本發(fā)明涉及硅膠色譜材料的制備技術(shù)領(lǐng)域，是一種以硅膠為基質(zhì)，以無Cu催化的SPAAC反應(yīng)為模板，首先在硅膠固定相表面修飾含有炔基官能團(tuán)的ADIBO試劑，然后和含有疊氮官能團(tuán)的環(huán)糊精或者環(huán)糊精衍生物反應(yīng)，得到環(huán)糊精修飾的硅膠固定相。

背景技術(shù)：

2001開始，sharpless小組將含有炔基的試劑和含有疊氮官能團(tuán)的試劑在Cu的催化下發(fā)生選擇性好，鍵合效率高的click反應(yīng)[1](H.C.Kolb,M.Finn,K.B.Sharpless,Click chemistry:diverse chemical function from a few good reactions,Angewandte Chemie International Edition 40(2001)2004-2021.)；近10多年以來，click反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于固定相表面修飾化學(xué)中，特別在生物正交反應(yīng)，監(jiān)測(cè)生物體的生命活動(dòng)中發(fā)揮了重要的作用[2](J.M.Baskin,C.R.Bertozzi,Bioorthogonal click chemistry:covalent labeling in living systems,QSAR&Combinatorial Science 26(2007)1211-1219.)。2005年，梁小組首次將click反應(yīng)應(yīng)用在硅膠固定相表面的修飾中，合成了系列的click固定相，在色譜分離中顯示了很好的分離能力[3](Z.Guo,A.Lei,X.Liang,Q.Xu,Click chemistry:a new facile and efficient strategy for preparation of functionalized HPLC packings,Chem.Commun.(2006)4512-4514)。雖然Cu(I)催化的click反應(yīng)效率高，近乎100％的收率，但是Cu催化試劑的引入，造成少量Cu在反應(yīng)體系中殘留，而此負(fù)面效應(yīng)在生物正交反應(yīng)中十分明顯，因?yàn)镃u的存在對(duì)生命體有一定的毒性，并且難于去除；同時(shí)在色譜固定相表面的殘留也會(huì)制約固定相的分離效率；因此急需要發(fā)展快速、簡(jiǎn)便，鍵合效率高，無Cu(I)催化的方法，用于合成色譜固定相。2007年，Bertizz小組發(fā)展了無銅催化的click反應(yīng)(SPAAC)，即在無銅(Cu)條件下，依據(jù)含有炔基官能團(tuán)的八元環(huán)的擴(kuò)環(huán)張力，和疊氮化試劑快速高效選擇性的反應(yīng)，首次發(fā)展了無銅催化的click反應(yīng)[4](J.M.Baskin,C.R.Bertozzi,Bioorthogonal click chemistry:covalent labeling in living systems,QSAR&Combinatorial Science 26(2007)1211-1219.)，此后，SPAAC反應(yīng)被廣泛應(yīng)用，克服了以往使用Cu催化反應(yīng)的特點(diǎn)。

根據(jù)SPAAC的反應(yīng)特點(diǎn)，我們希望在硅膠固定相表面引入含有八元環(huán)炔基結(jié)構(gòu)的ADIBO試劑，并且以此反應(yīng)為模板，鍵合含有疊氮官能團(tuán)的環(huán)糊精試劑，制備了環(huán)糊精硅膠固定相，將其應(yīng)用于手性化合物的分離分析中，為色譜固定相的制備及豐富色譜固定相的類型提供一種參考。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

Click反應(yīng)高效，快速，選擇性好，但是該反應(yīng)需要Cu(I)催化，造成重金屬在固定相表面殘留，影響了click色譜材料的分離性能，而SPAAC反應(yīng)是依據(jù)八元環(huán)的擴(kuò)環(huán)張力，在無Cu催化的條件下，炔基和疊氮官能團(tuán)可以高效立體選擇性的發(fā)生[3+2]反應(yīng)，因此，我們希望在硅膠材料的表面引入含有炔基的八元環(huán)雙官能團(tuán)試劑ADIBO，進(jìn)而和疊氮化的環(huán)糊精試劑反應(yīng)，在硅膠表面鍵合環(huán)糊精固定相。

