專利名稱：用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的免疫抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)藥殘留免疫檢測(cè)的免疫抗體及其應(yīng)用，尤其是一種用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的免疫抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
農(nóng)藥是當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)用于防治病、蟲、雜草對(duì)農(nóng)作物危害不可缺少的物質(zhì)，對(duì)促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)有極重要的作用，但同時(shí)帶來嚴(yán)重的環(huán)境問題生態(tài)失衡，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降，人類身體健康受威脅。目前，有機(jī)磷、擬除蟲菊酯農(nóng)藥具有高效的殺蟲效果，是植物化學(xué)保護(hù)的主力軍。隨著近年來環(huán)境保護(hù)的呼聲越來越高，有機(jī)磷類農(nóng)藥使用帶來的環(huán)境問題日益引起人們的重視。
但就目前的形勢(shì)而言，人類仍面臨饑餓，貧窮的困擾，全面禁止農(nóng)藥的使用是不現(xiàn)實(shí)的，為了達(dá)到高產(chǎn)、高效的目標(biāo)，農(nóng)藥的地位在短期內(nèi)是無法取代的。鑒于此，為保障人民的身體健康，有效控制生產(chǎn)中農(nóng)藥的合理使用和對(duì)其殘留量進(jìn)行監(jiān)控，開發(fā)一種快速、可靠、靈敏，適于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控的痕量分析方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前有機(jī)磷類農(nóng)藥的殘留分析方法主要是通過提取、凈化后，再配以高效HPLC或GC，這種檢測(cè)方法費(fèi)用相對(duì)昂貴、樣品前處理過程復(fù)雜、對(duì)儀器設(shè)備要求較高、而且需要消耗大量的有機(jī)溶劑，從而造成對(duì)環(huán)境的二次污染。
免疫分析是一種快速、靈敏、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低的一種檢測(cè)方法。農(nóng)藥多為小分子化合物，需要通過與大分子蛋白類物質(zhì)藕連后才可用于免疫動(dòng)物，刺激動(dòng)物免疫系統(tǒng)來產(chǎn)生針對(duì)小分子農(nóng)藥的抗體。由于大多數(shù)農(nóng)藥本身不具備直接同蛋白類大分子物質(zhì)藕連的位點(diǎn)，因此，通常需要對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行改造，前期研發(fā)費(fèi)用較高。而且，由于抗體通常對(duì)特定物質(zhì)的特異性較強(qiáng)，建立的免疫分析方法多只適用于單一農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)分析，限制了免疫分析方法的應(yīng)用，不能充分發(fā)揮免疫測(cè)定法的快速、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前農(nóng)藥殘留免疫檢測(cè)中存在的抗體通常對(duì)特定物質(zhì)的特異性較強(qiáng)，建立的免疫分析方法多只適用于單一農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)分析，限制了免疫分析方法應(yīng)用的實(shí)際問題，提供一種用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的免疫抗體及其應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的免疫抗體，其特征在于，以二乙基膦酸乙酸為半抗原，通過與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)制備成人工免疫原，并通過免疫新西蘭大白兔制備成多克隆抗體或通過小鼠免疫、細(xì)胞融合、篩選及克隆化培養(yǎng)等過程制成單克隆抗體，所述的人工免疫原可采用活化酯法或水溶性碳二亞胺法制備。
