本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域，具體涉及一種新型抗體高選擇性吸附配基及其應(yīng)用。

技術(shù)背景

抗體蛋白具有優(yōu)良的生理活性，在免疫學(xué)、生物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。近年來，隨著免疫學(xué)和基因工程學(xué)的快速發(fā)展，抗體的需求量越來越大，因此，獲取低成本、高純度和高生物活性的抗體蛋白已成為生物化工領(lǐng)域的重要研究方向。

圍繞抗體蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)將抗體蛋白從血漿或細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)分離發(fā)展了多種抗體蛋白純化方法，包括鹽析，非親和層析和親和層析等。鹽析法利用高濃度的鹽溶液破壞抗體表面的水化層，使抗體表面的電荷中和從而析出。該方法操作較為簡單，但往往需要料液中抗體濃度較高，而且析出的抗體蛋白純度和活性較低。

非親和層析包括排阻色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜、反向色譜和羥磷灰石色譜等。排阻色譜法依據(jù)分子大小分離蛋白，配基通常為惰性載體，操作條件簡單溫和，但分離時間長，效率低。疏水作用色譜是利用目標(biāo)產(chǎn)物和配基間疏水相互作用分離目標(biāo)產(chǎn)物，該方法通常具有鹽依賴性，得到的抗體蛋白純度較低。離子交換色譜利用基質(zhì)與蛋白之間的靜電作用實現(xiàn)蛋白分離，該方法操作簡單、分離效果好、料液處理量大，但通常需要對蛋白溶液進(jìn)行前處理。

親和層析是在基質(zhì)上引入特異性識別蛋白的活性生物分子(如酶底物、抗原等)從而達(dá)到分離蛋白目的。目前抗體蛋白生產(chǎn)工藝中使用最廣泛的是蛋白A親和層析，該方法結(jié)合抗體蛋白的特異性高，缺點是介質(zhì)價格昂貴，純化抗體蛋白的容量有限，且蛋白配基易降解脫落，重復(fù)使用次數(shù)有限，操作成本較高。

綜上所述，目前非親和層析方法存在的主要問題是抗體蛋白吸附特異性不夠高；蛋白A親和層析法價格昂貴，并且存在蛋白配基降解脫落的問題。因此，尋找一種特異性高、成本低廉的新型抗體蛋白結(jié)合配基具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的首先在于提供一種特異性高、成本低廉的新型抗體蛋白識別及吸附配基。本發(fā)明所述的擔(dān)載型抗體高選擇性吸附配基，由載體及結(jié)合于載體表面的吸附配基組成，所述的配基具有通式I的結(jié)構(gòu)：

通式I中，

所述的X是S、O或NH；

所述的Y是H或CH₃；

所述的n是不小于2的整數(shù)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供所述擔(dān)載型抗體高選擇性吸附配基的制備方法，該方法包括如下步驟：

(1)將載體分散于二乙烯基砜(DVS)溶液中，反應(yīng)后離心分離，固體用無水乙醇洗滌，得到乙烯基砜活化的載體材料；

(2)將乙烯基砜活化的載體材料分散于聚乙二醇溶液，反應(yīng)后離心分離，固體用無水乙醇洗滌，得到擔(dān)載型抗體高選擇性吸附配基。

本發(fā)明所述的擔(dān)載型抗體高選擇性吸附配基以聚乙二醇鏈為功能配基，并采用砜基結(jié)構(gòu)連接載體和聚乙二醇鏈，能夠高效地選擇性結(jié)合免疫球蛋白(IgG)，并且有效抵抗血清雜蛋白的吸附。

基于此，本發(fā)明再一方面的目的在于提供所述擔(dān)載型抗體高選擇性吸附配基在在抗體蛋白特異性識別與吸附中的應(yīng)用。

所述應(yīng)用的環(huán)境條件包括：pH為5～9且有0～0.6M的NaCl存在。其中pH優(yōu)選7～8，最優(yōu)選7.45；NaCl濃度優(yōu)選0.15M。