本發(fā)明提供了一種以SPAAC反應(yīng)為模板制備高效制備環(huán)糊精色譜固定相的方法，主要涉及ADIBO試劑活化硅膠，再與疊氮化的環(huán)糊精試劑發(fā)生[3+2]反應(yīng)，制備無銅催化的新型SPAAC環(huán)糊精色譜固定相，操作步驟如下：

a)硅膠預(yù)處理：硅膠加入濃度為1～36％的鹽酸或硝酸溶液中，加熱回流攪拌

1～48h，過濾，水洗至中性，在100～160℃,干燥6～10h,至恒重；

b)合成ADIBO修飾的硅烷試劑:惰氣保護(hù)，室溫，環(huán)氧基三甲氧基硅烷，氨基丙基三乙氧基硅烷，異氰基丙基三甲氧基硅烷或三乙氧基硅烷中的一種或兩種以上試劑溶于雙官能團(tuán)試劑ADIBO的極性有機(jī)溶液中，電磁攪拌4～6h，得到末端含有八元環(huán)炔基的烷氧基硅烷試劑；

c)合成ADIBO改性硅膠表面的固定相：惰氣保護(hù)，將步驟a處理好的硅膠溶于有機(jī)溶劑中，加入步驟b所得到的ADIBO烷氧基硅烷試劑，加熱回流，反應(yīng)16～48h；反應(yīng)體系冷卻至室溫，減壓過濾，依次用甲苯，四氫呋喃，甲醇，水，甲醇洗滌，在60～100℃,干燥12～24h，得到含有ADIBO試劑的硅膠固定相；

d)合成疊氮基官能團(tuán)化的環(huán)糊精：室溫，無水二氯甲烷為溶劑，向環(huán)糊精試劑中加入對(duì)甲苯磺酰氯試劑，攪拌48h,過濾，水洗，甲醇洗，并用水重結(jié)晶，干燥得到活化的環(huán)糊精；室溫，向活化的環(huán)糊精的DMF溶液中，緩慢加入疊氮化鈉，維持反應(yīng)溫度40～90℃，攪拌24h,停止反應(yīng)，抽濾，水洗滌，水重結(jié)晶，得到疊氮化的環(huán)糊精試劑；

e)合成衍生化的疊氮基環(huán)糊精：室溫，無水二氯甲烷為溶劑，向疊氮官能團(tuán)化的環(huán)糊精試劑中加入和環(huán)糊精羥基反應(yīng)的試劑，可以為異氰基苯試劑，叔丁基溴，碘甲烷，醋酸酐等，維持反應(yīng)溫度40～90℃，攪拌24h,停止反應(yīng)，抽濾，水洗滌，水重結(jié)晶，攪拌48h,過濾，水洗，甲醇洗，并用水重結(jié)晶，得到疊氮化的環(huán)糊精試劑；

f)SPAAC CD固定相的制備：室溫，將1.50g ADIBO修飾的硅膠溶于甲醇水溶液(體積比為1/1～1/10)中，緩慢加入疊氮化的環(huán)糊精試劑或者衍生化的疊氮基環(huán)糊精，攪拌2h,減壓過濾，依次用甲醇，水，甲醇洗滌，固體產(chǎn)品在60～100℃，干燥12～24h，得到環(huán)糊精硅膠固定相；

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下特點(diǎn)：

1.硅膠表面的SPAAC反應(yīng)，不需要重金屬Cu的催化，避免了金屬在材料表面的殘留；

2.硅膠表面SPAAC反應(yīng)的速率快，常規(guī)SPAAC反應(yīng)在5～10min反應(yīng)完畢，在硅膠表面1～10h即可反應(yīng)完全，節(jié)約反應(yīng)時(shí)間；

3.硅膠表面的SPAAC反應(yīng)，選擇性高，表面官能團(tuán)密度高，所得到的固定相性質(zhì)穩(wěn)定；

4.依據(jù)SPAAC反應(yīng)高效快速的特點(diǎn)，在硅膠表面修飾環(huán)糊精，是一種新型的環(huán)糊精固定相。

附圖說明

圖1:CD硅膠固定相及其衍生物的示意圖；

圖2:S-amide-ADIBO CD色譜柱(4.6×150mm)對(duì)果聚糖的分離,分離條件：A流動(dòng)相，乙腈ACN，B流動(dòng)相，水H₂O，0-30min,85％A to 50％A,流速，1mL/min,溫度，25℃.

