專利名稱：四配位體金屬螯合層析填料乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白純化領(lǐng)域，特別地，本發(fā)明涉及金屬螯合層析填料制備方法。
背景技術(shù)：
金屬螯合層析，也稱固定化金屬親和層析是利用金屬離子與蛋白質(zhì)相互作用，特 別是過渡金屬離子如鎳，銅，鐵，鋅等的離子和蛋白質(zhì)中特定氨基酸如色氨酸組氨酸半胱氨 酸之間的螯合配位作用使蛋白質(zhì)被金屬螯合層析介質(zhì)吸附從而達(dá)到選擇分離純化蛋白質(zhì) 的目的，目前此技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于帶6組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)(6xHiS-tag Protein)純化， 以及其它含有豐富色氨酸組氨酸半胱氨酸的蛋白質(zhì)純化。其中NTA瓊脂糖應(yīng)用最為廣泛。金屬螯合層析填料分兩大部分，1。填料基質(zhì)主要有瓊脂糖凝膠，葡聚糖凝膠等作 為載體，2。填料金屬螯合分子目前在蛋白純化中廣泛應(yīng)用的亞氨基二乙酸(IDA瓊脂糖)， 次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖)，通過化學(xué)方法使金屬螯合分子與填料基質(zhì)結(jié)合形 成金屬螯合層析填料。亞氨基二乙酸(IDA)的螯合配位特點是兩個酸基和一個氮原子(提 供一個電子對供螯合)與配位金屬離子螯合形成三個配位體。次甲基三乙酸(NTA)的螯合 配位特點是三個酸基和一個氮原子形成四個配位體(三個酸帶有三個負(fù)電荷)與配位金屬 離子螯合。本發(fā)明乙二胺二乙酸瓊脂糖是全新螯合配位物體，特點是乙二胺二乙酸瓊脂糖凝 膠中的乙二胺二乙酸可以提供二個酸基和二個氮原子形成四個配位體(二個酸帶有二個 負(fù)電荷)與配位過渡金屬離子Ni，Cu, Mn, Co, Si等作用時可以形成一個四配位鰲合中心。 本發(fā)明乙二胺二乙酸瓊脂糖與現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖)同 為四配位金屬鰲合物，但由于配位原子不同和所帶負(fù)電荷量不同故與蛋白質(zhì)結(jié)合能力特點 也有不同，本發(fā)明乙二胺二乙酸瓊脂糖為蛋白質(zhì)純化提供了新的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明乙二胺二乙酸瓊脂糖是新型金屬螯合層析填料，為蛋白質(zhì)純化提供了新的 層析填料選擇，乙二胺二乙酸瓊脂糖凝(EDDA瓊脂糖凝膠)制備包括下列步驟乙二胺二乙酸制備1)在5_20°C控制溫度下，制備乙二胺10-80%水溶液，然后往10-80%乙二胺水溶 液定量慢慢加入溴乙酸(BrCH2COOH)，攪拌均勻制備成乙二胺與溴乙酸水溶液，乙二胺與溴 乙酸摩爾濃度準(zhǔn)確控制在1 2，溴乙酸摩爾濃度準(zhǔn)確控制非常重要。乙二胺與溴乙酸的化 學(xué)反應(yīng)式為NH2-CH2-CH2-NH2+2BrCH2C00H —NH (CH2COOH) -CH2-CH2-N (CH2COOH) +2Br2)慢慢調(diào)節(jié)乙二胺與溴乙酸混合水溶液PH值至9-11，攪拌，控溫，使乙二胺與入 溴乙酸反應(yīng)生成乙二胺二乙酸，乙二胺與溴乙酸混合水溶液在堿性條件下反應(yīng)激烈，整個3反應(yīng)應(yīng)當(dāng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。反應(yīng)完全后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮結(jié)晶。3)反應(yīng)檢測和除去雜質(zhì)，薄膜層析(TLC)和茚三酮(茚三酮Ninhydrin是靈敏 的氨基顯色試劑)可以作為檢測方法，反應(yīng)副產(chǎn)物溴可以化學(xué)方法除去，例如加硝酸銀，沉 淀，過濾。乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠制備方法，包括以下步驟1)制備環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠，將購自Novelab. com公司的瓊脂糖CL-4B凝膠放在 沙芯漏斗吸干后放入燒杯內(nèi)，加入2M氫氧化鈉，加入環(huán)氧氯丙烷，混合后在恒溫攪拌器上 攪拌加熱保持溫度在45-70°C兩個小時，然后添加環(huán)氧氯丙烷保持溫度在45-70°C三個小 時，然后將反應(yīng)物放入沙芯漏斗吸干。