本發(fā)明涉及一種發(fā)酵食品分析的前處理方法，具體為一種氨基甲酸乙酯高效固相萃取柱的制備和使用方法。

背景技術(shù)：

氨基甲酸乙酯( EC) 又稱為尿烷，是一種2A 類(lèi)致癌性化學(xué)污染物，普遍存在于發(fā)酵食品和飲料酒中，屬于發(fā)酵和儲(chǔ)存過(guò)程中無(wú)法避免產(chǎn)生的副產(chǎn)物，因此需要對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)管。食品中的EC一般采用光度法、氣相\氣質(zhì)、液相\液質(zhì)進(jìn)行分析，但EC的含量一般很低（ppm級(jí)），且樣品背景復(fù)雜，不能直接進(jìn)樣或達(dá)不到較好的分析效果，常常需要對(duì)樣品進(jìn)行富集和純化處理。對(duì)EC的前處理主要是采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、液液萃取和固相萃取，而固相萃?。⊿olid-Phase Extraction，簡(jiǎn)稱SPE）是近年發(fā)展起來(lái)一種新型樣品預(yù)處理技術(shù)，由液固萃取和柱液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來(lái)，主要用于樣品的分離、純化和濃縮，與傳統(tǒng)的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和液液萃取法相比較可以提高分析物的回收率，更有效的將分析物與干擾組分分離，減少樣品預(yù)處理過(guò)程，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、省力、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，而固相萃取中的填料是得到良好萃取效果的關(guān)鍵。目前，對(duì)EC的萃取柱主要有C18柱、氨基固相柱、N-丙基乙二胺( PSA)柱等等，但往往都有收率和重現(xiàn)性不高，以及凈化效果不理想等問(wèn)題。分子印跡聚合物（MIP）是通過(guò)分子印跡技術(shù)合成的對(duì)特定目標(biāo)分子（模板分子）及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物具有特異性識(shí)別和選擇性吸附的聚合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明正是針對(duì)以上技術(shù)問(wèn)題，提供一種氨基甲酸乙酯高效固相萃取柱的制備方法。該方法以EC為模板分子，采用本體聚合法合成了EC-MIP，以EC-MIP為萃取柱的填料，用于發(fā)酵食品中EC分析的樣品前處理，解決以往在對(duì)EC固相萃取時(shí)，凈化效果不好、收率低和穩(wěn)定性差的問(wèn)題。

本發(fā)明的另外一個(gè)發(fā)明目的是提供以上所述氨基甲酸乙酯高效固相萃取柱的使用方法。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

一種氨基甲酸乙酯高效固相萃取柱的制備方法，該方法包括EC分子印跡聚合物的制備方法，萃取柱的制備以及吸附后的洗脫方法。

1）EC分子印跡聚合物的制備方法

稱取少量EC和丙烯酰胺作為模板分子和功能單體，溶于致孔劑氯仿中，置于振蕩器中振蕩約半個(gè)小時(shí)，使模板分子與功能單體充分作用；然后加入一定量的交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯和引發(fā)劑偶氮二異丁腈，充分混溶后超聲1刻鐘，然后通氮?dú)饧s15min；將密封好的錐形瓶放入58~60℃恒溫水浴鍋中聚合一天，得到分子印跡聚合物；

將獲得的聚合物采用研缽磨碎，經(jīng)100~120目篩子篩分；用濾紙包裹聚合物置于索氏提取器中，甲醇/冰乙酸溶液作為萃取溶劑，調(diào)節(jié)加熱套至55-65℃，保持萃取器中每30min產(chǎn)生一次虹吸現(xiàn)象，連續(xù)萃取至聚合物中無(wú)模板分子，再用甲醇洗至中性，放入真空干燥箱中控制溫度60℃干燥，即得到所需聚合物EC-MIPs；

2）萃取柱的制備方法

在一只小針筒注射器或類(lèi)似容器中底部平鋪一層玻璃棉，稱取一定量的MC-MIPs于小柱中，輕輕敲打使其緊實(shí)，然后在聚合物上方平鋪1層玻璃棉，即得 EC印跡分子萃取柱MISPE。

氨基甲酸乙酯高效固相萃取柱吸附后的洗脫方法，包括以下步驟：

MISPE柱裝好后，依次用甲醇，乙腈通過(guò)小柱，去除MIPs中存在的雜質(zhì)，并使其溶劑化，2~4mL/min作為上樣流速，甲醇/水/冰乙酸按V/V/V =8:1:1作為洗脫液，洗脫液體積為6.0~20mL，收集洗脫液即實(shí)現(xiàn)對(duì)EC富集和純化。

