專利名稱：：用于固定金屬離子色譜法(imac)的螯合基團的固定的制作方法用于固定金屬離子色譜法(IMAC)的螯合基團的固定本發(fā)明涉及用于將多羧酸結(jié)合到固相的方法。此外，本發(fā)明涉及具有被固定的多羧酸的固相和使用該固相例如用于純化重組多肽的方法。用于純化重組蛋白質(zhì)的非常有力的策略是“His-標(biāo)記”的使用，所述“His-標(biāo)記”一般包括6-10個連續(xù)組氨酸。His-標(biāo)記與Ni2+-離子的游離配位點緊密結(jié)合。它們可以通過高濃度的咪唑釋放，所述高濃度的咪唑競爭在Ni2+上的配位點。特定吸收和解吸的此種循環(huán)可以用于所需蛋白質(zhì)的一步純化，導(dǎo)致100或甚至更多的富集因子。這種技術(shù)最廣泛使用的變體使用經(jīng)由氨基基團與瓊脂糖珠偶聯(lián)的NaNa-雙(羧甲基)_賴氨酸。活性基團是加載Ni2+的NTA(氮川三乙酸)，而間隔物是氨基丁基基團。然而，此種Ni2+-NTA-基質(zhì)具有幾個嚴(yán)重缺點，例如關(guān)于NaNa-雙(羧甲基)_賴氨酸的高成本。另外的缺點是被固定的Ni2+-離子的不穩(wěn)定性。因為NTA僅具有關(guān)于Ni2+-的4個配位點，所以Ni2+離子從基質(zhì)中容易地泄漏并且污染蛋白質(zhì)樣品。由于至少2個原因存在嚴(yán)重問題Ni2+是偏毒性的重金屬，并且它催化不希望有的蛋白質(zhì)樣品氧化。此外，NTA結(jié)合的M2+容易地通過蛋白質(zhì)保護試劑例如DTT(二硫蘇糖醇)還原，并且隨后從基質(zhì)中釋放。最后，金屬螯合蛋白酶抑制劑例如EGTA或EDTA無法與Ni2+-NTA-基質(zhì)組合，因為它們從這種基質(zhì)中提取Ni2+-離子。US6，670，159描述了用于制備基于NTA的金屬螯合綴合物的方法，其中在碳化二亞胺的存在下，NTA或其鹽在水介質(zhì)中在至少8的堿性pH下與包含伯胺基團的蛋白質(zhì)屬性的分子反應(yīng)。WO2004/036189公開了使用金屬螯合物改性的載體用于分離多肽的方法。這種載體包括經(jīng)由甲酰胺基團與氨基改性的固相結(jié)合的NTA。GB2067203公開了包括與之結(jié)合的經(jīng)由單個甲酰胺基團或經(jīng)由2個甲酰胺基團結(jié)合的EDTA酰胺混合物的載體的聚合螯合劑。既未公開也未暗示這種載體用于純化多肽的用途。US2004/204569公開了包括(His-Asn)6-標(biāo)記的His-標(biāo)記蛋白質(zhì)。US2002/164718公開了用于固定金屬離子色譜法(IMAC)的親和性多肽，其包括具有由His、2個脂族或酰胺氨基酸，His,3個堿性或酸性氨基酸，His和脂族或酰胺氨基酸組成的氨基酸序列的間隔的HiS-標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明的目的是提供適合于固定金屬離子色譜法(IMAC)的新方法和組合物，以避免現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問題。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)與Ni2+絡(luò)合的基于EDTA的固相，特別是其中EDTA的羧基與固相上的氨基基團結(jié)合的固相，在固定金屬離子色譜法(IMAC)應(yīng)用中具有極佳性質(zhì)，特別用于純化包含多組氨酸標(biāo)記的重組多肽。這個發(fā)現(xiàn)是完全出乎意料的根據(jù)現(xiàn)有文獻，基于EDTA的固相應(yīng)不適合于鎳螯合物色譜法，因為這種六齒(hexadentate)螯合劑應(yīng)占據(jù)Ni2+上的所有6個配位，推測不留下一個用于結(jié)合組氨酸殘基。與這個預(yù)測相反，發(fā)現(xiàn)基于EDTA的固相不僅顯示與過渡金屬離子特別是M2+離子的穩(wěn)定結(jié)合，而且所得到的具有Μ2+、Ζη2+、Co2+或Cu2+的絡(luò)合物對于組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)具有高度選擇性。本發(fā)明的第一個方面涉及具有6個或更多配位基團的固定螯合劑用于固定金屬離子色譜法(IMAC)，特別是用于純化多組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)的用途。優(yōu)選地，固定螯合劑是具有6個或更多配位基團的多羧酸酰胺或酯，所述配位基團特別選自氨基、羧基、甲酰胺和氧肟酸鹽基團。更優(yōu)選地，固定螯合劑是具有式(la)或(lb)結(jié)構(gòu)的具有被固定的多羧酸的固相<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中SP是固相；R1是不干擾固相應(yīng)用的氫或有機殘基，例如CfQ烷基原子團，和PCA是多羧酸特別是氨基多羧酸殘基，或其鹽。更加優(yōu)選地，固相具有式(II)結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>2(in其中SP是固相；和一個或多個羧酸基團可以是去質(zhì)子化的。固相結(jié)合的多羧酸(la)、(lb)或(II)可以與多價金屬離子例如Ni2+離子絡(luò)合。