此吸干反應(yīng)物是環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠?；脤⒁叶范宜峤颖鄣江傊荂L-4B凝膠上，將2-3M碳酸鈉溶液加入吸干反應(yīng) 物是環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠中，然后加入乙二胺二乙酸溶液，混合后在恒溫攪拌器上攪拌加 熱保持溫度在45-70°C十五個小時，然后將混合物放在沙芯漏斗吸干，此吸干混合物即為乙 二胺二乙酸瓊脂糖凝，可放在30%乙醇溶液4度下保存。3)加載過渡金屬離子，用PH= 7. 3緩沖溶液洗去乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠上的乙 醇溶液，然后用300mM金屬離子浸泡，再升用pH = 7. 3緩沖溶液洗滌。乙二胺二乙酸瓊脂糖凝的使用范圍主要是用于蛋白質(zhì)提純。1)乙二胺二乙酸與EDTA(乙二胺四乙酸)結(jié)構(gòu)相似差二個乙酸結(jié)構(gòu)，故金屬螯合 力強但比EDTA弱，乙二胺二乙酸能提供二個酸基和二個配位氮原子對進(jìn)行金屬螯合，乙二 胺二乙酸瓊脂糖凝膠作為固相強力金屬螯合合劑。2)乙二胺二乙酸瓊脂糖凝比目前廣泛應(yīng)用的次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂 糖凝膠)與金屬離子作用略有不同，次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠提供三乙酸和一個氮原子與 金屬螯合，乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠提供二乙酸和二個氮原子與金屬螯合，乙二胺二乙酸 瓊脂糖凝膠提供不同的金屬螯合手段供蛋白純化。本發(fā)明采用膠聯(lián)結(jié)構(gòu)的4%瓊脂糖CL-4B為基質(zhì)是從Novelab. com公司購得。環(huán) 氧活化瓊脂糖，次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖凝膠)和其它原料也是從Novelab. com公司購得。應(yīng)用實例結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但以下僅是本發(fā)明的較佳實施實 例，本發(fā)明內(nèi)容不受下列較佳實例的限制。實例一一，制備乙二胺二乙酸取6. 01克乙二胺放入500毫升燒杯內(nèi)，然后慢慢加入50 毫升水，充分溶解，制備成乙二胺水溶液，再取27. 8克溴乙酸放入500毫升燒杯內(nèi)，慢慢加 入100毫升的水，制備成溴乙酸水溶液，將盛有乙二胺水溶液的燒杯保持在4°C冰水中降 溫，然后將溴乙酸水溶液慢慢加入乙二胺水溶液，邊加入邊攪拌，形成乙二胺溴乙酸混合水 溶液。用2摩爾濃度的氫氧化鈉調(diào)整到pH值到9. 5。將2摩爾濃度的氫氧化鈉溶液滴入乙 二胺溴乙酸混合水溶液直至PH = 9. 5，氫氧化鈉溶液滴入速度要慢以免反應(yīng)過熱(此反應(yīng) 應(yīng)當(dāng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，操作人員要帶護目鏡)。將PH = 9. 5乙二胺溴乙酸反應(yīng)混合液慢慢加 熱到50°C兩個小時，然后冷卻到室溫，此時乙二胺已經(jīng)與溴乙酸反應(yīng)生成乙二胺二乙酸水 溶液。二，取購自 Novelab. com公司環(huán)氧活化瓊月旨糖(Epoxy-activated Agarose,Novelab.com)，20克，加入100毫升的2M碳酸鈉水溶液潤濕形成環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠，然后將乙二胺 二乙酸水溶液加入到環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠，恒溫50°C，緩慢攪拌20小時，攪拌后，將反應(yīng)產(chǎn) 物轉(zhuǎn)移到沙芯漏斗，用真空泵抽干，依次用1000蒸餾水，5% 500醋酸，蒸餾水1000毫升洗 至中性，此即為制備好的乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠，可在30%乙醇溶液中在4°C保存。