附圖說明

本發(fā)明附圖7幅，用以對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。

圖1是實施例1制備硅納米粒子擔(dān)載的抗體蛋白特異性吸附配基各步產(chǎn)物¹H NMR表征；

圖2是雜原子對配基選擇性的影響；

圖3是聚乙二醇鏈長對配基選擇性的影響；

圖4是溶液pH對蛋白選擇性的影響；

圖5是溶液鹽濃度對蛋白選擇性的影響；

圖6是實施例1所制備的硅納米粒子擔(dān)載的抗體蛋白特異性吸附配基選擇性吸附混合蛋白溶液中IgG凝膠電泳圖；a蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；b IgG蛋白對照；c BSA蛋白對照；d在0.2mg/mL IgG溶液中孵育的磁性納米粒子；e在0.2mg/mL IgG溶液(含0.02mg/mL BSA)中孵育的磁性納米粒子；f在0.2mg/mL IgG溶液(含0.2mg/mL BSA)中孵育的磁性納米粒子；g在0.2mg/mL IgG溶液(含2mg/mL BSA)中孵育的磁性納米粒子；h在0.2mg/mL BSA溶液中的孵育磁性納米粒子。

圖7本發(fā)明公布的配基選擇性吸附血清溶液中IgG凝膠電泳圖；a蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；b IgG蛋白對照；c在0.2mg/mL IgG溶液中孵育的磁性納米粒子；d在0.2mg/mL IgG溶液(含10％血清)中孵育的磁性納米粒子。

具體實施方式

本發(fā)明所公開的擔(dān)載型抗體高選擇性吸附配基，由載體及結(jié)合于載體表面的吸附配基組成，其結(jié)構(gòu)可以表示為通式II：

該通式II中，配基與載體經(jīng)配基結(jié)構(gòu)中的砜基結(jié)合，所述配基以通式I表示：

上述通式I和II中，所述的X是S、O或NH；優(yōu)選NH；

所述的Y是H或CH₃；

所述的n是不小于2的整數(shù)，優(yōu)選2≤n≤75，尤其優(yōu)選30≤n≤40。

本發(fā)明的擔(dān)載型抗體高選擇性吸附配基中所述的載體是具有表面氨基或氨基功能化的親水性微球。尤其優(yōu)選氨基功能化的二氧化硅微球或瓊脂糖凝膠微球。

本發(fā)明進(jìn)一步提供所述擔(dān)載型抗體高選擇性吸附配基的制備方法，包括如下步驟：

(1)將載體分散于二乙烯基砜(DVS)溶液中，反應(yīng)后離心分離，固體用無水乙醇洗滌，得到乙烯基砜活化的載體材料；

其中，二乙烯基砜(DVS)溶液體積濃度為0.5～30％，優(yōu)選5～20％

所述的反應(yīng)條件pH為8～11，優(yōu)選9～10。

所述的反應(yīng)溫度20～60℃，優(yōu)選20～40℃。

所述的反應(yīng)時間1～12h，優(yōu)選8～12h。

(2)將乙烯基砜活化的載體材料分散于聚乙二醇溶液，反應(yīng)后離心分離，固體用無水乙醇洗滌，得到擔(dān)載型抗體高選擇性吸附配基。

其中，所述的聚乙二醇包括但不限于氨基聚乙二醇、羥基聚乙二醇和巰基聚乙二醇，其中優(yōu)選氨基聚乙二醇；

所述的聚乙二醇的濃度為1～50mM，優(yōu)選10～20mM；

所述的乙烯基砜活化的載體材料與聚乙二醇的反應(yīng)pH條件根據(jù)具體的原料類型有所偏好：含氨基聚乙二醇的反應(yīng)pH為8～11，優(yōu)選9～10；含羥基聚乙二醇的反應(yīng)pH為10～12，優(yōu)選11～12；含巰基聚乙二醇的反應(yīng)pH為6～9，優(yōu)選7～8。

該步驟(2)所述的反應(yīng)溫度20～60℃，優(yōu)選20～40℃。

所述的反應(yīng)時間1～12h，優(yōu)選8～12h。

容易理解，上述優(yōu)選范圍內(nèi)的參數(shù)選擇可以構(gòu)成所述制備方法的優(yōu)選的具體實施方式。

作為舉例，本發(fā)明所述的擔(dān)載型抗體高選擇性吸附配基的制備方法包括如下步驟：

(1)將載體材料分散于體積濃度為0.5～30％的二乙烯基砜(DVS)溶液中，使體系pH為8～11，并于20～60℃條件下反應(yīng)1～12h；離心分離，固體用無水乙醇洗滌，得到乙烯基砜活化的載體材料；