活化酯法制備免疫原是這樣實(shí)現(xiàn)的取等摩爾量的二乙基膦酸乙酸和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，環(huán)二己基碳酰亞胺(DCC)，用二氧六環(huán)將混合物溶解，室溫下避光反應(yīng)過夜，離心去除沉淀后，取上清液干燥，殘留物懸浮在3毫升溶有20mg牛血清蛋白(BSA)的硼酸鹽緩沖液中，混合物在室溫下磁力攪拌1小時(shí)，4℃對(duì)1升pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析，制備成人工免疫原；水溶性碳二亞胺法制備人工免疫原是這樣實(shí)現(xiàn)的先稱取二乙基膦酸乙酸溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，低溫?cái)嚢瑁∷苄蕴级啺?EDC)溶于1mlDMF中，緩慢加入到上述溶液中。另取牛血清蛋白(BSA)20mg溶于2mlDMF中，4℃攪拌，緩慢加入到上述混合液中。繼續(xù)攪拌反應(yīng)8h，再于14℃反應(yīng)過夜，次日2000g離心10min，取沉淀，透析，制備成免疫原。
多克隆抗體的制備方法為以人工合成的免疫原，免疫新西蘭大白兔，用加倍量抗原的生理鹽水稀釋液耳緣靜脈注射，當(dāng)效價(jià)達(dá)最佳時(shí)，心臟采血，先用硫酸銨分步沉淀法初步純化后，再經(jīng)Sephadex G-200進(jìn)一步純化得高質(zhì)量廣譜性抗體。
單克隆抗體的制備方法為以人工合成的免疫原，免疫BALB/C小鼠，每只小鼠取100μg免疫原，與等體積氟氏完全佐劑混合乳化均勻，沿腹股溝注入腹腔膜內(nèi)。4個(gè)周后，加強(qiáng)免疫，劑量不變，佐劑改為氟氏不完全佐劑。加強(qiáng)免疫三次后，采血測(cè)效價(jià)，待血清效價(jià)不再上升時(shí)，用兩倍劑量的抗原不加佐劑免疫小鼠，三天后取脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞按5-10∶1的比例混合于50ml離心管進(jìn)行融合，融合后的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后待孔內(nèi)的雜交細(xì)胞數(shù)量達(dá)到300個(gè)以上時(shí)，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于酶聯(lián)免疫檢測(cè)，每次檢測(cè)均為復(fù)孔檢測(cè)，在每次檢測(cè)后的第二天重復(fù)檢測(cè)，以確證結(jié)果。將強(qiáng)陽性孔內(nèi)的細(xì)胞用有限稀釋法進(jìn)行克隆培養(yǎng)，并跟蹤記錄，經(jīng)過3次以上的克隆培養(yǎng)和檢測(cè)，均為陽性的孔內(nèi)的細(xì)胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后用來制備腹水。提前一周用0.5ml石蠟油注射小鼠腹腔，將106個(gè)雜交瘤細(xì)胞懸浮在1ml無血清培養(yǎng)基中，注入小鼠腹腔內(nèi)。10天后，小鼠腹部明顯膨大，收集腹水。用正辛酸-硫酸銨沉淀法來純化單克隆抗體。
上述抗體在檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于，所述的多克隆抗體或單克隆抗體可用于間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA、直接ELISA或免疫試紙對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥的殘留進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于在比較分析多種有機(jī)磷類農(nóng)藥結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，根據(jù)其共同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的以二乙基膦酸乙酸作為半抗原，所選擇的半抗原具有多種有機