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述。

取5.0g硅膠，置于50mL玻璃圓底燒瓶中，加入50mL濃度為6M的鹽酸加熱回流1h，水洗至中性，在150℃下干燥5h。

實(shí)施例1

氮?dú)獗Ｗo(hù)，取環(huán)氧基丙基三甲氧基硅烷試劑1.13g，溶于20mL無水處理的四氫呋喃溶液中，電磁攪拌，加入末端含有氨基，兩側(cè)含有苯基的ADIBO試劑431mg，三乙胺調(diào)節(jié)pH值，室溫?cái)嚢?，液相色譜檢測(cè)得到ADIBO修飾的硅烷試劑。氮?dú)獗Ｗo(hù)，將干燥好的硅膠(1.5g),溶于30mL無水甲苯中，加入上述制備得到的ADIBO硅烷試劑，并滴加吡啶(6mmol,480μL)，加熱回流，反應(yīng)24h，停止反應(yīng)，冷卻抽濾，依次用無水甲苯，四氫呋喃，甲醇，水，甲醇洗滌，80℃下干燥固化6h,得到ADIBO試劑活化的硅膠，命名為S-oxy-ADIBO材料。

稱量上述干燥的S-oxy-ADIBO材料1.0g,氮?dú)獗Ｗo(hù)，溶于10mL無水N，N-二甲基酰胺(DMF)中，加入疊氮化的環(huán)糊精(1.12mmol,1.30g),室溫?cái)嚢?h,停止反應(yīng)，減壓抽濾，依次用30mL N，N-二甲基酰胺和20mL無水甲苯，20mL甲醇，20mL水，20mL甲醇洗滌，60℃下干燥固化6h,得到環(huán)糊精材料，命名為S-oxy-ADIBO CD，室溫保存。

實(shí)施例2

和實(shí)施例1不同之處，烷氧基硅烷試劑為三乙氧基異氰基硅烷試劑，將其(2.47g，10mmol)溶于20mL無水處理的四氫呋喃溶液中，電磁攪拌，加入末端含有氨基，兩側(cè)含有甲氧基苯基的ADIBO試劑(4.22g，10mmol)，室溫?cái)嚢瑁合嗌V檢測(cè)得到ADIBO修飾的異氰基硅烷試劑。氮?dú)獗Ｗo(hù)，將干燥好的硅膠(2.5g),溶于30mL無水甲苯中，加入上述制備得到的ADIBO硅烷試劑，并滴加吡啶(6mmol,480μL)，加熱回流，反應(yīng)24h，停止反應(yīng)，冷卻抽濾，依次用無水甲苯，四氫呋喃，甲醇，水，甲醇洗滌，80℃下干燥固化6h,得到ADIBO試劑活化的硅膠，命名為S-isocyano-MeO-ADIBO材料；

稱量上述干燥的S-isocyano-ADIBO材料1.5g,氮?dú)獗Ｗo(hù)，溶于10mL無水N，N-二甲基酰胺(DMF)中，加入疊氮化的環(huán)糊精(1.12mmol,1.30g),室溫?cái)嚢?h,停止反應(yīng)，減壓抽濾，依次用30mL N，N-二甲基酰胺和20mL無水甲苯，20mL甲醇，20mL水，20mL甲醇洗滌，60℃下干燥固化6h,得到環(huán)糊精材料，命名為S-isocyano-MeO-ADIBOCD，室溫保存。

實(shí)施例3

和實(shí)施例2不同之處，在于烷氧基硅烷試劑為戊二醛修飾的氨基丙基三甲氧基硅烷試劑，ADIBO試劑末端含有氨基，兩側(cè)含有磺酸基取代的苯基；環(huán)糊精試劑首先進(jìn)行了衍生化，衍生化試劑為異氰基苯，具體實(shí)施方式為：

