本發(fā)明屬于先進(jìn)納米材料與納米技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的合成方法及其應(yīng)用，尤其涉及一種用于磷酸化肽富集以及糖肽富集與MALDI-TOF MS以及LC-MS/MS檢測(cè)的磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的合成方法及其雙向應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)的糖基化以及磷酸化是生命過(guò)程中兩種重要且普遍的翻譯后修飾，它們與細(xì)胞間信號(hào)傳遞、細(xì)胞分裂、增殖、分化和相互作用等許多重要的復(fù)雜生物過(guò)程息息相關(guān)。一些研究表明，糖肽或磷酸化肽的表達(dá)水平異常，可作為很多疾病的生物標(biāo)志，尤其是癌癥等人類(lèi)重大疾病。所以對(duì)糖肽以及磷酸化肽的研究對(duì)疾病的早期診斷有著重要的意義。然而糖肽和磷酸化肽的豐度往往非常低，并且它們的質(zhì)譜響應(yīng)會(huì)受到高豐度非磷酸化肽/糖肽和蛋白質(zhì)的壓制，樣品中的鹽分和表面活性劑同樣也會(huì)對(duì)其質(zhì)譜行為產(chǎn)生干擾，使得其電離效率非常低，質(zhì)譜檢測(cè)相對(duì)較為困難。因此在使用質(zhì)譜方法分析復(fù)雜生物樣品中的糖肽和磷酸化肽段之前，對(duì)樣品中的肽段進(jìn)行選擇性富集是十分必要的。

自19世紀(jì)80年代以來(lái)，一系列新的軟電離技術(shù)如快原子轟擊電離、基質(zhì)輔助激光解吸電離、電噴霧電離等發(fā)現(xiàn)后，生物質(zhì)譜技術(shù)迅速發(fā)展。由于質(zhì)譜技術(shù)（Mass Spectrometry，MS）具有高準(zhǔn)確性、高靈敏度和自動(dòng)化操作的特點(diǎn)，并且它能夠準(zhǔn)確測(cè)量肽段和蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量和氨基酸序列等，快速、精確地獲得多種蛋白質(zhì)屬性參數(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)工具，可迅速進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定，從而為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析提供可靠依據(jù)。因此質(zhì)譜技術(shù)無(wú)可爭(zhēng)議地成為當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可或缺的平臺(tái)，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的信息質(zhì)量直接決定了蛋白質(zhì)鑒定的可靠性和鑒定數(shù)量。

隨著近年來(lái)研究的不斷深入，許多方法都被用來(lái)選擇性分離富集糖基化蛋白和多肽，比如硼酸親和色譜、肼化學(xué)、親水相互作用色譜（HILIC）、色譜分析法、體積排阻法等。其中HILIC方法應(yīng)用最為廣泛，效果也較其他方法更好，HILIC方法中，例如金屬有機(jī)骨架材料、納米材料等等，都在糖肽富集方面引起了廣泛的重視。

此外，許多方法也都被用來(lái)選擇性分離富集磷酸化蛋白和多肽，比如免疫沉淀法、固相萃取法、超濾法、強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜法、固定金屬離子親和層析法（IMAC）、金屬氧化物親和層析法（MOAC）等等。其中IMAC方法應(yīng)用廣泛，效果也較好。通過(guò)金屬離子與磷酸化多肽上的磷酸基團(tuán)間發(fā)生配位相互作用，從而起到富集磷酸化多肽的效果，MOF作為IMAC的一種，受到了廣泛的重視。

因此，本發(fā)明將HILIC與IMAC技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計(jì)了一種磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料，通過(guò)鋯離子與磷酸化肽的緊密結(jié)合，以及親水相互作用與糖肽的緊密結(jié)合，達(dá)到一種材料雙向應(yīng)用的效果。這種材料由于具有磁性，操作簡(jiǎn)便、易于制得、且具備MOF的一管優(yōu)異性能，在糖肽以及磷酸化肽富集方面有著很好的應(yīng)用前景。

