專利名稱：一種固載了敵草隆抗體免疫分離材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物材料，具體地說(shuō)是一種固載了敵草隆抗體的免疫分離材料的制備方法。
背景技術(shù)：
敵草隆是一種廣譜性的苯脲類除草劑。除農(nóng)田外，還廣泛用于除去城市公路和鐵路的雜草，以及作為船用防藻涂料的添加劑(Chemosphere，2004，56，1021-1032)。研究已表明其對(duì)水生動(dòng)物有毒性，對(duì)人類有致癌性，因此敵草隆被美國(guó)EPA列為“潛在污染物”(the Candidation CompoundList)(Anal.Chem.2003，75，2831-2857)，被European Communication列為“首要污染物”(Priority Substances)(Off.J.Eur.Commun.2000，L327，1)。由于其化學(xué)降解和生物降解較慢，在農(nóng)作物、土壤及各種環(huán)境水中均有痕量的殘留。因此需要具有高選擇性地富集分離材料對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，才能滿足分析要求。
將目標(biāo)化合物的抗體固載后制成的免疫分離材料，利用抗原抗體之間的特異反應(yīng)，能從樣品中選擇性地將目標(biāo)化合物提取出來(lái)，從而完成痕量化合物的選擇性富集(Anal.Chem.2001，73，5669-5676.)。目前還沒(méi)有文獻(xiàn)關(guān)于固載了敵草隆抗體的免疫吸附材料的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡(jiǎn)單的固載了敵草隆抗體免疫分離材料的制備方法。該材料的制備條件溫和，操作簡(jiǎn)便，對(duì)敵草隆具有高選擇性和高親和性。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種固載了敵草隆抗體免疫分離材料的制備方法，采用溶膠凝膠法將敵草隆抗體固載在多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的硅膠基質(zhì)中。
溶膠凝膠過(guò)程中，以四甲基硅氧烷或四乙基硅氧烷做為溶膠凝膠的前驅(qū)體，交聯(lián)劑為甘油或聚乙二醇(PEG)系列高聚物，四甲基硅氧烷或四乙基硅氧烷與水的體積比為10∶1-1∶10，四甲基硅氧烷與交聯(lián)劑的體積比為200∶1-50∶1。
溶膠過(guò)程中，進(jìn)行超聲或加入助溶劑促進(jìn)溶膠的形成，助溶劑為甲醇或乙醇，甲醇或乙醇與四甲基硅氧烷或四乙基硅氧烷的體積比不大于1∶10；以鹽酸為催化劑，調(diào)溶液PH＝1-6.5；溶膠過(guò)程中，若使用超聲，反應(yīng)時(shí)間為10-60min，若加入助溶劑，反應(yīng)時(shí)間5-30min。
凝膠過(guò)程中，混合反應(yīng)后，冷卻，加入PBS緩沖溶液，調(diào)溶液PH＝7-8，隨即加入抗體溶液，振蕩，形成凝膠；抗體的加入量從20微克到5毫克不等。
所述固載的抗體為抗敵草隆單克隆、多克隆抗體或抗體片段。所制備的免疫材料經(jīng)研磨，裝于玻璃柱，在水中對(duì)敵草隆具有高的親和性和選擇性。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.材料制備過(guò)程簡(jiǎn)單，工藝路線短，制備安全，操作易掌握。
2.免疫分離材料對(duì)敵草隆和草不隆具有高親和性和高選擇性，為選擇性富集樣品中敵草隆和草不隆提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
3.固載的抗體為單克隆抗體，對(duì)敵草隆的結(jié)合力不受抗體生產(chǎn)批次的影響，因此所制的免疫分離材料具有很好的批次穩(wěn)定性。


圖1為免疫分離材料對(duì)敵草隆的選擇性。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例向盛有850微升四甲基硅氧烷的5毫升玻璃試管中分別加入50微升甲醇、150微升50％甘油水溶液(v/v)、125微升水和50微升0.04摩爾/升鹽酸水溶液?；旌先芤簻u旋震蕩20分鐘，間或置于冰水浴中冷卻；取0.5毫升上述溶膠，加入等體積PBS，隨即加入78.9微升(300微克)抗體溶液，輕微振蕩，凝膠在2分鐘內(nèi)形成；將稱重后的凝膠靜置于4℃空氣中。當(dāng)其失重至55％，研磨，即得到對(duì)敵草隆和草不隆具有高親和性和高選擇的免疫分離材料。