本發(fā)明的另一個方面指用于使具有6個或更多配位基團的多羧酸與固相結(jié)合的方法，其包括步驟(a)提供多羧酸和包括氨基基團的固相，(b)在縮合劑的存在下使氨基基團與多羧酸反應(yīng)，其中縮合劑以超過氨基基團的摩爾過量存在，并且多羧酸以超過縮合劑和氨基基團的摩爾過量存在，并且其中多羧酸的單個羧基基團與氨基基團反應(yīng)。本發(fā)明的另一個方面指具有式(la)或(lb)結(jié)構(gòu)的具有被固定的多羧酸的固相<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中SP是固相；R1是不干擾固相應(yīng)用的氫或有機殘基，例如q-Q烷基原子團，和PCA是多羧酸特別是氨基多羧酸殘基，或其鹽，其中被固定的多羧酸酰胺或酯具有至少6個或更多配位基團，所述配位基團特別選自氨基、羧基、甲酰胺和氧肟酸鹽基團，并且其中固相的表面優(yōu)選基本上不含可觸及的氨基基團，其中在固相表面上例如彡90%、優(yōu)選>95%和更優(yōu)選>99%的可觸及的氨基基團被阻斷。在本發(fā)明的某些實施方案中，甲酰胺基團-NRi-CO-與固相直接結(jié)合。在其他實施方案中，甲酰胺基團經(jīng)由接頭與固相結(jié)合，其可以具有1個原子直至20個原子，優(yōu)選2-12個原子，例如2-6個原子的長度，所述原子可以選自碳原子和任選雜原子例如0和/或N。本發(fā)明的另一個方面是純化重組多肽的方法，其包括步驟(a)提供包括具有多個組氨酸殘基例如多個連續(xù)組氨酸殘基的多肽的樣品，(b)使樣品與包含預(yù)先結(jié)合的絡(luò)合金屬離子例如附2+離子的如上所述的固相接觸，條件是其中所述重組多肽與所述固相選擇性結(jié)合，(c)使結(jié)合的重組多肽與其他樣品組分分離，和(d)從固相中洗脫重組多肽。本發(fā)明的另一個方面是包括在序列[HnSm]k中具有至少4個組氨酸殘基的“間隔的組氨酸標(biāo)記”的重組多肽，其中H是組氨酸，S是不同于組氨酸的選自甘氨酸和/或絲氨酸和/或蘇氨酸的氨基酸殘基，n在每種情況下獨立地是1-4，m在每種情況下獨立地是1-6，并且k是2-6、優(yōu)選2-5。間隔組氨酸標(biāo)記可以具有常規(guī)序列，即n和m在每次事件中可以具有相同值或不規(guī)則序列，即n和m可以具有不同值。在多組氨酸-標(biāo)記內(nèi)的大量組氨酸可能增加對于Ni2+螯合物基質(zhì)的結(jié)合強度和特異性。然而，太多連續(xù)組氨酸可能降低重組蛋白質(zhì)的表達水平和溶解性，例如在大腸桿菌(E.coli)中重組表達的蛋白質(zhì)。這些問題可以通過用短間隔物，即用間隔的組氨酸標(biāo)記中斷組氨酸的連續(xù)運行來克服，所述短間隔物包括甘氨酸、絲氨酸和/或蘇氨酸。與常規(guī)寡聚組氨酸標(biāo)記對比，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明用間隔的組氨酸標(biāo)記進行標(biāo)記時，重組蛋白質(zhì)例如核轉(zhuǎn)運受體或二氫葉酸還原酶(DHFR)在大腸埃希桿菌(Escherichiacoli)中的表達過程中顯示更高的表達和更佳的溶解性。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于使多羧酸與固相結(jié)合的方法。多羧酸具有6個或更多，例如6、7或8個配位基團。優(yōu)選地，多羧酸具有4、5個或更多羧酸基團。多羧酸可以是氨基、氮川或醚多羧酸，其中氨基多羧酸特別地具有叔胺基團的氨基多羧酸是優(yōu)選的。多羧酸的特定例子是乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙(2-氨基乙醚)-N，N，N',N'-四乙酸(EGTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和三乙烯四胺-N，N，N',N'，N〃，N〃-六乙酸(TTHA)。特別優(yōu)選的是EDTA。多羧酸優(yōu)選與包括伯胺或仲胺基團的固相結(jié)合。結(jié)合在允許多羧酸的僅一個羧基基團與固相選擇性結(jié)合的條件下實施，無需分離活化或衍生形式的多羧酸例如酐、活性酯、或其中多羧酸的伯胺或仲胺基團保持用于后續(xù)偶聯(lián)步驟的可觸及的形式。借助于羧基基團和氨基基團之間的反應(yīng)，形成甲酰胺鍵。固相可以是氨基官能化的色譜法載體。例如固相可以選自氨基官能化碳水化合物，例如瓊脂糖、瓊脂糖凝膠或纖維素，金屬或半金屬例如硅或其氧化物例如硅膠、玻璃，塑料例如聚苯乙烯，或脂質(zhì)例如含磷脂酰乙醇胺或磷脂酰絲氨酸的磷脂。此外，固相可能包括顆粒，例如囊泡、磁珠、量子點、囊泡或蛋白質(zhì)。固相上的氨基基團優(yōu)選是伯胺或仲胺基團，例如脂族伯胺基團。固相的氨基官能化可以通過已知方法來實施，例如通過使含氨基基團的硅烷例如氨丙基三乙氧基硅烷與固相例如硅膠或玻璃反應(yīng)，或通過使氨水與環(huán)氧活化的固相反應(yīng)。優(yōu)選地，硅膠或玻璃的氨基官能化用氨丙基三甲氧基硅烷或氨丙基三乙氧基硅烷來實施。碳水化合物例如瓊脂糖、瓊脂糖凝膠或纖維素優(yōu)選首先用環(huán)氧氯丙烷或環(huán)氧溴丙烷進行環(huán)氧活化，以產(chǎn)生環(huán)氧活化的基質(zhì)，并且隨后用過量氨水、伯胺或羥胺處理，以產(chǎn)生氨基改性的基質(zhì)。在固相上的氨基基團密度可以通過氨基官能化的反應(yīng)條件例如反應(yīng)物的溫度、持續(xù)時間和/或濃度而改變。