金屬-有機(jī)骨架材料是指由有機(jī)官能團(tuán)為支架、金屬離子或金屬簇為中心節(jié)點(diǎn)，通過(guò)自組裝形成的具有規(guī)則納米孔道的三維周期性的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)多孔材料。具有非常大的比表面積、穩(wěn)定的納米級(jí)孔道、可調(diào)控的孔道結(jié)構(gòu)、良好的熱穩(wěn)定性等優(yōu)異性能，且不飽和的配位金屬可能與含有羧基、氨基等官能團(tuán)的被分析物質(zhì)發(fā)生配位作用，MOFs材料已成為有機(jī)化學(xué)、無(wú)機(jī)化學(xué)、物理化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。MOFs如今在氣體分離、苯及其同系物的選擇性吸附、藥物研發(fā)等發(fā)揮了其不小的作用。近年來(lái)，MOFs材料已初步應(yīng)用于蛋白質(zhì)/肽的分離富集，并顯示MOFs材料在蛋白質(zhì)組研究中，如低豐度肽富集等有很好的潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的合成方法，尤其提出一種磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的合成方法及其在糖肽以及磷酸化肽富集與MALDI-TOF MS以及LC-MS/MS檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明提出一種金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的合成方法，具體步驟如下：

（1）將FeCl₃?6H₂O溶于乙二醇中，磁力攪拌至澄清，加醋酸鈉充分?jǐn)嚢?，超聲后，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在200℃條件下反應(yīng)16小時(shí)后，冷卻，用去離子水及乙醇充分洗滌所生成的四氧化三鐵磁球，在50℃下真空干燥；

（2）將步驟（1）所得的四氧化三鐵磁球分散于三羥甲基氨基甲烷（Tris）緩沖液中，超聲15分鐘左右，加入多巴胺鹽酸鹽，在室溫下機(jī)械攪拌反應(yīng)6-20小時(shí)，制得聚多巴胺包覆的磁球，用磁鐵分離產(chǎn)物后，用去離子水和無(wú)水乙醇充分洗滌，在50℃下真空干燥，得到聚多巴胺包覆的磁球；

（3）在二甲基甲酰胺中分散步驟（2）所得產(chǎn)物聚多巴胺包覆的磁球，超聲數(shù)分鐘，充分分散后加入氯化鋯，攪拌均勻，在反應(yīng)溫度100-140℃下，反應(yīng)15-45分鐘；

（4）在步驟（3）所得產(chǎn)物中加入配體2-氨基對(duì)苯二甲酸，在120℃下繼續(xù)加熱約15分鐘；

（5）步驟（4）所得產(chǎn)物用磁鐵分離后，用二甲基甲酰胺、蒸餾水和無(wú)水乙醇充分洗滌，在50℃下真空干燥，即得所需的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料。

本發(fā)明中，步驟（1）中FeCl₃?6H₂O和乙二醇的配比范圍為（0.9-1.8）g：（50-100）mL。

本發(fā)明中，步驟（1）中FeCl₃?6H₂O和乙二醇的配比為1.35g：75mL。

本發(fā)明中，步驟（2）中Tris緩沖液的溶劑為去離子水和乙醇，體積比為1：1，pH值為8.5。

本發(fā)明中，步驟（2）中四氧化三鐵磁球和多巴胺鹽酸鹽的質(zhì)量比為2.4：1。

本發(fā)明中，步驟（3）中聚多巴胺包覆的磁球和氯化鋯的質(zhì)量比為（75-125）：（120-200）。

本發(fā)明中，步驟（3）中聚多巴胺包覆的磁球和氯化鋯的質(zhì)量比為5：8，反應(yīng)溫度為120℃，反應(yīng)時(shí)間為30分鐘。

本發(fā)明中，步驟（2）中所得產(chǎn)物聚多巴胺包覆的磁球和步驟（4）中的2-氨基對(duì)苯二甲酸的質(zhì)量比范圍為（75-125）：（90-150），反應(yīng)溫度為100-140℃，反應(yīng)時(shí)間為10-20分鐘。

本發(fā)明中，步驟（2）中所得產(chǎn)物聚多巴胺包覆的磁球和步驟（4）中的2-氨基對(duì)苯二甲酸的質(zhì)量比為5：6，反應(yīng)溫度為120℃，反應(yīng)時(shí)間為15分鐘。

本發(fā)明還提出一種所述合成方法得到的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料在糖肽富集與質(zhì)譜鑒定中的應(yīng)用，具體為：將金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料以超純水為溶劑配置成為10 mg/mL的材料分散液，將該材料分散液與目標(biāo)糖肽溶液加入90%乙腈/1%三氟乙酸緩沖液中，混合并在酶解儀中孵育；通過(guò)離心分離出納米復(fù)合材料，用90%乙腈/1%三氟乙酸以及80%乙腈/1%磷酸緩沖液洗滌材料，隨后用30%乙腈/0.1%甲酸洗脫；取1μL洗脫液直接在MALDI-TOF MS進(jìn)樣靶板上點(diǎn)靶，干燥后再點(diǎn)加1μL濃度為30mg/mL的2，5-二羥基苯甲酸（DHB）溶液于該液滴上，形成基質(zhì)結(jié)晶，進(jìn)行質(zhì)譜分析。