(jī)磷類農(nóng)藥的通用結(jié)構(gòu)，而且不需要進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，直接可與蛋白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)后免疫動(dòng)物，所制備的抗體對(duì)毒死蜱、氧樂果、二嗪農(nóng)、乙基對(duì)硫磷、丙溴磷、辛硫磷等多種有機(jī)磷類農(nóng)藥均有特異性，可用于食品，水源中多種有機(jī)磷類農(nóng)藥的篩選檢測(cè)，充分顯示了免疫檢測(cè)技術(shù)的快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。


圖1是采用活化酯法制備的免疫原和包被原；圖2是采用水溶性碳二亞胺法制備的免疫原和包被原。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
實(shí)施例一、活化酯法制備免疫原和包被抗原取等摩爾量(0.1mmol)的二乙基膦酸乙酸(0.0196g)和NHS(0.0109g)，0.11mmol DCC(0.0226g)，加到玻璃管中，用二氧六環(huán)將混合物溶解，室溫下避光反應(yīng)過夜，次日15000g離心10min，去除沉淀，取上清液在35℃真空抽干，把殘留物懸浮在3ml溶有20mg牛血清蛋白(BSA)(用于合成人工免疫原)或卵清蛋白(OVA)(用于合成包被抗原)的硼酸鈉緩沖液中?；旌衔镌谑覝叵麓帕嚢?小時(shí)，4℃對(duì)1LPBS透析過夜(換液4次)。包被抗原為半抗原與卵清蛋白的偶聯(lián)物，制備方法與免疫原相同。透析后的樣品用BACKMAN DU640紫外掃描儀進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描鑒定偶聯(lián)結(jié)果。
圖1a是利用活化酯法制備的BSA-半抗原的偶聯(lián)物(免疫原)，圖1b是利用活化酯法制備的OVA-半抗原的偶聯(lián)物(包被原)。圖1a中三種物質(zhì)由上到下分別是載體蛋白BSA、載體蛋白BSA與半抗原偶聯(lián)物、半抗原的紫外吸收?qǐng)D譜?？梢钥闯鲈?54nm處半抗原有一波谷，載體-抗原偶聯(lián)物也有波谷出現(xiàn)，二者在此處發(fā)生吸收峰的疊加。另外在210nm、238nm處也有明顯的吸收疊加現(xiàn)象。說明二者之間發(fā)生了反應(yīng)，可以推斷半抗原和載體蛋白BSA成功偶聯(lián)。圖1b中三種物質(zhì)由上到下分別是載體蛋白OVA、載體蛋白OVA與半抗原偶聯(lián)物、半抗原的紫外吸收?qǐng)D譜?？梢钥闯鲈?54nm處半抗原有一波谷，載體-抗原偶聯(lián)物也有波谷出現(xiàn)，二者在此處發(fā)生吸收峰的疊加。另外在210nm、238nm處也有明顯的吸收疊加現(xiàn)象。說明二者之間也發(fā)生了反應(yīng)，可以推斷半抗原和載體蛋白OVA成功偶聯(lián)。
實(shí)施例二、水溶性碳二亞胺法制備免疫原和包被抗原稱取二乙基膦酸乙酸0.0392溶于2ml二甲基甲酰胺(DMF)中，低溫?cái)嚢琛Ｔ俜Q取水溶性碳化二亞胺(EDC)8.0mg溶于1ml DMF中，緩慢加入到上述二乙基膦酸乙酸的DMF溶液中。另取BSA(用于合成人工免疫原)或OVA(用于合成人工包被抗原)20mg溶于2ml DMF中，4℃攪拌，緩慢加入到上述混合液中。4℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)8h，再于14℃反應(yīng)過夜，次日2000g離心10min，取沉淀，對(duì)PH7.4的PBS溶液透析3天后的樣品用BACKMAN DU640紫外掃描儀進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描鑒定偶聯(lián)結(jié)果。