例如，氨基官能化試劑可以用鈍化劑稀釋，例如包含非氨基基團的硅烷，以便在需要時減少表面上的氨基基團密度。含氨基基團的反應(yīng)物可以用鈍化劑稀釋至例如1-50%的濃度，優(yōu)選用縮水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷和3-巰基1，2_丙二醇之間的反應(yīng)產(chǎn)物。可替代地，氨基密度可以通過使用雙或多功能試劑增加，所述雙或多功能試劑包含2個或更多伯胺或仲胺基團例如1，13-二氨基-4，7，10-trioxatridexaneo因此，可以增加基質(zhì)對于His-標(biāo)記的蛋白質(zhì)的親和力。因此，可以選擇反應(yīng)條件以獲得具有所需特征的終產(chǎn)物，例如致使His-標(biāo)記的蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合終產(chǎn)物，而其他蛋白質(zhì)的本底結(jié)合最小。最佳氨基密度可以根據(jù)實施例中所描述的操作對于每種固體載體進行經(jīng)驗性確定。例如，具有長組氨酸標(biāo)記(具有例如>10個組氨酸殘基)的蛋白質(zhì)的純化，優(yōu)選用這樣的表面來實施，即所述表面具有比具有6個組氨酸殘基標(biāo)記的蛋白質(zhì)的純化更低密度的m2+-絡(luò)合的多羧酸酰胺基團。相反，在變性條件下的純化，例如在胍氯化物的存在下，優(yōu)選用比在天然條件下的純化更高密度的螯合基團來實施。在下一個步驟中，實施多羧酸的一個羧基基團和在表面上的氨基基團之間的縮合反應(yīng)。圖1顯示用EDTA作為多羧酸例示的這個反應(yīng)的示意性描述。在縮合劑的存在下實施反應(yīng)，所述縮合劑可以選自碳化二亞胺、碳酸鹽例如二(N-琥珀酰亞胺基)碳酸鹽、0-(N-琥珀酰亞胺基)-N，N，N',N'-四甲基脲四氟硼酸鹽或類似化合物。碳化二亞胺例如1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳化二亞胺(EDC)或N，N'-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)是優(yōu)選的。當(dāng)多羧酸以超過氨基和/或縮合劑足夠摩爾過量存在時，發(fā)現(xiàn)在其中多羧酸的單個羧基與固相上的氨基反應(yīng)的反應(yīng)條件。在一個優(yōu)選實施方案中，為了獲得關(guān)于IMAC的高度特異性基質(zhì)，選擇在其中氨基基本上量化地與多羧酸反應(yīng)的反應(yīng)條件。因此，應(yīng)使用縮合劑超過氨基基團的至少2倍摩爾過量、優(yōu)選至少4倍摩爾過量，以及多羧酸超過氨基基團的至少5倍過量、優(yōu)選至少10倍摩爾過量和更優(yōu)選至少25倍摩爾過量(參見實施例)。優(yōu)選在水相中實施反應(yīng)。反應(yīng)條件優(yōu)選是pH5-9、更優(yōu)選pH7_8.5。優(yōu)選使用與飽8和限度(例如0.5M用于EDTA和0.1M用于EGTA)接近的多羧酸和以多羧酸濃度1/10-1/50的縮合劑。反應(yīng)產(chǎn)物是具有經(jīng)穩(wěn)定的羧酸酰胺鍵將多羧酸固定于其上的固相。優(yōu)選地，固相具有如上所述的被固定的式(la)結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，被固定的多羧酸殘基仍具有至少3、4個或更多羧基和任選進一步的螯合基團例如氨基或醚基團。如果所述多羧酸是EDTA，那么固相優(yōu)選具有式(II)結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中SP是固相。本發(fā)明的固相例如EDTA-酰胺固相對于多價金屬離子具有高親和力，例如過渡金屬離子如Ni2+、Zn2+、C02+或Cu2+-離子。這些金屬離子與根據(jù)本發(fā)明固定的螯合劑的幾種組合提供高度選擇性基質(zhì)用于結(jié)合組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)而相比傳統(tǒng)的被固定的NTA-基團具有較少的非特異性結(jié)合(參見圖2和3)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的固相基本上量化地不含可觸及的氨基基團，例如伯胺基團和/或羥基基團，因為未反應(yīng)的氨基基團可以是不攜帶His-標(biāo)記的多肽的低親和力Ni2+結(jié)合和高非特異性本底結(jié)合的原因。因此，可能希望在固相表面上>90%、優(yōu)選^95%和更優(yōu)選>99%的可觸及的氨基基團，特別是伯胺基團是被阻斷的，例如通過由縮合劑介導(dǎo)的與多羧酸的反應(yīng)。可觸及的未反應(yīng)基團例如伯胺基團的量可以根據(jù)已知方法進行測定，例如通過茚三酮測試或0PA(鄰苯二甲醛/硫醇)反應(yīng)。此外，優(yōu)選固相例如EDTA-酰胺固相基本上不含松散結(jié)合的多價金屬離子，例如附2+離子。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)當(dāng)最初用附2+離子飽和EDTA-酰胺基質(zhì)時，其顯著量可能保持僅與之松散結(jié)合，特別地，當(dāng)固體載體仍包含未反應(yīng)的氨基基團時。