本發(fā)明還提出一種所述合成方法得到的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料在內(nèi)源性磷酸化肽富集與質(zhì)譜鑒定中的應(yīng)用，具體為：將金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料配置成為10 mg/mL的材料分散液（溶劑為超純水），將該材料分散液與目標(biāo)磷酸化肽段溶液加入50%乙腈/0.1%三氟乙酸緩沖液中，混合并在酶解儀中孵育；通過(guò)離心分離出納米復(fù)合材料，用50%乙腈/0.1%三氟乙酸緩沖液洗滌材料，隨后用0.4M氨水洗脫；取1μL洗脫液直接在MALDI-TOF MS進(jìn)樣靶板上點(diǎn)靶，干燥后再點(diǎn)加1μL濃度為20mg/mL的2，5-二羥基苯甲酸（DHB）溶液于該液滴上，形成基質(zhì)結(jié)晶，進(jìn)行質(zhì)譜分析。

本發(fā)明的有益效果在于：首次合成了結(jié)合傳統(tǒng)IMAC材料和HILIC（MOF）材料優(yōu)點(diǎn)的納米復(fù)合材料，并成功應(yīng)用于糖肽和磷酸化肽的分離富集。本發(fā)明提出的合成方法合成的磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料，合成方法簡(jiǎn)單快速，鋯離子對(duì)磷酸化肽具有高靈敏度和高選擇性，氨基和糖肽可通過(guò)親水相互作用緊密結(jié)合，MOF提高了有效表面以及較好的體孔道結(jié)構(gòu)。此納米復(fù)合材料可用于選擇性地富集生物樣品中的低豐度的糖肽和磷酸化肽，并用于MALDI-TOF MS以及LC-MS/MS檢測(cè)。由于MOF較高的表面積以及鋯離子與磷酸基團(tuán)間的親和作用和氨基與糖肽間的親水相互作用，使得該納米復(fù)合材料可以對(duì)復(fù)雜生物樣品中的糖肽和磷酸化肽進(jìn)行選擇性富集，大大提高了其質(zhì)譜信號(hào)，本發(fā)明所提供的材料對(duì)磷酸化肽檢測(cè)限達(dá)20 amol/μL，糖肽檢測(cè)限達(dá)200 amol/μL，對(duì)非磷酸化肽段的選擇性達(dá)1：500（質(zhì)量比），對(duì)非糖肽的選擇性達(dá)1：100（質(zhì)量比），可直接從人體血清中檢測(cè)到4條內(nèi)源性磷酸化肽，以及307條氮端糖肽對(duì)應(yīng)于121種不同的糖蛋白。被富集肽段信噪比放大倍數(shù)高，具有較好的選擇性和高靈敏度，對(duì)復(fù)雜生物樣品中的糖肽和磷酸化肽的檢測(cè)有很好的。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1制得的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的掃描電子顯微鏡照片以及透射電子顯微鏡照片；其中：SEM: ａ)為Fe₃O₄@PDA，ｂ)為Fe₃O₄@PDA@UiO-66-NH₂，TEM: ｃ)為Fe₃O₄@PDA@UiO-66-NH₂，ｄ)為Fe₃O₄@PDA@UiO-66-NH₂（放大圖）；

圖2為實(shí)施例1制得的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的能量色散X射線光譜及元素含量分布圖；

圖3為實(shí)施例1制得的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的氮吸附曲線；附圖：孔徑分布曲線；

圖4為實(shí)施例1制得的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的磁滯回曲線；

圖5為實(shí)施例1制得的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的親水性測(cè)試圖，其中（a)為5分鐘后，（b)為10分鐘后，（c)為30分鐘后，（d)為磁性分離3秒鐘后；

圖6為實(shí)施例1制得的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的紅外表征譜圖；

圖7為實(shí)施例1制得的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的拉曼表征譜圖；

圖8為實(shí)施例1制得的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的X射線衍射圖；

圖9為實(shí)施例1制得的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的Zeta電勢(shì)圖；其中：ａ) Fe₃O₄，ｂ) Fe₃O₄@PDA，ｃ) Fe₃O₄@PDA@UiO-66-NH₂；