圖2a是利用水溶性碳二亞胺法制備的OVA-半抗原的偶聯(lián)物(包被原)，圖2b是利用水溶性碳二亞胺法制備的BSA-半抗原的偶聯(lián)物(免疫原)。圖2a中三種物質(zhì)由上到下分別是載體蛋白OVA、載體蛋白OVA與半抗原偶聯(lián)物、半抗原的紫外吸收?qǐng)D譜?？梢钥闯鲈?54nm處半抗原有一波谷，載體-抗原偶聯(lián)物也有波谷出現(xiàn)，二者在此處發(fā)生吸收峰的疊加。另外在210nm、238nm處也有明顯的吸收疊加現(xiàn)象。說明二者之間發(fā)生了反應(yīng)，可以推斷半抗原和載體蛋白OVA成功偶聯(lián)。圖2b中三種物質(zhì)由上到下分別是載體蛋白BSA、載體蛋白BSA與半抗原偶聯(lián)物、半抗原的紫外吸收?qǐng)D譜?？梢钥闯鲈?54nm處半抗原有一波谷，載體-抗原偶聯(lián)物也有波谷出現(xiàn)，二者在此處發(fā)生吸收峰的疊加。另外在210nm、238nm處也有明顯的吸收疊加現(xiàn)象。說明二者之間也發(fā)生了反應(yīng)，可以推斷半抗原和載體蛋白BSA成功偶聯(lián)。
實(shí)施例三、多克隆抗體制備。
根據(jù)實(shí)施例1或?qū)嵤├?方法制備的兩種免疫原各免疫3只新西蘭大白兔，具體免疫方案如表1。
表1 制備有機(jī)磷多克隆抗抗體動(dòng)物免疫方案

完成表1中免疫程序后，利用方陣滴定法將兩種抗血清分別用兩種包被抗原進(jìn)行檢測(cè)，確定最佳的抗原-抗體組合及其最佳工作濃度，結(jié)果見表2。并利用建立的抗原抗體最佳工作條件來分析不同種類的有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)該抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制作用。以二乙基膦酸乙酸為對(duì)象，建立回歸方程，計(jì)算其I10和I50選取13農(nóng)藥包括乙基對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、樂果、氧樂果、甲胺磷、辛硫磷、毒死蜱、二嗪農(nóng)、丙溴磷、三唑磷、馬拉硫磷、稻豐散、水胺硫磷，將藥劑抑制率對(duì)藥劑濃度進(jìn)行回歸分析，得出回歸方程，并計(jì)算各藥劑對(duì)抗體反應(yīng)的I50值，結(jié)果見表3。
由表2可以看出，用EDC法合成的免疫原免疫動(dòng)物的效果與活性酯法相比較差。活性酯型抗原產(chǎn)生的抗體對(duì)EDC法制備的抗原有微弱的識(shí)別能力；EDC型抗原產(chǎn)生的抗體對(duì)活性酯法制備的包被原沒有任何作用。由活性酯法抗原得到的抗體中，以4310號(hào)兔子分泌抗體效價(jià)最高，為1∶25600，在本文后面的研究中以該抗體為研究對(duì)象。利用4310號(hào)兔子產(chǎn)生的抗體進(jìn)行方陣滴定，所得結(jié)果為抗原、抗體最佳工作濃度均為1∶2000。
表2 抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

以二乙基膦酸乙酸為研究對(duì)象，建立的回歸方程為I＝0.6614+0.229lgC，r＝0.9699，I50＝0.1820μg/ml，I10＝0.003536μg/ml。多種有機(jī)磷藥劑對(duì)抗體的I50經(jīng)計(jì)算示于表3。
表3不同農(nóng)藥對(duì)抗體的抑制能力

從表3可以看出，所得抗體對(duì)多種農(nóng)藥產(chǎn)生了識(shí)別反應(yīng)?？贵w對(duì)抗原先導(dǎo)物二乙基膦酸乙酸有較強(qiáng)的親和力，I50為0.18μg/ml。本方法在樂果和氧樂果之間的選擇性差異較大，二者結(jié)構(gòu)上的差別在于P-O和P-S鍵不同，其余基團(tuán)都相同?？贵w對(duì)氧樂果有較強(qiáng)的親和性，但對(duì)樂果的親和力很弱，由此可以看出在抗原激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的過程中，P＝O鍵起了決定性的作用。但是抗體對(duì)毒死蜱、二嗪農(nóng)、乙基對(duì)硫磷的I50均小于1μg/ml，這3種農(nóng)藥都含有一個(gè)公共的結(jié)構(gòu)(C2H50-)，說明C2H50-也是作為一個(gè)抗原決定簇而存在的，起著非常重要的作用。丙溴磷因?yàn)楹幸粋€(gè)C2H5O--和一個(gè)P＝O，而使抗體對(duì)其有較強(qiáng)的識(shí)別作用，I50為0.97μg/ml。水胺硫磷、馬拉硫磷、甲基對(duì)硫磷等對(duì)抗原-抗體反應(yīng)抑制能力較差，說明抗體對(duì)這些藥劑沒有或只有微弱的識(shí)別能力。從以上的結(jié)果可以看出，在二乙基膦酸乙酸羧基端偶聯(lián)載體蛋白，可以使膦酸基團(tuán)上的C2H5O--和一個(gè)P＝O充分暴露作為抗原決定簇，刺激動(dòng)物產(chǎn)生抗體。