上例中四甲基硅氧烷和水的摩爾比為1∶2.4，催化劑鹽酸摩爾用量為四甲基硅氧烷的1％。
所制備的免疫分離材料對(duì)敵草隆的親和性和選擇性評(píng)價(jià)將研磨后的聚合物微粒(大約0.4克)裝于玻璃柱中(5毫升)，對(duì)25毫升含有65種農(nóng)藥(每個(gè)農(nóng)藥50納克)的混合水樣進(jìn)行濃縮富集，洗脫液中的各農(nóng)藥含量由LC-MS確定，各化合物的回收率為洗脫液中的含量與上樣量(50納克)的比值。
對(duì)圖1的說(shuō)明該圖縱坐標(biāo)為化合物的回收率(％)，橫坐標(biāo)為化合物，除敵草隆(diuron)、草不隆(neburon)、利谷隆(liuron)，其他化合物的非極性逐漸增強(qiáng)。圖示中為回收率小于1％或在質(zhì)譜中沒(méi)有檢測(cè)到的化合物的名稱。該圖說(shuō)明敵草隆(diuron)的回收率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他化合物，從而證明了該溶膠凝膠免疫親和柱可以用于選擇性富集樣品中的敵草隆。
權(quán)利要求
1.一種固載了敵草隆抗體免疫分離材料的制備方法，其特征在于采用溶膠凝膠法將敵草隆抗體固載在多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的硅膠基質(zhì)中。
2.按照權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于溶膠凝膠過(guò)程中，以四甲基硅氧烷或四乙基硅氧烷做為溶膠凝膠的前驅(qū)體，交聯(lián)劑為甘油或聚乙二醇(PEG)系列高聚物，四甲基硅氧烷或四乙基硅氧烷與水的體積比為10∶1-1∶10，四甲基硅氧烷與交聯(lián)劑的體積比為200∶1-50∶1。
3.按照權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于溶膠過(guò)程中，進(jìn)行超聲或加入助溶劑促進(jìn)溶膠的形成，助溶劑為甲醇或乙醇，甲醇或乙醇與四甲基硅氧烷或四乙基硅氧烷的體積比不大于1∶10。
4.按照權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于溶膠過(guò)程中，以鹽酸為催化劑，調(diào)溶液PH＝1-6.5。
5.按照權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于溶膠過(guò)程中，若使用超聲，反應(yīng)時(shí)間為10-60min，若加入助溶劑，反應(yīng)時(shí)間5-30min。
6.按照權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于凝膠過(guò)程中，混合反應(yīng)后，冷卻，加入PBS緩沖溶液，調(diào)溶液PH＝7-8，隨即加入抗體溶液，振蕩，形成凝膠；抗體的加入量從20微克到5毫克不等。
7.按照權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于所述固載的抗體為抗敵草隆單克隆、多克隆抗體或抗體片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種固載了敵草隆抗體的免疫分離材料，其采用溶膠凝膠法將敵草隆抗體固載在多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的硅膠基質(zhì)中。該材料的制備條件溫和，操作簡(jiǎn)便，對(duì)敵草隆具有高選擇性和高親和性。
文檔編號(hào)B01J20/291GK101036875SQ20061004605
公開(kāi)日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2006年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日
發(fā)明者張秀莉, 章飛芳, 薛興亞, 徐青, 梁鑫淼 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所