圖10為實(shí)施例2中經(jīng)金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集前后的質(zhì)譜圖，其中；a)是250 fmol/μL 的HRP酶解液富集前原液的質(zhì)譜圖；b) 是250 fmol/μL 的HRP酶解液經(jīng)金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后洗脫液的質(zhì)譜圖；c)1 pmol/μL 的IgG酶解液富集前原液的質(zhì)譜圖；d)是1 pmol/μL 的IgG酶解液經(jīng)金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后洗脫液的質(zhì)譜圖；e)是200 fmol/μL 的β-Casein酶解液富集前原液的質(zhì)譜圖；f)是200 fmol/μL 的β-Casein酶解液經(jīng)金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后洗脫液的質(zhì)譜圖；

圖11為實(shí)施例2中250 fmol/μL 的HRP酶解液經(jīng)過(guò)金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料質(zhì)譜圖，a)新鮮制得材料所得富集后洗脫液的質(zhì)譜圖，b)材料循環(huán)使用5次后所得富集后洗脫液的質(zhì)譜圖；200 fmol/μL 的β-Casein酶解液經(jīng)過(guò)金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料，c)新鮮制得材料所得富集后洗脫液的質(zhì)譜圖，d)材料循環(huán)使用5次后所得富集后洗脫液的質(zhì)譜圖；

圖12為實(shí)施例2中250 fmol/μL 的HRP酶解液經(jīng)過(guò)金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料質(zhì)譜圖，a)新鮮制得材料所得富集后洗脫液的質(zhì)譜圖，b)材料在-20℃保存1個(gè)月后所得富集后洗脫液的質(zhì)譜圖；200 fmol/μL 的β-Casein酶解液經(jīng)過(guò)金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料，c)新鮮制得材料所得富集后洗脫液的質(zhì)譜圖，d)材料在-20℃保存1個(gè)月后所得富集后洗脫液的質(zhì)譜圖；

圖13為實(shí)施例2中HRP酶解液經(jīng)過(guò)金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后質(zhì)譜圖，HRP酶解液濃度為：a) 25 fmol/μL； b) 5 fmol/μL； c) 1 fmol/μL；d) 0.2 fmol/μL；β-Casein酶解液經(jīng)過(guò)金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后質(zhì)譜圖，β-Casein酶解液濃度為：e) 25 fmol/μL； f) 1 fmol/μL；

圖14為實(shí)施例3中質(zhì)量比為1:50的HRP和BSA酶解液的混合溶液a)富集前的質(zhì)譜圖；b) 經(jīng)過(guò)金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后質(zhì)譜圖；質(zhì)量比為1:100的HRP和BSA酶解液的混合溶液c)富集前的質(zhì)譜圖；d) 經(jīng)過(guò)金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后質(zhì)譜圖；質(zhì)量比為1:500的β-Casein和BSA酶解液的混合溶液e)富集前的質(zhì)譜圖；f) 經(jīng)過(guò)金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后質(zhì)譜圖；

圖15為實(shí)施例4中未經(jīng)過(guò)酶解處理的健康人血清質(zhì)譜圖，a)原液質(zhì)譜圖，b)經(jīng)過(guò)金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后上清液質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施實(shí)例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：一種磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的合成。

（1）用乙二醇作為溶劑合成四氧化三鐵磁球，將1.35g FeCl₃?6H₂O溶于75mL乙二醇，磁力攪拌（手套封口）至澄清，后加3.6g壓碎醋酸鈉攪拌至溶解并繼續(xù)攪拌0.5h（手套封口）。超聲5min后，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜，200℃，16h。取出反應(yīng)釜，冷卻過(guò)夜。倒出磁球，水洗5次（每次超聲5min）。用去離子水及乙醇充分洗滌磁球，到洗滌液清澈純凈，在50℃下真空干燥；

（2）配置三羥甲基氨基甲烷（Tris）緩沖液（溶劑為去離子水和乙醇，體積比1:1，pH=8.5），將步驟（1）所得的四氧化三鐵磁球120 mg分散于80mLTris緩沖液（內(nèi)含0.05g Tris、40mL水、40mL乙醇）中，超聲15分鐘左右，加入0.32g多巴胺鹽酸鹽，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)16h。磁鐵分離產(chǎn)物，用去離子水和無(wú)水乙醇充分洗滌，在50℃下真空干燥；