該松散結(jié)合的附2+級份可以用合適試劑例如二甲基乙二肟檢測出。例如，在將溶解于乙醇中的0.2-1體積w/v的二甲基乙二肟加入在Tris-緩沖液pH7.5中的Ni2+裝載基質(zhì)并且使混合物在60°C下振蕩15分鐘后，任何松散結(jié)合的附2+離子都可以作為粉紅色沉淀物被檢測出。松散結(jié)合的金屬離子可能引發(fā)問題，即含蛋白質(zhì)樣品被毒性和氧化性附2+離子污染和增加的非His-標(biāo)記蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合。因此，本發(fā)明的固相優(yōu)選基本上不含松散結(jié)合的金屬離子，特別是松散結(jié)合的附2+離子。松散結(jié)合的金屬離子可以這樣從固相中去除，例如通過使固相與游離多羧酸螯合劑例如NTA或EGTA或EDTA接觸，優(yōu)選在約pH7.5下，例如與40mMNTA或10mMEGTA或10mMEDTA接觸，直至松散結(jié)合的金屬離子已變得無法檢測時，例如通過使基質(zhì)與對于相關(guān)金屬離子合適的檢測試劑接觸，例如用于檢測附2+離子的二甲基乙二肟。在去除松散結(jié)合的金屬離子后，其余離子保持如此緊密的結(jié)合，使得即使在室溫下與等體積0.5MEDTA(pH7.5)過夜溫育也不足以從EDTA-酰胺基質(zhì)中完全釋放。相比之下，應(yīng)當(dāng)指出用40mMNTA或10mMEGTA或10mMEDTA預(yù)洗滌商購可得的Ni_NTA_瓊脂糖(Qiagen)或Ni_NTA_酰胺基質(zhì)不僅去除了松散結(jié)合的附2+離子，還明顯去除是所有結(jié)合的附2+離子(圖4)。令人驚訝的是，未發(fā)現(xiàn)EDTA中的一個羧基向甲酰胺基團的轉(zhuǎn)化將弱化在中性pH下對Ni2+的親和力的指示。相反，甲酰胺的羰基氧或氨基基團可以明顯銜接與Ni2+的配位鍵，暗示著EDTA-酰胺真實地是六齒螯合物。甲酰胺基團能配位Ni2+是證明，例如，來自甲基輔酶M-還原酶，其中提供給Ni2+的4個配位點由輔酶F430提供的，而第五個是由谷氨酰胺側(cè)鏈的甲酰胺提供的(Ermler等人，Science278(1997)，1457)。本發(fā)明的固相可以用于固定金屬離子色譜法(IMAC)。在這種色譜法中，包含多個組氨酸殘基，例如連續(xù)組氨酸殘基，例如至少6個連續(xù)組氨酸殘基的多肽與本發(fā)明的金屬絡(luò)合物固相選擇性結(jié)合，并且與其他組分分離。所述多肽可以通過加入合適的洗脫劑如咪唑從固相中洗脫。咪唑濃度優(yōu)選在1至lOOOmM的范圍中，依賴于被固定的活性基團的密度、多組氨酸標(biāo)記的長度和被標(biāo)記的蛋白質(zhì)的多聚狀態(tài)。對于His-標(biāo)記的蛋白質(zhì)的IMAC純化起作用，迄今為止假定被固定的螯合劑應(yīng)僅占據(jù)附2+的6個配位點中的3-5個。因此，本發(fā)明的一個出乎意料的方面是被固定的六齒螯合劑如EDTA-酰胺或EDTA-羥酰胺和甚至具有超過6個配位基團的螯合劑對于本申請工作極其良好。顯而易見的是，組氨酸側(cè)鏈可以暫時取代在給定螯合劑內(nèi)的弱配位基團。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，被固定的螯合劑，即被固定的多羧酸酰胺具有6個或更多配位基團，特別是選自氨基、羧基、甲酰胺和氧肟酸鹽基團?？梢栽诒景l(fā)明的固相上形成例如EDTA-酰胺例如與Ni2+在動態(tài)上非常穩(wěn)定的絡(luò)合物。所得到的基質(zhì)對Ni2+-提取非常有抗性，例如通過EGTA或NTA。即使0.5M的EDTA也僅非常緩慢地提取Ni2+，即在數(shù)小時至數(shù)天的時間尺度上。通過在緩沖液中包含咪唑例如ImM咪唑進一步增加針對Ni2+提取的抗性。因此，可以在螯合金屬蛋白酶抑制劑例如以l-10mM例如5mM濃度的EDTA的存在下，實施用本發(fā)明的固相例如EDTA-酰胺基質(zhì)的IMAC。傳統(tǒng)的Ni-螯合物基質(zhì)，例如M-NTA瓊脂糖，通過蛋白質(zhì)保護試劑例如二硫蘇糖醇(DTT)容易被減少。即使低的毫摩爾濃度的DTT也以呈褐色還原產(chǎn)物的形式提取鎳。相比之下，其中已去除松散結(jié)合的Ni2+的Ni2+EDTA-酰胺基質(zhì)未顯示這些問題。相反，在Ni2+EDTA-酰胺硅膠上，在極高濃度的DTT例如0.5M或1MDTT的存在下，可以成功地純化his-標(biāo)記的蛋白質(zhì)(圖5)，這是比在典型的蛋白質(zhì)純化方案中使用的DTT濃度高100-1000倍。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，包含本發(fā)明的固相的金屬離子例如附2+離子在含硫醇或含二硫醇的還原劑例如DTT的存在下優(yōu)選對于在室溫下至少1小時是穩(wěn)定的，所述DTT以至少10mM、優(yōu)選至少20mM、更優(yōu)選至少50mM、和更加優(yōu)選至少100mM或甚至至少500mM、和直至lOOOmM或甚至更高的濃度。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，用在“間隔的組氨酸標(biāo)記”中優(yōu)選在序列[HnSjk中包含多個組氨酸殘基的重組多肽實施色譜法，其中H是組氨酸，S是選自甘氨酸和/或絲氨酸和/或蘇氨酸的間隔物殘基，n是1-4，m是1-6、優(yōu)選1_4，并且k是2_8、優(yōu)選2-6。