)別的分子印跡聚合物。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例可使專業(yè)技術(shù)人員全面理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

在制備氟氰戊菊酯分子印跡固相萃取柱之前，本發(fā)明作了如下前期試驗(yàn)：

（一）功能單體種類的確定

由于混合物在同一波長(zhǎng)下紫外吸光值小于模板物質(zhì)與功能單體分別測(cè)定的紫外吸光值的加和（即理論吸光值），可知模板物質(zhì)與功能單體間發(fā)生了相互作用（如圖1、圖2所示）。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，氟氰戊菊酯-MAA實(shí)測(cè)值與理論值差值為1.956，氟氰戊菊酯-AM實(shí)測(cè)值與理論值差值為1.910。由差值看出氟氰戊菊酯與MAA結(jié)合力較大，證明了利用MAA合成的分子印跡聚合物對(duì)氟氯戊菊酯具有更好的穩(wěn)定性和特異識(shí)別能力。

（二）不同比例功能單體對(duì)MIP吸附能力的影響

合成MIP時(shí)，體系內(nèi)模板物質(zhì)與功能單體的配比不同其對(duì)氟氯戊菊酯的特異性吸附能力的表現(xiàn)也不同，過多或者過少的功能單體都會(huì)降低分子印跡聚合物的特異性吸附能力。主要原因是功能單體不足則形成的識(shí)別位點(diǎn)少，而過多的功能單體會(huì)被無規(guī)則固定在交聯(lián)劑內(nèi)從而導(dǎo)致非特異性識(shí)別位點(diǎn)增加從而降低吸附性能。所以可以通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)來確定最佳配比。

定義印跡因子IF，

IF=Q_MIP/Q_NMIP

Q_MIP——MIP吸附氟氯戊菊酯的量

Q_NMIP——空白印跡聚合物對(duì)氟氯戊菊酯的結(jié)合量

IF值越大分子印跡的效果越好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。

表1功能單體加入量對(duì)聚合物吸附性能的影響

從表1的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得出，模板物質(zhì)與功能單體MAA的摩爾比為1:6時(shí)，聚合的MIP不僅吸附量大而且印跡效果好；造成這個(gè)結(jié)果的原因?yàn)樵诜任炀挣ヅc功能單體MAA的摩爾比為1:2和1:4時(shí)，ɑ-甲基丙烯酸未與氟氯戊菊酯充分結(jié)合，使聚合的MIP吸附量?。欢^高的氟氯戊菊酯與功能單體MAA的摩爾比（如1:8）時(shí)，過量的ɑ-甲基丙烯酸被固定到MIP內(nèi)，經(jīng)研磨暴露出來，導(dǎo)致聚合的MIP非特異性結(jié)合點(diǎn)增多，所以印跡效果差。故本實(shí)驗(yàn)利用氟氯戊菊酯與功能單體MAA的摩爾比為1:6作為最佳配比聚合。

（三）致孔劑及用量的選擇

1.致孔劑選擇

1.1化學(xué)分析法

稱取一定量的氟氰戊菊酯，分別使用乙腈、四氫呋喃和甲醇溶解，配制成0.5mmol/L的溶液，再加入α-甲基丙烯酸（MAA），配制成乙腈為溶劑的氟氰戊菊酯與MAA濃度比1:2、1:4、1:6、1:8、1:10的系列溶液，四氫呋喃與甲醇為致孔劑的溶液配制同上，測(cè)定其紫外光譜。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用乙腈為致孔劑，溶液最大吸收波長(zhǎng)紅移了1nm；使用四氫呋喃為致孔劑，溶液最大吸收波長(zhǎng)紅移了4nm；使用甲醇為致孔劑，溶液最大吸收波長(zhǎng)紅移了2nm。結(jié)果表明四氫呋喃為致孔劑，氟氰戊菊酯與MAA間產(chǎn)生了較強(qiáng)的分子間作用力，所以選擇四氫呋喃為致孔劑。

1.2聚合物物理狀態(tài)分析

乙腈作為致孔劑合成物為乳白色液體，未達(dá)到聚合狀態(tài)；四氫呋喃作為致孔劑合成物為白色多孔固體；甲醇作為致孔劑合成物為黃色透明固體，未達(dá)到合成多孔聚合物的目的。所以本實(shí)驗(yàn)選擇四氫呋喃為致孔劑。

2.致孔劑用量選擇

實(shí)驗(yàn)通過比對(duì)三組致孔劑使用量合成的聚合物狀態(tài)，確定致孔劑用量。三組聚合物分別加入致孔劑9mL、18mL和27mL，致孔劑加入9mL的聚合物致孔不完全有黃色透明固體；致孔劑加入18mL的聚合物致孔完全且無多余液體；致孔劑加入28mL安瓿瓶中有固體沉淀，震蕩后成懸濁液，為未聚合狀態(tài)。所以選擇致孔劑四氫呋喃的用量為18mL。