（3）在75 mL二甲基甲酰胺中分散步驟（2）所得產(chǎn)物100 mg，超聲一段時(shí)間，充分分散；加入氯化鋯160mg，攪拌均勻，120℃加熱攪拌30分鐘；

（4）在步驟（3）所得體系中加入配體2-氨基對(duì)苯二甲酸120mg，攪拌均勻，120℃加熱攪拌15分鐘，磁鐵分離產(chǎn)物，用二甲基甲酰胺、去離子水和無(wú)水乙醇充分洗滌，在50℃下真空干燥。

圖1為實(shí)施例1的掃描電子顯微鏡照片及透射電子顯微鏡照片。掃描電子顯微鏡圖可以看出在磁球外包覆了一層較薄的聚合物層，在修飾MOF后，表面的結(jié)晶形貌與聚合物的光滑層不同；透射電子顯微鏡圖可以看出聚合物@MOF層約為70納米厚；掃描電鏡型號(hào)為Philips XL30，將純化后的磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料均勻涂抹在導(dǎo)電膠上，噴金后進(jìn)行SEM表征；透射電鏡型號(hào)為JEM-2100F(J0EL)，將純化后的磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的乙醇分散液滴在覆有碳膜的銅網(wǎng)上，干燥后進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察并拍照；

圖2為實(shí)施例1的元素分析，其中Zr元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占8.0%，與預(yù)期一致，表如下；

圖3為實(shí)施例1的氮吸附曲線及孔徑分布曲線，由圖中可以看出，該納米復(fù)合材料具有較大的比表面積，且孔的大小為3.11納米左右；

圖4為實(shí)施例1的磁滯回線，雖然包覆了聚合物及MOF層之后，材料的磁響應(yīng)有所下降，但仍保持著較高的磁響應(yīng)強(qiáng)度，約為45.6emu·g^-1；

圖5為實(shí)施例1的親水性測(cè)試圖，將材料分散在水溶液中形成穩(wěn)定均一的水溶液，并在5分鐘、10分鐘、30分鐘后仍保持分散均一；而用磁鐵吸引后，則立刻變成澄清溶液與材料分離；

圖6為實(shí)施例1的紅外表征譜圖，該納米材料出現(xiàn)了較多的特征峰，如3400cm^-1處的羧基特征峰、1500-1600cm^-1處的苯環(huán)特征峰、560cm^-1處的Fe-O-Fe振動(dòng)峰；

圖7為實(shí)施例1的拉曼表征譜圖，<500cm^-1處出現(xiàn)磁球的特征峰、1500-1600cm^-1處在包覆多巴胺層后出現(xiàn)苯環(huán)特征峰，說(shuō)明材料的成功合成；

圖8為實(shí)施例1的X射線衍射圖樣，2θ= 5.2, 7.0, 12.3, 18.2，22.3°是來(lái)自于MOF，而2θ= 30.3, 35.4, 43.2, 57.2，63.0°是來(lái)自于磁球內(nèi)核，這也就說(shuō)明磁性MOF材料的成功合成；X射線衍射儀型號(hào)為Bruker D4 X-ray diffractometer；

圖9為實(shí)施例1的Zeta電勢(shì)圖，Zeta電勢(shì)經(jīng)過(guò)一層層包覆后先降后升是由于磁球表面被帶負(fù)電的鄰二酚羥基所占據(jù)導(dǎo)致電勢(shì)的下降，而之后MOF層的進(jìn)一步修飾使表面帶正電導(dǎo)致電勢(shì)的上升，進(jìn)一步說(shuō)明材料表面的成功修飾。

實(shí)施例2：將實(shí)施例1得到的磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料作為固相微萃取吸附分離介質(zhì)用于低濃度HRP酶解液以及β-Casein酶解液的富集與MALDI-TOF MS檢測(cè)。

（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取2 mg HRP標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用25 mM碳酸氫銨溶液配成濃度為 2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，pH大約為8.3，煮沸十分鐘。按照質(zhì)量比為1:50的胰蛋白酶與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育16小時(shí)，可得到2 mg/mL的HRP胰蛋白酶解液；準(zhǔn)確稱(chēng)取4 mg IgG標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用25 mM碳酸氫銨溶液配成濃度為 4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，pH大約為8.3，煮沸十分鐘。按照質(zhì)量比為1:50的胰蛋白酶與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育16小時(shí)，可得到4 mg/mL的IgG胰蛋白酶解液；準(zhǔn)確稱(chēng)取2.5 mg β-Casein標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用25 mM碳酸氫銨溶液配成濃度為 2.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，pH大約為8.3，煮沸十分鐘。按照質(zhì)量比為1:50的胰蛋白酶與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育16小時(shí)，可得到2.5 mg/mL的β-Casein胰蛋白酶解液。