(2)將乙烯基砜活化的載體材料分散于濃度為1～50mM的氨基聚乙二醇溶液，使體系pH為8～11，并于20～60℃條件下反應(yīng)1～12h；離心分離，固體用無水乙醇洗滌，得到擔(dān)載型抗體高選擇性吸附配基。

更為優(yōu)選的實施方式中，所述的制備方法包括如下步驟：

(1)將載體材料分散于體積濃度為5～20％的二乙烯基砜(DVS)溶液中，使體系pH為9～10，并于20～40℃條件下反應(yīng)8～12h；離心分離，固體用無水乙醇洗滌，得到乙烯基砜活化的載體材料；

(2)將乙烯基砜活化的載體材料分散于濃度為10～20mM的氨基聚乙二醇溶液，使體系pH為9～10，并于20～40℃條件下反應(yīng)8～12h；離心分離，固體用無水乙醇洗滌，得到擔(dān)載型抗體高選擇性吸附配基。

以下對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明，實施例中選取免疫球蛋白(IgG)作為抗體蛋白模型，選取牛血清白蛋白(BSA)作為雜蛋白模型。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

實施例1

以硅納米粒子為基底的層析介質(zhì)的制備與表征

取100mg硅納米球，硝酸溶液(pH 4)處理30min，無水乙醇洗滌。加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液(2％，v/v)反應(yīng)過夜。離心分離，無水乙醇洗滌。分散于DVS溶液(1M，pH 9.5)反應(yīng)過夜。離心分離，無水乙醇洗滌。加入氨基三聚乙二醇單甲醚溶液(20mM，pH 9.5)超聲分散，反應(yīng)過夜。離心分離，無水乙醇洗滌。每一步均使用¹H-NMR表征。結(jié)果如圖1所示，在裸硅納米粒子的譜圖中，未觀察到有機物譜峰；APTES修飾硅納米粒子的譜圖中，依次出現(xiàn)了與氨基相連的CH₂峰，與Si相連的CH₂峰；DVS修飾硅納米粒子的譜圖中，出現(xiàn)了乙烯基的特征峰；氨基三聚乙二醇單甲醚修飾的硅納米粒子的譜圖中出現(xiàn)了聚乙二醇鏈特征峰，同時乙烯基的特征峰消失，說明通過三步反應(yīng)我們成功在硅納米粒子表面固定了抗體特異性吸附配基。

實施例2

IgG和BSA靜態(tài)吸附

根據(jù)實施例1中所述的步驟，使用NH₂PEG2000在二氧化硅包裹的磁納米粒子表面固定抗體蛋白特異性吸附配基。取1mg二氧化硅包裹的四氧化三鐵磁性納米粒子，分別再加入0.5ml IgG和BSA溶液(1mg/ml，pH 7.5)，超聲分散，25℃孵育15分鐘。磁鐵分離，收集上清液，使用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.5)洗滌磁性納米粒子三次并收集洗滌液。用BCA試劑盒定量未被吸附的IgG和BSA濃度，并計算IgG和BSA的吸附量。

IgG吸附量＝原液中IgG含量－未被吸附的IgG含量

BSA吸附量＝原液中BSA含量－未被吸附的BSA含量

實施例3

雜原子對配基選擇性的影響

根據(jù)實施例1所述的步驟，分別使用SH PEG2000，NH₂PEG2000和OH PEG 2000在二氧化硅包裹的磁納米粒子表面固定抗體蛋白特異性吸附配基。并且在二氧化硅包裹的磁納米粒子氨基化之后，直接用NHS PEG2000偶聯(lián)PEG2000制備不含砜基的配基結(jié)構(gòu)作為對照。根據(jù)實施例2所述蛋白靜態(tài)吸附方法，測定IgG和BSA在不同配基上的吸附量，結(jié)果如圖2所示。只含PEG、不含砜基的配基對IgG和BSA的吸附量均比較低，表明了聚乙二醇鏈具有較好的抗蛋白吸附作用。而同時含砜基和PEG配基的對IgG有較高的吸附量，而對BSA吸附量較低，表明了砜基基團(tuán)對IgG的識別作用。

NH₂PEG2000和OH PEG2000配基的蛋白選擇性均高于SH PEG2000配基的蛋白選擇性，并且與SH PEG2000配基相比，二者的化學(xué)穩(wěn)定性也更好，因此雜原子優(yōu)選NH和O?？紤]到羥基反應(yīng)活性低，配基固定效率低，最優(yōu)選氮原子。