實(shí)施例四、單克隆抗體制備取Balb/C小鼠4只，每只小鼠100μg免疫原，與等體積氟氏完全佐劑混合乳化均勻，沿腹股溝注入腹腔膜內(nèi)。4個(gè)周后，加強(qiáng)免疫，劑量不變，佐劑改為氟氏不完全佐劑。加強(qiáng)免疫5次后，斷尾采血，4只小鼠中有3只血清中抗體滴度達(dá)到1∶25600，有1只達(dá)到1∶51200并不再上升，此時(shí)選取效價(jià)最高的3號(hào)小鼠取脾細(xì)胞做融合。
在無菌操作條件下，將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞按5-10∶1的比例混合于50ml離心管，加入30ml無血清IPMI1640培養(yǎng)基，1200r/min離心10min棄上清，將細(xì)胞團(tuán)輕輕振松，置于37℃水浴中。把1ml 50％PEG 4000緩緩加入細(xì)胞中，在1min內(nèi)滴完，同時(shí)輕輕攪動(dòng)底部沉淀，靜置1min。沿管壁緩慢加入無血清培養(yǎng)液終止融合過程。前30秒緩慢勻速加入1ml，后30秒加入2ml，然后快速加入27ml無血清培養(yǎng)液，1200r/min離心10min，棄上清。用30mlHAT培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，將懸浮液移入預(yù)先培養(yǎng)有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，放置在5％CO2、37.3℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。并同時(shí)把未加融合劑的骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞混合培養(yǎng)以作為陰性對(duì)照。融合3天后，背景開始變得清晰，非融合細(xì)胞破碎死亡，融合的細(xì)胞形成小的細(xì)胞群落。融合7天后，細(xì)胞克隆高度純化。用ELISA方法初步檢測(cè)結(jié)果顯示陽性反應(yīng)的孔占87％，吸光值大于1的強(qiáng)陽性孔占6.7％。將強(qiáng)陽性孔內(nèi)的細(xì)胞經(jīng)過4次克隆，得到1株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞為3C3。將該株細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，植入已注射石蠟油的小鼠體內(nèi)，7天后，有4只小鼠腹部膨大，行動(dòng)困難，1只死亡，1只腹部未產(chǎn)生膨大。
融合后的細(xì)胞先在HAT選擇性培養(yǎng)基中篩選，5天后換成HT培養(yǎng)液，待孔內(nèi)的雜交細(xì)胞數(shù)量達(dá)到300個(gè)以上時(shí)，用間接ELISA對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行復(fù)孔檢測(cè)，次日重復(fù)檢測(cè)以確證結(jié)果。將強(qiáng)陽性孔內(nèi)的細(xì)胞用有限稀釋法進(jìn)行克隆培養(yǎng)，并跟蹤記錄，經(jīng)過3次以上的克隆培養(yǎng)和檢測(cè)，均呈陽性的孔內(nèi)細(xì)胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。將雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，一部分細(xì)胞凍存于液氮罐中，一部分細(xì)胞用來制備腹水。
選取6只經(jīng)產(chǎn)Balb/C小鼠，提前一周用0.5ml石蠟油注射到小鼠腹腔，將大約106個(gè)雜交瘤細(xì)胞懸浮在1ml無血清IPMI1640培養(yǎng)基中，注入小鼠腹腔內(nèi)。10天后，待小鼠腹部明顯膨大時(shí)收集腹水。用正辛酸-硫酸銨沉淀法來純化腹水。用核酸蛋白紫外掃描儀測(cè)定IgG的A278nm/A251nm值，并測(cè)定A278nm的值，根據(jù)所得數(shù)據(jù)初步判斷是否為IgG球蛋白。
腹水抗體經(jīng)純化后，在紫外蛋白分析儀上測(cè)得抗體的A278nm/A251nm的值約為2.5。根據(jù)哺乳動(dòng)物IgG的A278nm/A251nm約為2.5-3.0，而其它蛋白質(zhì)的這個(gè)比值為1-1.5的特點(diǎn)，可以初步判定純化后得到的蛋白為IgG蛋白。