（2）樣品的富集：

糖肽富集：用超純水配制10 mg/mL磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的溶液。取20 μL的材料溶液于0.6 mL的離心管，用體積分?jǐn)?shù)為90%乙腈和1%TFA的緩沖溶液洗滌2次后去除上清，加入用緩沖溶液稀釋后不同濃度的HRP酶解液（總體積為100μL），混勻，在37°C下震蕩富集30分鐘；離心分離材料，吸去上清液，用90%乙腈1%TFA溶液洗滌材料一遍，再用80%乙腈/1%磷酸溶液洗滌材料兩遍，然后加入10 μL的30%乙腈/0.1%甲酸溶液，37℃震蕩洗脫20分鐘，離心分離材料,吸出洗脫液備后用。

磷酸化肽富集：用超純水配制10 mg/mL磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的溶液。取20 μL的材料溶液于0.6 mL的離心管，用體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈和0.1%TFA的緩沖溶液洗滌2次后去除上清，加入用緩沖溶液稀釋后不同濃度的β-Casein酶解液（總體積為100μL），混勻，在37°C下震蕩富集30分鐘；離心分離材料，吸去上清液，用50%乙腈0.1%TFA溶液洗滌材料三遍，然后加入10 μL的0.4 mol/L的氨水，37℃震蕩洗脫20分鐘，離心分離材料,吸出洗脫液備后用。

（3）點(diǎn)靶：取1 μL步驟（2）所述的洗脫液點(diǎn)到MALDI-TOF MS進(jìn)樣靶板上，干燥后再點(diǎn)加1 μL濃度為30 mg/mL（糖肽）或20 mg/mL（磷酸化肽）的2,5-二羥基苯甲酸（DHB）溶液于該液滴上，形成基質(zhì)結(jié)晶，干燥后再進(jìn)行質(zhì)譜分析。

（4）質(zhì)譜分析以磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料作為固相微萃取吸附分離介質(zhì)富集得到的糖肽和磷酸化肽并與富集前的原液質(zhì)譜圖作對(duì)比。

濃度為250 fmol/ μL的HRP酶解液經(jīng)過(guò)磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后，質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了十九條歸屬于HRP的糖肽峰（m/z=1843.0, m/z=2541.4, m/z=2591.4, m/z=2611.4, m/z=3074.5, m/z=3087.7, m/z=3222.9, m/z=3321.8, m/z=3353.7, m/z=3369.7, m/z=3605.0, m/z=3672.1, m/z=3894.1, m/z=4056.2, m/z=4222.4, m/z=4719.6, m/z=4821.7, m/z=4838.7, m/z=4984.7）。

濃度為1 pmol/ μL的IgG酶解液經(jīng)過(guò)磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后，質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了二十一條歸屬于IgG的糖肽峰（m/z=2399.3，m/z=2431.3，m/z=2457.3，m/z=2488.3，m/z=2561.4，m/z=2602.4，m/z=2618.4，m/z=2634.4，m/z=2650.4，m/z=2764.5，m/z=2781.5，m/z=2796.5，m/z=2805.5，m/z=2837.5，m/z=2853.5，m/z=2926.6，m/z=2958.6，m/z=2967.6，m/z=3000.0，m/z=3130.0，m/z=3161.7）

濃度為200 fmol/ μL的β-Casein酶解液經(jīng)過(guò)磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后，質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了六條歸屬于β-Casein的磷酸化肽段的峰（m/z=1031.4，m/z=1279.1，m/z=1561.2， m/z=2061.9，m/z=2556.2，m/z=3122.5），四條去磷酸化峰（m/z=1963.9，m/z=2458.0，m/s=2927.3，m/z=3024.2）以及兩條來(lái)源于α-Casein的磷酸化肽段的峰（m/z=1466.7，m/z=1660.9，）。

實(shí)施例3：將實(shí)施例1得到的磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料作為固相微萃取吸附分離介質(zhì)用于HRP酶解液或β-Casein酶解液和牛血清白蛋白（BSA）酶解液的混合溶液的富集與MALDI-TOF MS檢測(cè)。