所述EC分子印跡聚合物的制備方法具體包括以下步驟：

準(zhǔn)確稱取0.0751gEC（模板分子，1mmoL）、0.2843g丙烯酰胺（功能單體，4.0mmoL）溶于10mL氯仿（致孔劑）中，置于振蕩器中振蕩30min，使模板分子與功能單體充分作用。然后加入乙二醇二甲基丙烯酸酯3.9643g（交聯(lián)劑，20mmoL）、40.0mg偶氮二異丁腈（引發(fā)劑），充分混溶后超聲15min，然后通氮?dú)?5min。將密封好的錐形瓶放入58℃恒溫水浴鍋中聚合24h，得到分子印跡聚合物。將獲得的聚合物采用研缽磨碎，經(jīng)120目篩子篩分。用濾紙包裹聚合物置于索氏提取器中，以9：1（V：V）甲醇/冰乙酸溶液作為萃取溶劑，調(diào)節(jié)加熱套適宜溫度，保持萃取器中每30min產(chǎn)生一次虹吸現(xiàn)象，連續(xù)萃取48h，并在過(guò)程中更換3次萃取液，確保洗至無(wú)模板分子，再用甲醇洗至中性，放入真空干燥箱中控制溫度60℃干燥15h，即得到所需聚合物（EC-MIPs）。

所述萃取柱的制備方法，在一只2mL針筒注射器或類(lèi)似容器中底部平鋪一層玻璃棉，準(zhǔn)確稱取100.0mgMC-MIPs于小柱中，輕輕敲打使其緊實(shí)，然后在聚合物上方平鋪1層玻璃棉，即得 EC印跡分子萃取柱（MISPE）。

所述吸附后的洗脫方法為：MISPE柱裝好后，依次用5mL甲醇，5mL乙腈通過(guò)小柱，去除MIPs中可能存在的雜質(zhì)，并使其溶劑化，2mL/min作為上樣流速，以甲醇/水/冰乙酸（8:1:1，V/V/V）作為洗脫液，洗脫液體積為6.0mL，收集洗脫液即實(shí)現(xiàn)對(duì)EC富集和純化的目的。

一種基于EC的固相萃取柱的使用方法，即利用分子印跡聚合物的高選擇性實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中EC的富集和純化處理。EC分子印跡聚合物是利用EC分子為模板分子，通過(guò)添加功能單體、致孔劑、交聯(lián)劑和引發(fā)劑，合成的一種高分子聚合物，將該聚合物中的模板分子采用合適的容積洗脫后，就得到了帶有三維立體空隙的對(duì)EC分子具有特異性識(shí)別和選擇性吸附的聚合物，在對(duì)樣品中EC吸附后，通過(guò)洗脫劑將吸附上的EC洗脫下來(lái)，收集洗脫劑就實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品中EC的富集和純化。

本發(fā)明的積極效果體現(xiàn)在：

（一）、用于發(fā)酵食品中EC分析的樣品前處理，具有凈化效果，收率高的特點(diǎn)。

（二）、在發(fā)酵食品中EC分析方法研究和EC分析標(biāo)準(zhǔn)建立與使用中具有較好的應(yīng)用前景。

（三）、采用EC分子印跡聚合物作為固相萃取柱的填料，解決以往在對(duì)EC固相萃取時(shí)，凈化效果不好、收率低和穩(wěn)定性差的問(wèn)題。

（四）、收率高。通過(guò)與C18和氨基固相柱對(duì)比實(shí)驗(yàn)，收率約高50%。MISPE柱重復(fù)使用6次后， EC回收率仍在85%左右。

（五）、將EC-MIPs分別吸附濃度為300mg/L的其它氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，如異丙威，速滅威，仲丁威。EC-MIPs對(duì)EC、異丙威、速滅威、仲丁威的吸附量分別為13.25mg/g，3.14 mg/g，4.15 mg/g，4.37 mg/g，EC-MIPs對(duì)EC的吸附量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他農(nóng)藥。

附圖說(shuō)明：

圖1為EC-NIPs的掃描電鏡圖

圖2為本發(fā)明中所述EC-MIPs的掃描電鏡圖

圖3為EC-MIPs的空隙構(gòu)象示意圖

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本專(zhuān)利作各種改動(dòng)或修改，但這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

實(shí)施例1：

（1）采用0.0751gEC（模板分子，1mmoL）、0.2843g丙烯酰胺（功能單體，4.0mmoL）溶于10mL氯仿（致孔劑）中，置于振蕩器中振蕩30min，使模板分子與功能單體充分作用。

（2）加入乙二醇二甲基丙烯酸酯3.9643g（交聯(lián)劑，20mmoL）、40.0mg偶氮二異丁腈（引發(fā)劑），充分混溶后超聲15min，然后通氮?dú)?5min。將密封好的錐形瓶放入58℃恒溫水浴鍋中聚合24h，得到分子印跡聚合物。