標(biāo)記的長度優(yōu)選是8至50個氨基酸、更優(yōu)選12至40個氨基酸。本發(fā)明還包括不規(guī)則間隔的組氨酸標(biāo)記，其中寡聚組氨酸簇的長度和間隔物區(qū)域的長度在給定標(biāo)記序列內(nèi)變化。間隔的組氨酸標(biāo)記優(yōu)選位于重組多肽的N和/或C末端處和/或插入重組多肽的序列內(nèi)。0055]此外，本發(fā)明通過下圖和實施例更詳細地說明。圖例圖1關(guān)于EDTA與含胺載體偶聯(lián)的圖示。在其中在EDTA的單個羧基與載體上的氨基之間發(fā)生選擇性反應(yīng)的條件下實施反應(yīng)。圖2各種含Ni2+-色譜法基質(zhì)在IMAC中的蛋白質(zhì)結(jié)合特異性的對比。顯示了各種His-標(biāo)記的蛋白質(zhì)，即對比基質(zhì)(NTA-Qiagen)和3種本發(fā)明的基質(zhì)(EDTA-酰胺硅膠I、EDTA-酰胺硅膠II和EDTA-酰胺瓊脂糖凝膠)的蛋白質(zhì)結(jié)合特征(關(guān)于細節(jié)參考實施例5)。圖3用于IMAC的各種螯合劑與過渡金屬離子的組合。顯示了在各種過渡金屬離子的存在下各種基質(zhì)(本發(fā)明的EDTA，EGTA和TTHA基質(zhì)以及NTA基質(zhì))與不同螯合劑的蛋白質(zhì)結(jié)合性質(zhì)(關(guān)于細節(jié)參考實施例6)。圖4=Ni-螯合物基質(zhì)針對通過游離螯合劑提取Ni2+的抗性。顯示了Ni2+結(jié)合至本發(fā)明的EDTA-酰胺基質(zhì)和至對比NTA基質(zhì)的強度(關(guān)于細節(jié)參考實施例7)。圖5各種Ni-螯合物基質(zhì)針對含硫醇的還原劑的抗性。顯示了各種含Ni2+螯合劑基質(zhì)(本發(fā)明的EDTA-酰胺基質(zhì)和對比NTA基質(zhì))針對Ni2+提取和在DTT的存在下的還原的抗性(關(guān)于細節(jié)參考實施例8)。圖6間隔多組氨酸標(biāo)記的表征。A)顯示了本發(fā)明間隔的聚-His標(biāo)記(間隔H14、間隔H21和間隔H28)和對比His標(biāo)記(MRGS6和H10)的結(jié)合表征。B)顯示了包含本發(fā)明間隔的His-標(biāo)記和對比His-標(biāo)記(HlO)的蛋白質(zhì)的表達(關(guān)于細節(jié)參考實施例9)。實施例實施例1:Ni-EDTA_酰胺瓊脂糖凝膠4B的制備。在玻璃漏斗上用1升0.IMNaOH(在水中)、隨后1升純凈水5次預(yù)洗滌1升瓊脂糖凝膠4B，轉(zhuǎn)移至5升燒瓶，并且用水填充至2升的體積。加入0.8molNaOH,并且使溫度調(diào)整至25°C，隨后加入1.Omol環(huán)氧溴丙烷。隨后使混合物在25°C下振蕩2小時，并且隨后在冰上冷激。隨后通過玻璃漏斗經(jīng)過濾回收所得到的環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠，用水洗滌，并且重懸浮于2MNH4Cl(在水中的終濃度，終體積2升)中。加入來自25%水溶液的4molNH3,并且使混合物在室溫下振蕩ο/η。用水洗滌經(jīng)過濾回收所得到的NH2-瓊脂糖凝膠4Β直至無法檢測到游離NH3,并且重懸浮于0.5ΜEDTA/Na+pH8.0(終濃度，終體積2升)。隨后，加入50mmolEDC,并且使混合物在室溫下振蕩1小時。其后，加入另一個50mmolEDC等份試樣，并且允許反應(yīng)進行o/η。經(jīng)過濾回收所得到的EDTA-酰胺瓊脂糖凝膠，并且洗滌直至游離EDTA-濃縮物降至IJImM下。隨后用Tris緩沖液pH7.5中的20mMNiCl2加載瓊脂糖凝膠，直至游離Ni2+在非結(jié)合級份中出現(xiàn)。隨后通過用水、IOmMNTApH7.5、水洗滌來去除游離和松散結(jié)合的Ni2+離子，并且最終重懸浮于30%乙醇+IOmM咪唑/HCl+lmMNTApH7.5中用于長期貯存。通過改變環(huán)氧活化步驟可以調(diào)整Ni2+EDTA-酰胺瓊脂糖凝膠的性質(zhì)。在較高溫度下(高達40°C)偶聯(lián)且使用較高濃度的環(huán)氧氯丙烷和NaOH(分別高達1.2M環(huán)氧氯丙烷和1.0MNaOH)將導(dǎo)致較高的偶聯(lián)密度，但也是更高的本底結(jié)合。使用較低濃度的環(huán)氧氯丙烷和NaOH(分別降至0.2M環(huán)氧氯丙烷和0.IMNaOH)的較低溫度(低至18°C)將導(dǎo)致較低的偶聯(lián)密度，和甚至更低的本底結(jié)合，但也是較低的特異性結(jié)合能力，特別對于具有短His-標(biāo)記的蛋白質(zhì)而言。實施例2=EDTA-酰胺磁珠的制備。在水中洗滌5ml胺-末端的磁珠(Sigma#17643_5ml)，并且以5ml終體積重懸浮于0.5MEDTA/Na+pH8.0中。加入125μmolEDC等分試樣，并且使反應(yīng)在室溫下振蕩1小時。其后，加入另一個125molEDC等分試樣，并且使反應(yīng)繼續(xù)ο/η。通過磁分離回收所得到的EDTA-酰胺磁珠，在水中洗滌，并且與實施例1類似地加載Ni2+或另一種金屬離子。實施例3高密度EDTA-酰胺硅膠的制備使IOOgDavisilXWP1OOOA90-130(Grace)重懸浮于500ml3%(ν/ν)氨丙基三乙氧基硅烷、4%水、93%乙醇中，并且在40°C下輕輕振蕩2小時，并且隨后在室溫下ο/η。