（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取2 mg 標(biāo)準(zhǔn)蛋白HRP、2.5 mg 標(biāo)準(zhǔn)蛋白β-Casein和5 mg標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA，用25 mM碳酸氫銨溶液配成濃度為2 mg/mL、2.5 mg/mL和5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，pH大約為8.3，煮沸10分鐘。按照質(zhì)量比為1:50的胰蛋白酶與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育16小時(shí)，可得到2 mg/mL的HRP胰蛋白酶解液、2.5 mg/mL的β-Casein酶解液和5 mg/mL的BSA酶解液。

（2）樣品的富集：

糖肽富集：用超純水配制10 mg/mL磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的溶液。取20 μL的材料溶液于0.6 mL的離心管，用體積分?jǐn)?shù)為90%乙腈和1%TFA的緩沖溶液洗滌2次后去除上清，先加入1 μL的2 mg/mL的HRP胰蛋白酶解液，分別按照HRP和BSA的質(zhì)量比為1:50、1:100加入BSA酶解液，隨后加入相應(yīng)體積的體積分?jǐn)?shù)為90%乙腈/1%TFA的水溶液使體系配成總體積為100 μL的體系，混勻，在37°C下震蕩富集30分鐘；離心分離材料，吸去上清液，用90%乙腈1%TFA溶液洗滌材料一遍，再用80%乙腈/1%磷酸溶液洗滌材料兩遍，然后加入10 μL的30%乙腈/0.1%甲酸溶液，37℃震蕩洗脫20分鐘，離心分離材料,吸出洗脫液備后用。

磷酸化肽富集：用超純水配制10 mg/mL磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的溶液。取20 μL的材料溶液于0.6 mL的離心管，用體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈和0.1%TFA的緩沖溶液洗滌2次后去除上清，先加入1 μL的2.5 mg/mL的β-Casein酶解液后，按照β-Casein和BSA的質(zhì)量比為1:1:500加入BSA酶解液，隨后加入相應(yīng)體積的體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈和0.1%TFA的水溶液使體系配成總體積為100 μL的體系，混勻，在37°C下震蕩富集30分鐘；離心分離材料，吸去上清液，用50%乙腈0.1%TFA溶液洗滌材料三遍，然后加入10 μL的0.4 mol/L的氨水，37℃震蕩洗脫20分鐘，離心分離材料,吸出洗脫液備后用。

（3）點(diǎn)靶：取1 μL步驟（2）所述的洗脫液點(diǎn)到MALDI-TOF MS進(jìn)樣靶板上，干燥后再點(diǎn)加1 μL濃度為30 mg/mL（糖肽）或20 mg/mL（磷酸化肽）的2,5-二羥基苯甲酸（DHB）溶液于該液滴上，形成基質(zhì)結(jié)晶，干燥后再進(jìn)行質(zhì)譜分析。

（4）質(zhì)譜分析以磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料作為固相微萃取吸附分離介質(zhì)富集得到的糖肽和磷酸化肽并與富集前的原液質(zhì)譜圖作對(duì)比。

質(zhì)量比為1:50的HRP和BSA的酶解混合液經(jīng)過(guò)磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后，從質(zhì)譜圖中可以清楚地看到十二條來(lái)源于HRP的糖肽峰（m/z=2541.4, m/z=2591.4, m/z=2611.4, m/z=3222.9, m/z=3321.8, m/z=3353.7, m/z=3369.7, m/z=3672.1, m/z=4056.2, m/z=4222.4, m/z=4838.7, m/z=4984.7）

質(zhì)量比為1:500的β-Casein和BSA的酶解液混合液經(jīng)過(guò)磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后，從質(zhì)譜圖中可以清楚地看到五條來(lái)源于β-Casein的磷酸化肽段的峰（m/z=1031.4，m/z=1561.2，m/z=2061.9，m/z=2556.2，m/z=3122.5），四條去磷酸化峰（m/z=1952.0，m/z=2433.2，m/z=2927.6，m/z=3024.6）。

實(shí)施例4：將實(shí)施例1得到的磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料作為固相微萃取吸附分離介質(zhì)用于健康人血清樣品中糖肽和磷酸化肽的富集與MALDI-TOF MS和LC-MS/MS檢測(cè)。

（1）樣品準(zhǔn)備：

糖肽富集準(zhǔn)備：2μL人體血清分散于198μL 25 mM碳酸氫銨溶液，煮沸10分鐘進(jìn)行變形。后在60℃加入10 mM 二硫蘇糖醇（DTT）進(jìn)行30分鐘還原反應(yīng)，后在37℃在暗處加入20 mM 吲哚-3-乙酸（IAA）進(jìn)行1小時(shí)烷基化反應(yīng)。之后按照質(zhì)量比為1:50的胰蛋白酶與蛋白濃度的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育16小時(shí)，凍干待用。

