專利名稱：帶有陰離子性取代基物質(zhì)的捕捉劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于分離精制帶有陰離子性取代基(如磷酸基)的物質(zhì)、由指定的鋅配位基結(jié)合的聚合物載體、含有該聚合物載體的帶有陰離子性取代基(如磷酸基)物質(zhì)的捕捉劑，還涉及填充有這種捕捉劑的捕捉器具及其捕捉方法。
背景技術(shù)：
作為用于分析帶有磷酸基的物質(zhì)，例如磷酸化的活體物質(zhì)等的方法，在現(xiàn)有技術(shù)中，已知的有通過酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)的方法或者使用放射性同位素的方法。
酶聯(lián)免疫吸附試驗法利用抗體(或者抗原亦可)與目標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合的原理。為此，要想制作目標(biāo)物質(zhì)固有的抗體，存在必須大量精制、獲得目標(biāo)物質(zhì)的問題。同時，抗體制作時利用動物的免疫反應(yīng)，所以抗體的制作存在耗時的問題。還有，由于無法制作相對于數(shù)kDa(道爾頓)以下分子結(jié)構(gòu)中的磷酸化部位的抗體，所以存在無法利用酶聯(lián)免疫吸附試驗法分析具有如此分子結(jié)構(gòu)的磷酸化活體物質(zhì)的問題。
另外，使用放射性同位素的方法是利用放射性同位素32P。為此，存在實驗室中放射線的管理及廢液的管理費事的問題。
有關(guān)降低排放水中磷酸濃度的方法，在特開平11-57695號公報中，公開了使用多金屬氫氧化物的方法。另一方面，在醫(yī)藥領(lǐng)域，作為在高磷血癥的治療中使用的物質(zhì)，在特表平8-506846號公報中記載有胍基結(jié)合而成的聚合物。但是，多金屬氫氧化物及胍基結(jié)合而成的聚合物，對于磷酸基的結(jié)合力都弱。為此，要捕捉一定量的磷酸，就存在必須使用大量作為磷酸基結(jié)合基質(zhì)的多金屬氫氧化物或者胍基結(jié)合而成的聚合物的問題。
另一方面，作為與磷酸基強(qiáng)結(jié)合的化合物，在美國化學(xué)會志(Journal of the American Chemical Society)(美國)，1991年，第113卷，第23號，第8935-8941頁記載有大環(huán)狀聚胺鋅配位化合物。但是，大環(huán)狀聚胺鋅配位化合物可溶于溶劑中。為此，存在在溶液中分離精制與大環(huán)狀聚胺鋅配位化合物相結(jié)合的帶有磷酸基的物質(zhì)非常困難的問題。
從而，為了分離精制磷酸化的活體物質(zhì)等帶有磷酸基的物質(zhì)，期望有在一定的條件下，同時具備與陰離子性取代基之一的磷酸基強(qiáng)力結(jié)合的特性及分離精制容易的特性，且安全又廉價的捕捉劑。
本發(fā)明的目的是提供一種在一定的條件下，與陰離子性取代基(如磷酸基)結(jié)合，同時使得分離精制帶有該取代基的物質(zhì)容易、安全又廉價的捕捉劑，及其填充有這種捕捉劑的簡便捕捉器具及迅速且容易的捕捉方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人們，為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，作了不懈的探討研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果聚合物載體與特定的鋅配位基相結(jié)合，則該聚合物載體具有與陰離子性取代基(如磷酸基)強(qiáng)力結(jié)合的特性，同時，整體顯示出溶劑難溶性(優(yōu)選溶劑不溶性)，由此，使分離精制變得極為容易，即可成為帶有該取代基的物質(zhì)的有用捕捉劑。同時，也確立了填充有這種捕捉劑的該物質(zhì)的捕捉器具及使用這種捕捉劑的該物質(zhì)的捕捉方法，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明(1)是一種聚合物載體，為通式(1)所示鋅配位基直接或通過隔離基結(jié)合的聚合物載體， 式中，R相互間可相同或不同，可以是氫原子、碳原子數(shù)為1-16的烷基、酰基、烷氧羰基、?；榛⑼檠豸驶榛?、羧基烷基、氨基甲酰烷基、氰基烷基、羥基烷基、氨基烷基或者鹵代烷基(在此，這些基團(tuán)的烷基部分的碳原子數(shù)是1-16)、羧基、氨基甲酰基、氰基、羥基、氨基或者鹵素基團(tuán)。
還有，本發(fā)明(2)是一種帶有陰離子性取代基的物質(zhì)的捕捉劑，其中，含有發(fā)明(1)所述的聚合物載體或者通式(2)所示的鋅配位基直接或通過隔離基結(jié)合的聚合物載體。
并且，本發(fā)明(3)是根據(jù)發(fā)明(2)所述捕捉劑，其中，陰離子性取代基為磷酸基。