通過過濾回收氨基改性的硅膠，并且通過用純凈水洗滌回收去除游離硅烷。如對于瓊脂糖凝膠4Β所述地實施與EDTA的共價偶聯(lián)和加載Ni2+。對于長期貯存，產(chǎn)物可以進行脫水或脫異丙醇。實施例4具有鈍化表面的EDTA-酰胺硅膠的制備當(dāng)在IMAC中使用時，來自實施例3的Ni2+EDTA-酰胺硅膠仍具有高本底結(jié)合。該本底可能起因于殘留硅醇基團和氨基基團(出于立體原因無法與活化EDTA反應(yīng))和/或高表面濃度的EDTA-酰胺。通過在用氨丙基-硅烷改性硅膠的過程中包括鈍化硅烷可以解決本底問題。迄今為止最佳鈍化的硅烷是縮水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷和3-巰基1，2-丙二醇之間的反應(yīng)產(chǎn)物。使3ml縮水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷與3ml2_巰基1，3_丙二醇、90ml甲醇、4ml水和IOyl4-甲基嗎啉混合，并且允許該反應(yīng)在25°C下進行30分鐘。加入150μ1氨丙基三甲氧基硅烷，并且如上所述使用所得到的混合物改性30gDavisilXffPlOOOA90-130。氨基硅烷和鈍化硅烷之間的比例在該實施例中定義為5%。然而，它可以在和50%之間改變。所得到的鈍化氨基-硅膠隨后與EDTA或另一種螯合基團反應(yīng)，加載金屬離子，并且如上所述進行處理以去除松散結(jié)合的金屬離子。實施例5含Ni2+-色譜法載體在IMAC中的對比測試了下述色譜法載體<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(實施例1)使大腸桿菌細胞重懸浮于緩沖液(50mMTris/HClpH7.5、2mM乙酸鎂、50mMNaCl、5mM巰基乙醇)中。制備溶解產(chǎn)物，并且通過超速離心法澄清。隨后，加入包含核輸出信號(NES)、黃色熒光蛋白(YFP)和C末端十His-標(biāo)記的ΙμΜ融合蛋白(〃NES-YFP-H1/)，或麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)與C末端六His-標(biāo)記之間的ΙμΜ融合物(〃MBP-H6")，或包含十His-標(biāo)記、ZZ-標(biāo)記和小鼠輸出蛋白CRMl的0.5μΜ融合蛋白(〃H10-ZZ-CRMl")，并且用作起始材料用于結(jié)合實驗。用ImM咪唑補充起始材料用于十-His-標(biāo)記的蛋白質(zhì)的純化。400μ1起始材料各自與10μ1色譜法載體在4°C下旋轉(zhuǎn)ο/η。在用5ml緩沖液洗滌后，用0.4M咪唑pH7.5洗脫結(jié)合的蛋白。分析是通過在12%丙烯酰胺凝膠上的SDS-PAGE，隨后通過考馬斯-染色進行的。載量對應(yīng)于0.5μ1基質(zhì)。圖2顯示關(guān)于NES-YFP-Hltl(小圖A)、MBP-H6(小圖B)禾ΠH10-ZZ-CRMl(小圖C)的結(jié)果。所有測試的基質(zhì)顯示His-標(biāo)記的蛋白質(zhì)的有效結(jié)合。然而，與NTA-Qiagen基質(zhì)對比，本發(fā)明的基質(zhì)顯示顯著更低的本底。實施例6各種螯合劑和過渡金屬離子用于IMAC的測試具有5%偶聯(lián)密度的氨基-硅膠(如實施例4中描述的)與EDTA、EGTA、NTA或TTHA綴合。所得到的基質(zhì)各自隨后加載M2+、Co2+、Zn2+或Cu2+。如實施例5中所述實施關(guān)于NES-YFP-Hltl的結(jié)合測定法，然而，在洗滌緩沖液中包括IOOmMNaCl。圖3顯示基質(zhì)和金屬離子的測試組合顯示NES-YFP-Hltl的有效結(jié)合。實施例7=Ni-螯合物基質(zhì)針對通過游離螯合劑提取Ni2+的抗性。用30mlTris-緩沖液、或IOmMEDTApH7.6、或IOmMEGTAρΗ7·6、或40mMNTAPH7.6經(jīng)45分鐘的時間洗滌各ImlNi2+-EDTA-酰胺硅膠(50%偶聯(lián)密度；根據(jù)實施例4制備)、Ni2+-NTA-酰胺硅膠(50%偶聯(lián)密度)或Ni2+-NTA-瓊脂糖(Qiagen)，隨后在結(jié)合緩沖液(50mMTris/HClpH7.5、500mMNaCl、5mMMgCl2)中平衡。10μ1各自預(yù)處理的基質(zhì)隨后用于結(jié)合出自600μ1大腸桿菌溶解產(chǎn)物中的Hisici-MBP-GFP融合物(10μM濃度)。用75μ1的IM咪唑/HClρΗ7.5洗脫結(jié)合的級份。隨后通過SDS-PAGE分析1μ1每種洗脫物，隨后為考馬斯-染色。結(jié)果顯示于圖4Α中。本發(fā)明的Ni2+-EDTA-酰胺硅膠基質(zhì)針對所有測試的螯合劑溶液完全有抗性。對比基質(zhì)是顯著較小抗性的。M2+-NTA-瓊脂糖被任何螯合劑處理卸載。Ni2+-NTA-酰胺硅膠基質(zhì)被IOmMEDTA和40mMNTA完全卸載，但在用EGTA處理后保留少量活性。在IOOmMTris/HClpH7.5中平衡來自圖4A中顯示的小圖的經(jīng)螯合劑洗滌的基質(zhì)，與等體積的二甲基乙二肟(在乙醇中溶解)混合，并且在獲取照片前，在60°C溫育15分鐘，并且隨后ο/η在室溫下。結(jié)果顯示于圖4Β中。