磷酸化肽富集準(zhǔn)備：用體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈和0.1%TFA的水溶液稀釋健康人血清樣品十倍。用體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈和0.1%TFA的水溶液配制10 mg/mL磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的溶液。

（2）樣品的富集：

糖肽富集：用超純水配制10 mg/mL磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的溶液。取40 μL的材料溶液于0.6 mL的離心管，用體積分?jǐn)?shù)為90%乙腈和1%TFA的緩沖溶液洗滌2次后去除上清，加入100μL用90%乙腈和1%TFA的緩沖溶液稀釋的血清酶解凍干液，混勻，在37°C下震蕩富集30分鐘；離心分離材料，吸去上清液，用90%乙腈1%TFA溶液洗滌材料一遍，再用80%乙腈/1%磷酸溶液洗滌材料兩遍，然后加入10 μL的30%乙腈/0.1%甲酸溶液，37℃震蕩洗脫20分鐘，離心分離材料,吸出洗脫液凍干后備用。（LC-MS/MS）

磷酸化肽富集：用超純水配制10 mg/mL磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料的溶液。取20 μL的材料溶液于0.6 mL的離心管，用體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈和0.1%TFA的緩沖溶液洗滌2次后去除上清，在0.6 mL的離心管內(nèi)加入10 μL的稀釋過(guò)的健康人血清，加入190 μL的體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈和0.1%TFA的水溶液，混勻，在37°C下震蕩富集30分鐘；離心分離材料，吸去上清液，用50%乙腈0.1%TFA溶液洗滌材料三遍，然后加入10 μL的0.4 mol/L的氨水，37℃震蕩洗脫20分鐘，離心分離材料，吸出洗脫液備后用。（MALDI-TOF MS）

（3）糖肽質(zhì)譜分析：

LC-MSMS：由步驟（2）所得的凍干液分散在10 μL A相（H2O/0.1%FA）中。該儀器為EASY-nLC 1000 system并連有Orbitrap Fusion mass spectrometer。4 μL分散液根據(jù)線性梯度在110分鐘內(nèi)從2% B相（乙腈/0.1%FA）到40% B相進(jìn)樣入分析柱（C18, 75 μm x 50 cm）。色譜柱在最初狀態(tài)回穩(wěn)10分鐘，柱流速為200 nL/min。激光電壓為 2.0 kV。Orbitrap質(zhì)譜軟件在MS和MS/MS模式間自動(dòng)切換?？蛇_(dá)到m/z=200的分辨率。由質(zhì)譜得到的數(shù)據(jù)基于2015年3月11日發(fā)布的Uniprot-SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜庫(kù)，碎片離子質(zhì)量數(shù)容忍偏差度為0.050 Da，錯(cuò)誤率（FDR）小于1%。

健康人血清經(jīng)過(guò)磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后，可辨識(shí)到307條氮端糖肽對(duì)應(yīng)于121種不同的糖蛋白。

（4）磷酸化肽質(zhì)譜分析：

點(diǎn)靶：取1 μL步驟（2）所述的洗脫液點(diǎn)到MALDI-TOF MS進(jìn)樣靶板上，干燥后再點(diǎn)加1 μL濃度為20 mg/mL的2，5-二羥基苯甲酸（DHB）溶液于該液滴上，形成基質(zhì)結(jié)晶，干燥后再進(jìn)行質(zhì)譜分析。

MALDI-TOF MS：質(zhì)譜分析以磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料作為固相微萃取吸附分離介質(zhì)富集得到的磷酸化肽并與富集前的原液和富集后的上清液的質(zhì)譜圖作對(duì)比。

健康人血清富集前，由于受到嚴(yán)重的煩擾，無(wú)法看到內(nèi)源性磷酸化肽的質(zhì)譜峰，而經(jīng)過(guò)磁球表面包覆聚多巴胺和氨基修飾的以鋯為中心金屬離子的金屬有機(jī)骨架（MOF）納米復(fù)合材料富集后，質(zhì)譜圖中可以看到四條健康人血清中的內(nèi)源性磷酸化肽的峰（m/z=1389.4，m/z=1460.5，m/z=1545.5，m/z=1616.5）。