根據(jù)方陣滴定的原則，在抗原稀釋2000倍，濃度為25μg·ml-1，抗體稀釋約4000倍時(shí)，吸光值為1，可以確定抗體最佳工作濃度為4000倍。實(shí)施例五、固相間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)步驟1、包被在96微孔板內(nèi)每孔加入100ul包被液(包被抗原用碳酸鹽緩沖液溶解)，4℃過夜或37℃溫育2小時(shí)；2、封閉取出96微孔板，棄去包被液，用PBST(含0.05％ Tween-20的磷酸鹽緩沖液，下同)洗滌三次，甩干，并在每孔中加入200ul封閉液(1％OVA)，37℃溫育1小時(shí)；3、加樣取出酶標(biāo)板，用PBST洗滌三次，甩干，將樣品去除懸浮雜質(zhì)后，與等體積抗體混合液混合，按表一所示注入96微孔板內(nèi)，每孔100ul，同時(shí)，酶標(biāo)板G1-G6孔加入50ul的抗體和50ul的PBS，H行各孔加入100ul的PBS，37℃溫育2小時(shí)；4、加酶標(biāo)SPA(葡萄球菌A蛋白)取出酶標(biāo)板，用PBST洗滌，甩干，于每孔中加入100ul酶標(biāo)SPA稀釋液，37℃溫育45分鐘。
5、加底物液取出酶標(biāo)板，用PBST洗滌三次，甩干。于每孔中加入現(xiàn)配的底物液，37℃溫育15分鐘。
6、終止反應(yīng)每孔中加入50ul 2M硫酸溶液終止反應(yīng)。
7、讀數(shù)，加硫酸后立即用吸水紙吸干酶標(biāo)扳底部，將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上，在450nm波長(zhǎng)下，以H行作為為空白調(diào)零，測(cè)定各孔的OD值。
8、設(shè)定對(duì)照孔G1-G6的OD值的平均值為BO，同一樣品的重復(fù)孔的OD值平均值為Byp(yp代表不同的樣品)。每組數(shù)據(jù)都以三次重復(fù)的平均值為準(zhǔn)。各樣品測(cè)定對(duì)應(yīng)的抑制率為I＝100％[(B0--Byp)/Bo]。
9、結(jié)果判斷，根據(jù)樣品OD值計(jì)算抑制率，若抑制率＞20％，表明樣品中可能有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留，需進(jìn)一步進(jìn)行儀器確認(rèn)。
實(shí)施時(shí)，所述的抗體可以采用單克隆抗體也可以采用多克隆抗體，所述的樣品可以采用蔬果類或液體質(zhì)。在本實(shí)施例中，所述的抗體為多克隆克隆抗體，所述的樣品為液體質(zhì)。
實(shí)施案例六固相直接檢測(cè)步驟1、包被在96微孔板內(nèi)每孔加入100ul包被抗原稀釋液，4攝氏度過夜或37攝氏度溫育2小時(shí)；2、封閉取出96微孔板，棄去包被液，用PBST洗滌三次，甩干，并在每孔中加入200ul封閉液，37攝氏度溫育1小時(shí)；3、加樣取出酶標(biāo)板，用PBST洗滌三次，甩干，將樣品用甲醇與水以5∶95混合液提取，提取液濃縮凈化處理后與等體積辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體混合液混合，按表4-4所示注入96微孔板內(nèi)，每孔100ul，同時(shí)，酶標(biāo)板H行各孔加入100ul的PBS，G1-G6孔加入50ul的SPA標(biāo)記抗體和50ul的PBS，37設(shè)施度溫育2小時(shí)；4、加底物液取出酶標(biāo)板，用PBST洗滌三次，甩干。于每孔中加入現(xiàn)配的底物液，37攝氏度溫育15分鐘。
5、終止反應(yīng)每孔中加入50μl 2M硫酸溶液終止反應(yīng)。
6、讀數(shù)，加硫酸后立即用吸水紙吸干酶標(biāo)底部，將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上，在450nm波長(zhǎng)下，以H行各孔為空白調(diào)零，測(cè)定各孔的OD值。
7、設(shè)定對(duì)照孔G1-G6的OD值的平均值為BO，同一樣品的重復(fù)孔的OD值平均值為Byp(yp代表不同的樣品)。每組數(shù)據(jù)都以三次重復(fù)的平均值為準(zhǔn)。各樣品測(cè)定對(duì)應(yīng)的抑制率為I＝100％[(BO----Byp)/Bo]。