未處理的Ni2+-NTA-酰胺硅膠和未處理的Ni2+-NTA瓊脂糖出現(xiàn)代表松散結(jié)合的Ni2+的粉紅色二甲基乙二肟-Ni2+沉淀物，但本發(fā)明的Ni2+-EDTA-酰胺硅膠未出現(xiàn)。用上述螯合劑預(yù)洗滌Ni2+-NTA-酰胺硅膠或Ni2+-NTA瓊脂糖去除松散結(jié)合的M2+的程度相同于結(jié)合組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)的能力的減少。因此，與對比NTA基質(zhì)對比，Ni2+離子與本發(fā)明的EDTA-酰胺基質(zhì)的結(jié)合顯著更強。實施例8=Ni-螯合劑基質(zhì)針對含硫醇還原劑的抗性。測試了各種含Ni2+螯合劑基質(zhì)針對二硫蘇糖醇(DTT)，含硫醇還原劑的抗性。NTA-瓊脂糖(Qiagen)、NTA-酰胺硅膠和EDTA-酰胺硅膠未處理或在室溫下用IMDTT溫育ο/η，用IMTris/HClpH7.5緩沖。結(jié)果顯示于圖5A中。DTT處理使來自NTA-瓊脂糖(Qiagen)和NTA-酰胺硅膠的Ni2+轉(zhuǎn)化成呈褐色的反應(yīng)產(chǎn)物。相比之下，Ni2+EDTA-酰胺硅膠保持完全不受影響。使上述基質(zhì)(50μ1)重懸浮于ImlIMTris/HClpH7.5或IMTris/HClpH7.5+1MDTT中。5分鐘后，加入Hisltl-標(biāo)記的紅色熒光蛋白，并且使該結(jié)合反應(yīng)在室溫下旋轉(zhuǎn)ο/η。通過重力允許基質(zhì)沉降，并且獲取照片。結(jié)果顯示于圖5Β(上圖)中。在珠上的紅色指示his-標(biāo)記的蛋白質(zhì)的結(jié)合。在不存在DTT的情況下，所有基質(zhì)非常良好地結(jié)合his-標(biāo)記的蛋白質(zhì)。DTT-處理完全取消與Ni2+NTA瓊脂糖(Qiagen)和Ni2+NTA-酰胺硅膠的結(jié)合。未結(jié)合的級份包含從珠中釋放的M2+的呈褐色的反應(yīng)產(chǎn)物。相比之下，His-標(biāo)記的紅色熒光蛋白與本發(fā)明的Ni2+EDTA酰胺硅膠的結(jié)合通過DTT處理保持不受影響。用IM咪唑PH7.3洗脫結(jié)合的級份，并且通過SDS-PAGE隨后考馬斯染色進行分析。結(jié)果顯示于圖5B(下圖)中。分析證實IMDTT完全取消his標(biāo)記的蛋白質(zhì)與Ni2+NTA-瓊脂糖或Ni2+NTA-酰胺硅膠的結(jié)合，同時與本發(fā)明的Ni2+EDTA-酰胺硅膠的結(jié)合完全不受影響。實施例9間隔的多組氨酸標(biāo)記的表征用各種組氨酸標(biāo)記進行標(biāo)記的DHFR衍生物的混合物與Ni2+EDTA酰胺硅膠結(jié)合，并且用增加咪唑濃度的梯度緩慢洗脫。結(jié)果顯示于圖6A中。(實際濃度在泳道上給出)。小圖顯示通過SDS-PAGE/考馬斯染色的洗脫級份分析。具有較大數(shù)目的組氨酸的標(biāo)記賦予與基質(zhì)的更緊密的結(jié)合，在較高咪唑濃度下的洗脫，并且因此與并非多組氨酸標(biāo)記的污染物的更好地分離。使用了下述標(biāo)記(氨基酸以單字母編碼)MRGS6=MRGSHHHHHH(SEQIDNO1)HlO=MHHHHHHHHHH(SEQIDNO2)間隔H14=MSKHHHHSGHHHTGHHHHSGSHHH(SEQIDNO3)間隔H21=MSKHHHHSGHHHTGHHHHSGSHHHTGHHHHSGSHHH(SEQIDNO4)間隔H28=MSKHHHHSGHHHTGHHHHSGSHHHTGHHHHSGSHHHTGHHHHSGSHHH(SEQIDNO5)盡管具有較多組氨酸的His-標(biāo)記賦予與M-螯合物基質(zhì)的更特異性結(jié)合，但它們具有太多組氨酸的連續(xù)串妥協(xié)了在大腸桿菌中的表達水平和溶解性的問題。用含Gly、Ser和/或Thre間隔物中斷連續(xù)多組氨酸串糾正了這些問題。在顯示的代表性實施例中，與常規(guī)、連續(xù)Hisltl標(biāo)記對比，用間隔His14標(biāo)記來標(biāo)記DHFR使在大腸桿菌中的重組表達過程中的可溶性蛋白質(zhì)產(chǎn)率加倍(圖6B)。權(quán)利要求具有6個或更多配位基團的固定螯合劑用于固定金屬離子色譜法(IMAC)的用途。2.權(quán)利要求1的用途，其中所述固定螯合劑是具有6個或更多配位基團的多羧酸酰胺或酯，所述配位基團特別選自氨基、羧基、甲酰胺和氧肟酸鹽基團。3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述固定螯合劑是具有式(Ia)或(Ib)結(jié)構(gòu)的具有被固定的多羧酸的固相<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中SP是固相；R1是不干擾所述固相應(yīng)用的氫或有機殘基和PCA是多羧酸特別是氨基多羧酸殘基，或其鹽。4.權(quán)利要求2或3的用途，其中所述多羧酸選自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙(2-氨基乙醚)-N，N，N',N'-四乙酸(EGTA)、二乙烯三胺五乙酸(DPTA)和三乙烯四胺-N，N,N',N'，N"，N〃-六乙酸(TTHA)，特別選自EDTA或其鹽。5.