（四）充N₂時(shí)間對(duì)聚合時(shí)間的影響

實(shí)驗(yàn)過程中，在熱引發(fā)聚合前需要在液體內(nèi)通入氮?dú)?，其目的為將液體內(nèi)部溶解的氧氣排除，因?yàn)檠踝杂苫鶎?dǎo)致交聯(lián)劑鏈增長(zhǎng)終止或按非預(yù)期設(shè)想的方式增長(zhǎng)，且為了避免不受控聚合情況的發(fā)生，所以對(duì)聚合前體系充入氮?dú)狻５浅淙氲獨(dú)鈺r(shí)間對(duì)聚合時(shí)間及聚合物的量有一定的影響。

實(shí)驗(yàn)研究了充氮?dú)? min、15 min以及30 min三種情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制作氟氰戊菊酯分子印跡聚合物時(shí)，30 min后三個(gè)燒瓶?jī)?nèi)都出現(xiàn)了乳白色聚合物，充氮?dú)?5 min和25 min產(chǎn)生的聚合物與反應(yīng)前溶劑的百分含量呈正相關(guān)，充氮?dú)? min產(chǎn)生的聚合物的量較少，主要原因是充氮?dú)? min不能將溶液中溶氧完全趕出。在充氮?dú)?5 min和25 min條件下，反應(yīng)5小時(shí)后聚合物生成，繼續(xù)加熱聚合物量不再增加。而充氮?dú)?5 min產(chǎn)生聚合物的量明顯小于充氮?dú)? min和15 min所產(chǎn)生的聚合物，因?yàn)槌涞獨(dú)?5 min會(huì)使致孔劑大量揮發(fā)。所以本實(shí)驗(yàn)選擇充氮?dú)?5 min。

實(shí)施例：

氟氰戊菊酯分子印跡聚合物的制備

將氟氰戊菊酯0.1mmol和0.6mmol的α-甲基丙烯酸（MAA），放入50mL的安瓿瓶中，加18mL四氫呋喃使其反應(yīng)，振搖，再加交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA） 8mmol和引發(fā)劑偶氮二異丁腈（AIBN） 0.03g。超聲1h后通入N₂ 脫氧15min后，抽真空1min后密封，在60℃的恒溫水浴中靜置15h，得塊狀白色固體MIP。經(jīng)研磨、粉碎，過200目篩，再用去離子水沉降聚合物3次除去過細(xì)粉末。將最終得到的MIP顆粒用甲醇:乙酸（體積比95:5）洗脫至無模板分子，最后用甲醇浸泡1h除去殘留的乙酸，洗脫后的聚合物放入真空干燥器中（40℃）干燥10h，得到氟氰戊菊酯分子印跡聚合物MIP，用發(fā)射場(chǎng)掃描電鏡觀察其外觀，如圖3-圖5所示。圖9表示本發(fā)明反應(yīng)中的分子結(jié)構(gòu)變化。

分子印跡固相萃取柱的制備

稱取100mg的氟氰戊菊酯分子印跡聚合物MIP，溶于水中裝入內(nèi)徑為1.5cm的固相萃取空柱內(nèi)，用固相萃取裝置將水抽出后，再用水淋洗柱子，最后在上端再加上少許脫脂棉，輕輕擠壓使柱子填充緊實(shí)備用。固相萃取柱如圖8所示。

氟氰戊菊酯分子印跡固相萃取柱在新鮮煙葉檢測(cè)中應(yīng)用

a、樣品前處理

分別稱取5.000 g樣品（新鮮煙葉），搗碎，加6.000 g無水硫酸鈉（用以除去樣品中過多的水分），用20 mL四氫呋喃浸溶，并提取兩次，每次10 mL，混勻；超聲15 min，于4000 r/min離心10 min，吸取上清液過分子印跡固相萃取柱，用20 mL水淋洗，待排凈淋洗液后，用10 mL甲醇洗脫，收集洗脫液待檢。

b、線性關(guān)系與檢測(cè)限

將氟氰戊菊酯分別配制成質(zhì)量濃度為200,100,50,20,10,5，2,1,0.5μg/mL的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制氟氰戊菊酯的線性關(guān)系曲線；其線性關(guān)系與檢測(cè)限結(jié)果如表2所示：

表2 氟氰戊菊酯的線性關(guān)系及檢測(cè)限

應(yīng)是用線性關(guān)系，分析新鮮煙葉Ⅰ，新鮮煙葉Ⅱ中的氟氰戊菊酯含量。

c、回收率和精密度試驗(yàn)

采用本方法對(duì)新鮮煙葉Ⅰ，新鮮煙葉Ⅱ，在1 μg/g和100μg/g 2個(gè)添加水平下，進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，分析結(jié)果如表3所示，平均回收率在96.7%～99.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.93%～2.18%之間（n=5）。說明本發(fā)明方法的回收率和精密度良好。

表3 新鮮煙葉Ⅰ、新鮮煙葉Ⅱ的回收率和精密度試驗(yàn)（n=5）

以上借助較佳的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行的詳細(xì)說明是示意性的而非形式上的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明說明書的基礎(chǔ)上，可以對(duì)實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換，而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。