實例二取購自Novelab. com公司的CL-4B瓊脂糖100毫升在沙芯漏斗吸干，稱50克吸干 的CL-4B瓊脂糖放入500毫升的燒杯內(nèi)，加入2M氫氧化鈉100毫升，環(huán)氧氯丙烷10毫升， 混合后在恒溫攪拌器上攪拌加熱保持溫度在45°C，一個小時，然后添加10毫升環(huán)氧氯丙烷 保持溫度在45C，半個小時，然后將反應(yīng)物放入沙芯漏斗吸干，再將環(huán)氧活化CL-4B瓊脂糖 轉(zhuǎn)移到500毫升的燒杯內(nèi)，加入3M碳酸鈉100毫升，加入按實例一制備的乙二胺二乙酸混 合后在恒溫攪拌器上攪拌加熱保持溫度在55°C，15個小時，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到沙芯漏斗， 用真空泵抽干，依次用1000蒸餾水，5% 500醋酸，蒸餾水1000毫升洗至中性，此即為制備好的乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠，可在30%乙醇溶液 中在4°C保存。實例三二胺二乙酸瓊脂糖凝膠加載Ni，Cu和Ag離子，加載Ni離子取制備好的乙二胺二 乙酸瓊脂糖凝膠10毫升，轉(zhuǎn)移至層析柱內(nèi)，用pH7. 3緩沖溶液洗去乙二胺二乙酸瓊脂糖凝 膠上的乙醇溶液，然后用100毫升，300mM硫酸Ni浸泡，300毫升用pH7. 3緩沖溶液洗，此為 Ni 二胺二乙酸瓊脂糖凝膠。加載Cu離子取制備好的乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠10毫升，轉(zhuǎn) 移至層析柱內(nèi)，用PH = 7. 3緩沖溶液洗去乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠上的乙醇溶液，然后用 100毫升，300mM硫酸Cu浸泡，300毫升用pH = 7. 3緩沖溶液洗，此為Cu 二胺二乙酸瓊脂糖 凝膠。加載Ag離子取制備好的乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠10毫升，轉(zhuǎn)移至層析柱內(nèi)，用pH =7. 3緩沖溶液洗去乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠上的乙醇溶液，然后用100毫升，300mM硝酸 Ag浸泡，300毫升用pH = 7. 3緩沖溶液洗，此為Ag 二胺二乙酸瓊脂糖凝膠。參考文獻(xiàn)CN 100389325C 1997. 11. 5CN 1163902A 2002. 5. 10CN1100568C 2001. 1. 17蛋白質(zhì)分離色譜填料及特性，曾慶冰，功能高分子學(xué)報，第13卷第3期，2000Qiagen Product Guilde 2007, (NTA Agarose, page 272)Michele C. Smith etc. Immobilized Iminodiacetic Acid MetalComplexes, Identification of Chelating Peptide PurificationHandles for Recombinant Proteins, Inorg. Chem. 1987,26, 1965-1969。
權(quán)利要求
1.乙二胺二乙酸快速制備方法，包括以下步驟1)在控制溫度下，往乙二胺10-80%水溶液中定量慢慢加入溴乙酸(BrCH2COOH)，乙二 胺與溴乙酸摩爾濃度準(zhǔn)確控制在1 2，溴乙酸摩爾濃度準(zhǔn)確控制非常重要，應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確的控 制在1摩爾乙二胺與2摩爾溴乙酸的比例。2)慢慢加入30%碳酸鈉或其他堿溶液調(diào)節(jié)pH值至大約9以上，攪拌，控溫，使乙二胺 與入溴乙酸反應(yīng)完全生成乙二胺二乙酸，乙二胺與溴乙酸化學(xué)反應(yīng)式為NH2-CH2-CH2-NH2+2BrCH2C00H — NH (CH2COOH) -CH2-CH2-N (CH2COOH) +2Br3)副產(chǎn)物溴可以用物理或化學(xué)方法除去。例如，加硝酸銀沉淀，過濾。