權(quán)利要求3或4的用途，其中所述固相具有式(II)結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中SP是固相，和其中一個或多個所述羧酸基團可以是去質(zhì)子化的。6.權(quán)利要求1-5中任一項的用途，其中所述螯合劑與金屬離子例如過渡金屬離子如Ni2+離子絡(luò)合。7.用于使具有6個或更多配位基團的多羧酸與固相結(jié)合的方法，其包括步驟(a)提供多羧酸和包括氨基基團的固相，(b)在縮合劑的存在下使所述氨基基團與所述多羧酸反應(yīng)，其中所述縮合劑以超過所述氨基基團的摩爾過量存在，并且所述多羧酸以超過所述縮合劑和氨基基團的摩爾過量存在，并且其中所述多羧酸的單個羧基與所述氨基基團反應(yīng)。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述多羧酸是氨基多羧酸，特別選自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙(2-氨基乙醚)-N，N,N',N'-四乙酸(EGTA)、二乙烯三胺五乙酸(DPTA)和三乙烯四胺-N，N，N',N'，N"，N"-六乙酸(TTHA)。9.權(quán)利要求7-8中任一項的方法，其中所述固相是氨基官能化的色譜法載體，特別選自氨基官能化碳水化合物，例如瓊脂糖、瓊脂糖凝膠或纖維素，金屬或半金屬例如硅，或金屬氧化物或半金屬氧化物例如硅膠、玻璃、塑料例如聚苯乙烯，或脂質(zhì)例如磷脂。10.權(quán)利要求7-9中任一項的方法，其中所述固相包括顆粒，例如囊泡、磁珠、量子點、蛋白質(zhì)或具有多個伯胺或仲胺基團的分子。11.權(quán)利要求7-10中任一項的方法，其中在所述固相上的所述氨基是伯胺或仲胺基團，例如脂族伯胺基團。12.權(quán)利要求7-11中任一項的方法，其中所述縮合劑選自碳化二亞胺，例如1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳化二亞胺(EDC)或N，N'-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)。13.權(quán)利要求7-12中任一項的方法，其中所述縮合劑超過所述氨基基團的摩爾過量是至少2倍、優(yōu)選至少4倍，和/或所述多羧酸超過所述氨基基團的摩爾過量是至少5倍、優(yōu)選至少25倍。14.具有式(Ia)或(Ib)結(jié)構(gòu)的固相，其具有被固定的多羧酸<image>imageseeoriginaldocumentpage3</image>其中SP是固相；R1是不干擾固相應(yīng)用的氫或有機殘基，和PCA是多羧酸特別是氨基多羧酸殘基，或其鹽，其中所述固定的多羧酸酰胺或酯具有至少6個或更多配位基團，所述配位基團特別選自氨基、羧基、甲酰胺和氧肟酸鹽基團，并且其中所述固相的表面優(yōu)選基本上不含可觸及的氨基和/或羥基基團，其中所述固相表面上例如>90%、優(yōu)選>95%和更優(yōu)選>99%的可觸及的氨基和/或羥基基團被阻斷。15.權(quán)利要求14的固相，其中PCA是EDTA的殘基或其鹽。16.權(quán)利要求14或15的固相，其具有式(II)結(jié)構(gòu)<image>imageseeoriginaldocumentpage3</image>其中SP是固相，并且一個或多個所述羧酸基團可以是去質(zhì)子化的。17.權(quán)利要求14-16中任一項的固相，其中所述多羧酸殘基與金屬離子例如過渡金屬離子如M2+離子絡(luò)合，并且其中優(yōu)選已去除基本上所有松散結(jié)合的金屬離子。18.權(quán)利要求17的固相，其在含硫醇或二硫醇的還原劑的存在下是穩(wěn)定的。19.純化重組多肽的方法，其包括步驟(a)提供包括具有多個組氨酸殘基的多肽的樣品，(b)使所述樣品與權(quán)利要求14-17中任一項的固相接觸，所述固相包含預(yù)先結(jié)合的絡(luò)合金屬離子例如M2+離子，條件是其中所述重組多肽與所述固相選擇性結(jié)合，(C)使所述結(jié)合的重組多肽與其他樣品組分分離，和(d)從所述固相中洗脫所述重組多肽。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述多肽包括至少6個連續(xù)組氨酸殘基。21.權(quán)利要求18的方法，其中所述多肽包括在序列[HnSJk中的至少4個組氨酸殘基，其中H是組氨酸殘基，并且S是選自甘氨酸和/或絲氨酸和/或蘇氨酸的間隔物氨基酸殘基，η在每種情況下獨立地是1-4，m在每種情況下獨立地是1-6，并且k是2-6。22.重組多肽，其包括在序列[HnSJk中的至少4個組氨酸殘基，其中H是組氨酸殘基，并且S是選自甘氨酸和/或絲氨酸和/或蘇氨酸的間隔物氨基酸殘基，η在每種情況下獨立地是1-4，m在每種情況下獨立地是1-6，并且k是2-8。23.權(quán)利要求21的多肽，其中所述多組氨酸序列在所述標(biāo)記蛋白質(zhì)的N和/或C末端處，或插入所述標(biāo)記蛋白質(zhì)的序列內(nèi)。全文摘要本發(fā)明涉及用于將多羧酸結(jié)合到固相上的方法。此外，本發(fā)明涉及具有與之固定的多羧酸的固相和使用固相例如用于純化His-標(biāo)記的重組多肽的方法。文檔編號B01J20/32GK101808731SQ200880105756公開日2010年8月18日申請日期2008年8月6日優(yōu)先權(quán)日2007年8月6日發(fā)明者D·格利希,S·弗賴申請人:馬普科技促進協(xié)會