實施例4

聚乙二醇鏈長對配基選擇性的影響

根據(jù)實施例1所述的步驟，分別使用氨基乙醇、NH₂EG₃、NH₂PEG1000、NH₂PEG2000和NH₂PEG5000在二氧化硅包裹的磁納米粒子表面固定抗體蛋白特異性吸附配基。根據(jù)實施例2所述蛋白靜態(tài)吸附方法，我們對NH₂PEG鏈長的影響進(jìn)行了評價，結(jié)果如圖3所示。隨著PEG鏈長增長，BSA的吸附量逐漸減少，而IgG的吸附量幾乎不變；當(dāng)PEG鏈長n大于40，BSA吸附量近乎維持恒定，因此優(yōu)選PEG 2000(n＝30～40)作為最優(yōu)鏈長。

實施例5

溶液pH對蛋白選擇性的影響

根據(jù)實施例1所述的步驟，使用NH₂PEG2000在二氧化硅包裹的磁納米粒子表面固定抗體蛋白特異性吸附配基。根據(jù)實施例2所述蛋白靜態(tài)吸附方法，檢測IgG和BSA在pH＝5、6、7、7.45、8和9的條件下的吸附量，結(jié)果如圖4所示。配基對IgG的選擇性隨著pH升高而升高，考慮高pH條件會降低蛋白活性，優(yōu)選pH＝7.45，此時蛋白選擇性IgG/BSA＝9.6。

實施例6

溶液鹽濃度對蛋白選擇性的影響

根據(jù)實施例1所述的步驟，使用NH₂PEG 2000在二氧化硅包裹的磁納米粒子表面固定抗體蛋白特異性吸附配基。根據(jù)實施例2所述蛋白靜態(tài)吸附方法，固定溶液pH＝7.45，檢測溶液NaCl濃度分別為0M、0.15M、0.3M和0.6M條件下，IgG和BSA的吸附量，結(jié)果如圖5所示。隨著NaCl濃度的增高，IgG和BSA的吸附量均降低，但蛋白選擇性IgG/BSA升高，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到0.15M時，蛋白選擇性IgG/BSA＝32.5。該結(jié)果表明NaCl的存在能有效提高蛋白的選擇性，考慮到高NaCl濃度會降低IgG吸附量，優(yōu)選0.15M NaCl(即生理條件)。

實施例7

二氧化硅包裹的四氧化三鐵磁性納米粒子為基底、以NH₂PEG2000為配基的層析介質(zhì)在選擇性吸附混合蛋白溶液中IgG實例

根據(jù)實施例1所述的步驟，使用NH₂PEG 2000在二氧化硅包裹的磁納米粒子表面固定抗體蛋白特異性吸附配基。取1mg磁性納米粒子分別加入含有0.02、0.2、2mg/mL BSA的IgG溶液(0.2mg/mL)和BSA溶液(0.2mg/mL)，靜態(tài)吸附15分鐘，吸附介質(zhì)經(jīng)PBS洗滌三次后，采用凝膠電泳分析磁性納米粒子上結(jié)合的蛋白，結(jié)果如圖6所示。加入BSA溶液的磁性納米粒子(條帶h)未觀察到蛋白條帶，表明該配基能有效抗白蛋白吸附。加入IgG溶液(含BSA)的納米粒子(條帶d、e、f、g)僅能觀察到IgG蛋白條帶，表明該配基在混合蛋白溶液中能高選擇性吸附IgG。

實施例8

二氧化硅包裹的四氧化三鐵磁性納米粒子為基底、以NH₂PEG2000為配基的層析介質(zhì)在選擇性吸附血清溶液中IgG實例

根據(jù)實施例1所述的步驟，使用NH₂PEG 2000在二氧化硅包裹的磁納米粒子表面固定抗體蛋白特異性吸附配基。取1mg磁性納米粒子分別加入含有0、10％血清的IgG溶液(0.2mg/mL)，靜態(tài)吸附15分鐘，吸附介質(zhì)經(jīng)PBS洗滌三次后，采用凝膠電泳分析磁性納米粒子上結(jié)合的蛋白，結(jié)果如圖7所示。加入含血清的IgG溶液的納米粒子(條帶d)僅能觀察到IgG蛋白條帶，表明該配基在血清溶液中能高選擇性吸附IgG。