室溫，向已經(jīng)制備好的疊氮化環(huán)糊精(3.48g,3mmol)的DMF溶液中(30mL)，緩慢滴加異氰基苯試劑(12mL,60mmol)，加入吡啶(30mL)攪拌12h，抽濾，并用丙酮重結(jié)晶所得到的異氰基苯衍生化的疊氮環(huán)糊精CPCD；

將戊二醛修飾的氨基丙基三甲氧基硅烷試劑(2.0g，5mmol)溶于20mL無水處理的四氫呋喃溶液中，電磁攪拌，加入末端含有氨基，兩側(cè)含有磺酸基取代苯基的ADIBO試劑(4.22g，10mmol)，室溫?cái)嚢?，液相色譜檢測(cè)得到ADIBO修飾的含有戊二醛的硅烷試劑。氮?dú)獗Ｗo(hù)，將干燥好的硅膠(2.5g),溶于30mL無水甲苯中，加入上述制備得到的ADIBO硅烷試劑，并滴加吡啶(6mmol,480μL)，加熱回流，反應(yīng)24h，停止反應(yīng)，冷卻抽濾，依次用無水甲苯，四氫呋喃，甲醇，水，甲醇洗滌，80℃下干燥固化6h,得到ADIBO試劑活化的硅膠，命名為S-glutaral-sulfo-ADIBO材料；

稱量上述干燥的S-glutaral-sulfo-ADIBO材料1.5g,氮?dú)獗Ｗo(hù)，溶于10mL無水N，N-二甲基酰胺(DMF)中，加入CPCD(1.12mmol,3.0g),室溫?cái)嚢?h,停止反應(yīng)，減壓抽濾，依次用30mL N，N-二甲基酰胺和20mL無水甲苯，20mL甲醇，20mL水，20mL甲醇洗滌，60℃下干燥固化6h,得到環(huán)糊精材料，命名為S-glutaral-sulfo-ADIBOCPCD，室溫保存。

實(shí)施例4

室溫，向末端含有羧基，兩側(cè)含有苯基的ADIBO試劑(3.19g,10mmol)的二甲基甲酰胺溶液中加入EDC(3.82g,20mmol)，NHS(2.5g,21mmol)，活化ADIBO試劑的羧基官能團(tuán)2h,不對(duì)溶液做任何的后處理，直接用于下一步的反應(yīng)中；

氮?dú)獗Ｗo(hù)，取氨丙基三甲氧基硅烷試劑(2.21g，10mmol)，溶于20mL二甲基甲酰胺溶液中，電磁攪拌，加入上述活化后的ADIBO試劑，室溫?cái)嚢?，LC-MS檢測(cè)活化后的ADIBO試劑和硅烷試劑的反應(yīng)進(jìn)程，至反應(yīng)完全；

氮?dú)獗Ｗo(hù)，將干燥好的硅膠(2.5g),溶于30mL無水甲苯中，加入上述制備得到的ADIBO硅烷試劑，并滴加吡啶(6mmol,480μL)，加熱回流，反應(yīng)24h，停止反應(yīng)，冷卻抽濾，依次用無水甲苯，四氫呋喃，甲醇，水，甲醇洗滌，80℃下干燥固化6h,得到含有酰胺鍵的ADIBO硅膠，命名為S-amide-ADIBO材料；

稱量上述干燥的S-amide-ADIBO材料1.5g,氮?dú)獗Ｗo(hù)，溶于10mL無水N，N-二甲基酰胺(DMF)中，加入疊氮化的環(huán)糊精(1.12mmol,1.30g),室溫?cái)嚢?h,停止反應(yīng)，減壓抽濾，依次用30mL N，N-二甲基酰胺和20mL無水甲苯，20mL甲醇，20mL水，20mL甲醇洗滌，60℃下干燥固化6h,得到環(huán)糊精材料，命名為S-amide-ADIBO CD，室溫保存；

將所制備的環(huán)糊精材料裝在液相色譜柱中，用于親水色譜模式下，分離核苷和聚糖類等極性小分子化合物；

附圖2:S-amide-ADIBO CD色譜柱(4.6×150mm)對(duì)果聚糖的分離,分離條件：A流動(dòng)相，乙腈ACN，B流動(dòng)相，水H₂O，0-30min,85％A to 50％A,流速，1mL/min,溫度，25℃?？梢钥闯觯蛛x性能良好。