8、結(jié)果判斷，根據(jù)樣品OD值計(jì)算抑制率，若抑制率＞20％，表明樣品中可能有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留，需進(jìn)一步進(jìn)行儀器確認(rèn)。
實(shí)施時(shí)，所述的抗體可以采用單克隆抗體也可以采用多克隆抗體，所述的樣品可以采用蔬果類或液體質(zhì)。在本實(shí)施例中，所述的抗體為單克隆抗體，所述的樣品為蔬果類。
表4酶標(biāo)板中的加樣實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?

實(shí)施例七、免疫檢測(cè)試制法檢測(cè)免疫檢測(cè)試紙包括吸水紙A、玻璃纖維素膜S、硝酸纖維素膜T和硝酸纖維素膜C端，免疫檢測(cè)試紙的具體結(jié)構(gòu)為依次將吸水紙A、玻璃纖維素膜S、硝酸纖維素膜T和硝酸纖維素膜C之間的接頭相互交叉重疊，粘貼于塑料片上；玻璃纖維素膜S上吸附著對(duì)多種有機(jī)磷有特異性識(shí)別的標(biāo)記抗體，硝酸纖維素膜T包被著線條狀的過量抗原，硝酸纖維素膜C固定著羊抗兔抗體IgG。在免疫檢測(cè)試紙中，以硝酸纖維素膜T和硝酸纖維素膜C分別為抗原和羊抗兔IgG的載體，玻璃纖維素膜S為標(biāo)記抗體的載體，以吸水紙A浸取樣品液，將定量標(biāo)記抗體點(diǎn)在玻璃纖維素膜S上，再將過量的包被原包被在靠浸樣端的硝酸纖維素膜T上，作為測(cè)試區(qū)，羊抗兔IgG點(diǎn)在硝酸纖維素膜C端，作為對(duì)照區(qū)。硝酸纖維素膜T過量的包被原包被是這樣實(shí)現(xiàn)的將硝酸纖維素膜T放如1％牛血清蛋白(BSA)中封閉30min，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，37℃干燥3h。
檢測(cè)時(shí)，把吸水紙A一端放入到樣品液中，樣品液在毛細(xì)管的作用下向另一端移動(dòng)，當(dāng)液體到達(dá)玻璃纖維素膜S處時(shí)，標(biāo)記抗體被溶解并與樣品中抗原反應(yīng)而形成復(fù)合物，液流繼續(xù)前移至硝酸纖維素膜T處，若樣品為陰性時(shí)，標(biāo)記抗體有過剩，可再與膜上的抗原結(jié)合，加底物有顯色反應(yīng)，多余的標(biāo)記抗體繼續(xù)前移至硝酸纖維素膜C端，可發(fā)生顯色反應(yīng)作對(duì)照。相反，當(dāng)樣品為陽性時(shí)，測(cè)試區(qū)域T抗原不能結(jié)合標(biāo)記抗體復(fù)合物加底物不會(huì)有顯色反應(yīng)，復(fù)合物繼續(xù)前移被固定在對(duì)照區(qū)(C)羊抗兔IgG結(jié)合，加底物形成顯色對(duì)照線。若對(duì)照區(qū)不顯色，則說明試紙條失效。
以檢測(cè)菜樣為例，檢測(cè)前先稱取20g菜樣，加乙腈50ml勻漿1min，抽濾后加5-7g氯化鈉鹽析，其上清液為樣品提取液，將試紙條吸水紙A端浸入樣品液10s后取出平放，10min觀察結(jié)果，只有對(duì)照區(qū)顯色，表示樣品為陰性，測(cè)定區(qū)顯色表示菜樣中有農(nóng)藥殘留。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的免疫抗體，其特征在于，以二乙基膦酸乙酸為半抗原，通過與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)制備免疫原，并通過免疫新西蘭大白兔制備成多克隆抗體或通過小鼠免疫、細(xì)胞融合、篩選及克隆化培養(yǎng)等過程制備單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的免疫抗體，其特征在于所述的人工免疫原采用活化酯法或水溶性碳二亞胺法制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的免疫抗體，其特征在于所述的采用活化酯法制備人工免疫原是這樣實(shí)現(xiàn)的取等摩爾量的二乙基膦酸乙酸和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，環(huán)二己基碳酰亞胺(DCC)，用二氧六環(huán)將混合物溶解，室溫下避光反應(yīng)過夜，去除沉淀后取上清液干燥，將殘留物懸浮在3毫升溶有20mg牛血清蛋白(BSA)的硼酸鹽緩沖液中，混合物在室溫下磁力攪拌1小時(shí)，4℃對(duì)1升pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析，制備成免疫原。