2.乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠制備方法，包括以下步驟1)首先將瓊脂糖凝膠環(huán)氧活化，向瓊脂糖凝膠加入2M的氫氧化鈉和環(huán)氧氯丙烷，混 合，在30-70°C溫度下恒溫2-9小時，生成環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠。2)乙二胺二乙酸與瓊脂糖凝膠偶聯(lián)的具體方法是，先將環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠吸干， 然后加2M碳酸鈉溶液，再加適量的乙二胺二乙酸，在50-70°C溫度下恒溫5-15小時生成乙 二胺二乙酸瓊脂糖凝。3)加載過渡金屬離子，將乙二胺二乙酸瓊脂糖凝用稀醋酸和去離子水洗滌，然后用稀 硫酸鎳，或稀硫酸銅或其它過渡金屬鹽溶液浸泡，然后用pH = 7. 5的緩沖溶液沖洗，可以得 到不同的加載過渡金屬離子的乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠。
3.本發(fā)明乙二胺二乙酸瓊脂糖凝是四配體金屬螯材料，用于純化組胺酸標(biāo)記(His Tag)的蛋白質(zhì)和含組胺酸，賴氨酸豐富的蛋白質(zhì)。1)乙二胺二乙酸與EDTA(乙二胺四乙酸)的結(jié)構(gòu)相似但相差二個乙酸結(jié)構(gòu).乙二胺二 乙酸比金屬螯合力極強的EDTA的金屬鰲合力弱，乙二胺二乙酸是四配體金屬螯合材料具 有一定的金屬螯合性同時螯合上的金屬也可以在特定的條件下被洗脫.乙二胺二乙酸可 以提供二個酸基和由兩個氮原子提供兩個配位孤電子對進(jìn)行金屬螯合，本發(fā)明乙二胺二乙 酸瓊脂糖凝膠可以形成穩(wěn)定固相金屬鰲合基質(zhì)從而能夠與蛋白質(zhì)中的組胺酸，賴氨酸半胱 氨酸等形成強烈的鰲合作用。2)在純化蛋白中的應(yīng)用，目前廣泛應(yīng)用的次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖凝膠) 和亞胺基二乙酸瓊脂糖凝膠(IDA瓊脂糖凝膠)廣泛用于蛋白質(zhì)提純[1，2，3]，本發(fā)明乙二 胺二乙酸瓊脂糖凝膠與次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖凝膠)在用于蛋白純化時基 本作用原理一致，但配位體不同，IDA瓊脂糖凝膠提供一個氮原子和乙二酸根作為三配位體 金屬鰲合基質(zhì)，NTA瓊脂糖凝膠提供一個氮原子核三酸根作為四配位體金屬鰲合基質(zhì)，本發(fā) 明乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠提供二個氮原子和二酸根作為四配位體金屬鰲合基質(zhì)，故在蛋 白質(zhì)提純過程中可以展現(xiàn)出新的特異性，從而給蛋白質(zhì)純化工作提供了新的金屬螯合層析 填料選擇。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種金屬螯合層析填料制備方法，是通過4％-6％瓊脂糖凝膠和乙二胺二乙酸結(jié)合而成乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠(Ethylenediamine diacetic acid，EDDA瓊脂糖凝膠)。本發(fā)明首先提供了快速簡單制備乙二胺二乙酸方法，進(jìn)一步提供了乙二胺二乙酸與瓊脂糖凝膠結(jié)合的方法。乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠作為金屬螯合層析填料對過渡金屬有特強的金屬螯合性，能夠與過渡金屬離子強烈結(jié)合，特別適用于以過渡金屬為螯合物的蛋白質(zhì)提純。目前次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖凝膠)被廣泛用于蛋白質(zhì)提純，本發(fā)明乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠與次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖凝膠)一樣是四配體金屬螯材料，但是本發(fā)明的配位體的原子與NTA瓊脂糖凝膠不同，本發(fā)明比NTA瓊脂糖凝膠多出一個氮原子而少一個乙酸根參加金屬鰲合，故在蛋白質(zhì)提純過程中可以展現(xiàn)出新的特異性，從而給蛋白質(zhì)純化提供了新的金屬螯合層析填料選擇。
文檔編號C07C227/08GK102040674SQ200910196910
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月9日
發(fā)明者宛薇, 馬涌 申請人:宛薇, 馬涌