（3）將聚合物采用研缽磨碎，經(jīng)120目篩子篩分，用濾紙包裹聚合物置于索氏提取器中，9：1（V：V）甲醇/冰乙酸溶液作為萃取溶劑，調(diào)節(jié)加熱套至60℃，保持萃取器中每30min產(chǎn)生一次虹吸現(xiàn)象，連續(xù)萃取48h，并在過(guò)程中更換3次萃取液，確保洗至無(wú)模板分子，再用甲醇洗至中性，放入真空干燥箱中控制溫度60℃干燥15h，即得到所需聚合物（EC-MIPs）。

（4）在一只2mL針筒注射器中底部平鋪一層玻璃棉，準(zhǔn)確稱取100.0mgMC-MIPs于小柱中，輕輕敲打使其緊實(shí)，然后在聚合物上方平鋪1層玻璃棉。

（5）依次用5mL甲醇，5mL乙腈通過(guò)MISPE小柱，去除MIPs中可能存在的雜質(zhì)，并使其溶劑化。2mL/min作為上樣流速，甲醇/水/冰乙酸（8:1:1，V/V/V）作為洗脫液，洗脫液體積為6.0mL。

（6）收集洗脫液即得富集和凈化的EC。

實(shí)施例2：

（1）采用0.751gEC（模板分子，10mmoL）、2.843g丙烯酰胺（功能單體，40mmoL）溶于10mL氯仿（致孔劑）中，置于振蕩器中振蕩30min，使模板分子與功能單體充分作用。

（2）加入乙二醇二甲基丙烯酸酯39.643g（交聯(lián)劑，0.2moL）、0.4g偶氮二異丁腈（引發(fā)劑），充分混溶后超聲15min，然后通氮?dú)?5min。將密封好的錐形瓶放入58℃恒溫水浴鍋中聚合24h，得到分子印跡聚合物。

（3）將聚合物采用研缽磨碎，經(jīng)120目篩子篩分，用濾紙包裹聚合物置于索氏提取器中，9：1（V：V）甲醇/冰乙酸溶液作為萃取溶劑，調(diào)節(jié)加熱套至58℃，保持萃取器中每30min產(chǎn)生一次虹吸現(xiàn)象，連續(xù)萃取48h，并在過(guò)程中更換3次萃取液，確保洗至無(wú)模板分子，再用甲醇洗至中性，放入真空干燥箱中控制溫度60℃干燥15h，即得到所需聚合物（EC-MIPs）。

（4）在一只4mL針筒注射器中底部平鋪一層玻璃棉，準(zhǔn)確稱取200.0mgMC-MIPs于小柱中，輕輕敲打使其緊實(shí)，然后在聚合物上方平鋪1層玻璃棉。

（5）依次用10mL甲醇，10mL乙腈通過(guò)MISPE小柱，去除MIPs中可能存在的雜質(zhì)，并使其溶劑化。2mL/min作為上樣流速，甲醇/水/冰乙酸（8:1:1，V/V/V）作為洗脫液，洗脫液體積為12.0mL。

（6）收集洗脫液即得富集和凈化的EC。

實(shí)施例3：

（1）采用3.755gEC（模板分子，50mmoL）、14.25g丙烯酰胺（功能單體，0.2moL）溶于10mL氯仿（致孔劑）中，置于振蕩器中振蕩30min，使模板分子與功能單體充分作用。

（2）加入乙二醇二甲基丙烯酸酯198.25g（交聯(lián)劑，1moL）、2g偶氮二異丁腈（引發(fā)劑），充分混溶后超聲15min，然后通氮?dú)?5min。將密封好的錐形瓶放入58℃恒溫水浴鍋中聚合24h，得到分子印跡聚合物。

（3）將聚合物采用研缽磨碎，經(jīng)120目篩子篩分，用濾紙包裹聚合物置于索氏提取器中，9：1（V：V）甲醇/冰乙酸溶液作為萃取溶劑，調(diào)節(jié)加熱套至60℃，保持萃取器中每30min產(chǎn)生一次虹吸現(xiàn)象，連續(xù)萃取48h，并在過(guò)程中更換3次萃取液，確保洗至無(wú)模板分子，再用甲醇洗至中性，放入真空干燥箱中控制溫度60℃干燥15h，即得到所需聚合物（EC-MIPs）。

（4）在一只10mL針筒注射器中底部平鋪一層玻璃棉，準(zhǔn)確稱取400.0mgMC-MIPs于小柱中，輕輕敲打使其緊實(shí)，然后在聚合物上方平鋪1層玻璃棉。

（5）依次用20mL甲醇，20mL乙腈通過(guò)MISPE小柱，去除MIPs中可能存在的雜質(zhì)，并使其溶劑化。2mL/min作為上樣流速，甲醇/水/冰乙酸（8:1:1，V/V/V）作為洗脫液，洗脫液體積為24.0mL。

（6）收集洗脫液即得富集和凈化的EC。

本申請(qǐng)并不局限于前述的具體實(shí)施方式。本申請(qǐng)擴(kuò)展到任何在本說(shuō)明書(shū)中披露的新特征或任何新的組合，以及披露的任一新的方法或過(guò)程的步驟或任何新的組合。