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的免疫抗體，其特征在于所述的采用水溶性碳二亞胺法制備人工免疫原是這樣實(shí)現(xiàn)的先稱取二乙基膦酸乙酸溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，低溫?cái)嚢?，取水溶性碳二亞?EDC)溶于1mlDMF中，緩慢加入到上述溶液中。另取牛血清蛋白(BSA)20mg溶于2mlDMF中，4℃攪拌，緩慢加入到上述混合液中。4℃攪拌反應(yīng)8h，再于14℃反應(yīng)過夜，次日2000g離心10min，取沉淀，透析，制備成免疫原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫抗體在檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于，免疫抗體可用于對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥的殘留進(jìn)行檢測(cè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述免疫抗體在檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于，所述的有機(jī)磷類農(nóng)藥包括毒死蜱、氧樂果、二嗪農(nóng)、乙基對(duì)硫磷、丙溴磷、辛硫磷、二乙基膦酸乙酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述免疫抗體在檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于獲得的單克隆抗體或多克隆抗體可用于常規(guī)的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述免疫抗體在檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于獲得的單克隆抗體或多克隆抗體通過金、酶、熒光標(biāo)記抗體后用于直接ELISA檢測(cè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述免疫抗體在檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于獲得的單克隆抗體或多克隆抗體制成免疫檢測(cè)試紙后，對(duì)果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留免疫的抗體及其應(yīng)用，其特征在于，以二乙基膦酸乙酸為半抗原，通過與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)制備成人工免疫原，并通過免疫新西蘭大白兔制備成多克隆抗體或通過小鼠免疫、細(xì)胞融合、篩選及克隆化培養(yǎng)等過程制成單克隆抗體，所述的多克隆抗體或單克隆抗體可用于間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA、直接ELISA或免疫試紙對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥的殘留進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于所選擇的半抗原具有多種有機(jī)磷類農(nóng)藥的通用結(jié)構(gòu)，不需要進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，即可與蛋白質(zhì)進(jìn)行藕連后免疫動(dòng)物，可用于食品，水源中多種有機(jī)磷類農(nóng)藥的篩選檢測(cè)，充分顯示了免疫檢測(cè)技術(shù)的快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1598586SQ20041004189
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月7日
發(fā)明者劉賢金, 顏春榮, 余向陽, 張存政, 王冬蘭 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院