還有，本發(fā)明(4)是根據(jù)發(fā)明(2)或(3)所述捕捉劑，其中，捕捉劑呈珠粒狀。
并且，本發(fā)明(5)是根據(jù)發(fā)明(2)或(3)所述捕捉劑，其中，捕捉劑呈板狀。
還有，本發(fā)明(6)是根據(jù)發(fā)明(2)或(3)所述捕捉劑，其中，捕捉劑呈纖維狀。
并且，本發(fā)明(7)是一種帶有陰離子性取代基物質(zhì)的捕捉器具，其中，填充有發(fā)明(2)-(4)或(6)之一的捕捉劑，具有以過濾器進(jìn)行過濾分離的功能。
還有，本發(fā)明(8)是一種帶有陰離子性取代基的物質(zhì)的捕捉方法，包括通過使帶有陰離子性取代基的物質(zhì)與發(fā)明(2)-(6)之一的捕捉劑相結(jié)合而進(jìn)行捕捉的步驟。
并且，本發(fā)明(9)是根據(jù)發(fā)明(8)所述方法，其中，在該捕捉步驟之后，還包括將帶有陰離子性取代基的物質(zhì)從捕捉劑上解離的步驟。


圖1為使用含有由鋅配位基結(jié)合而成的聚合物載體的捕捉劑，所得到的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖的前半部分。
圖2為使用含有由鋅配位基結(jié)合而成的聚合物載體的捕捉劑，所得到的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖的后半部分。
圖3為使用含有由不含鋅的配位基結(jié)合而成的聚合物載體的捕捉劑，所得到的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖的前半部分。
圖4為使用含有由不含鋅的配位基結(jié)合而成的聚合物載體的捕捉劑，所得到的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖的后半部分。
另外，在這些圖中，1為牛血清白蛋白、2為雞蛋白白蛋白、3為牛β-酪蛋白、4為非磷酸化型牛αs1-酪蛋白、5為牛αs1-酪蛋白、6為TRIS(三羥甲基氨基甲烷)-鹽酸緩沖液(pH7.0)和0.5M氯化鈉水溶液的混合液第一次、7為TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)和0.5M氯化鈉水溶液的混合液第二次、8為TRIS-乙酸緩沖液(pH7.0)第一次、9為TRIS-乙酸緩沖液(pH7.0)第二次、10為TRIS-乙酸緩沖液(pH7.0)第三次、11為TRIS-乙酸緩沖液(pH7.0)第四次、12為10mM磷酸緩沖液(pH7.0)、13為15mM磷酸緩沖液(pH7.0)、14為20mM磷酸緩沖液(pH7.0)、15為25mM磷酸緩沖液(pH7.0)、16為30mM磷酸緩沖液(pH7.0)、17為35mM磷酸緩沖液(pH7.0)、18為40mM磷酸緩沖液(pH7.0)、19為45mM磷酸緩沖液(pH7.0)、20為50mM磷酸緩沖液(pH7.0)、21為60mM磷酸緩沖液(pH7.0)、22為70mM磷酸緩沖液(pH7.0)、23為80mM磷酸緩沖液(pH7.0)、24為90mM磷酸緩沖液(pH7.0)、25為100mM磷酸緩沖液(pH7.0)、26為200mM磷酸緩沖液(pH7.0)、27為300mM磷酸緩沖液(pH7.0)、28為400mM磷酸緩沖液(pH7.0)、29為500mM磷酸緩沖液(pH7.0)的圖線。
具體實施例方式
首先，對通式(1)或者通式(2)中所示鋅配位基結(jié)合的聚合物載體進(jìn)行說明。所謂“聚合物載體”為可與該基團(tuán)結(jié)合的聚合物，并且，只要起“載體”或者“支撐體”的功能，其他沒有特殊限定。但是，優(yōu)選的是，聚合物載體在使用時，對所用溶劑或者試劑有耐受性，并且，具有在進(jìn)行過濾及洗凈時必要的物理強(qiáng)度。還有，優(yōu)選對帶有陰離子性取代基物質(zhì)的捕捉?jīng)]有影響。作為具體例可列舉如下聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙炔(聚炔烴)、聚氯乙烯、聚乙烯基酯、聚乙烯基醚、聚丙烯酸酯、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯腈、聚甲基丙烯酰胺、聚醚、聚甲醛、聚酯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚酰胺、尼龍、聚氨酯、聚尿素、聚酰亞胺、聚咪唑、聚噁唑、聚硫化物、聚砜、聚磺酰胺、聚合物合金、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、殼聚糖、硅石等。另外，為了確保更好的物理強(qiáng)度，聚合物載體亦可為具有交聯(lián)結(jié)構(gòu)的聚合物載體，交聯(lián)劑的具體例可列舉如下二乙烯基苯、3-氯-1，2-環(huán)氧丙烷、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、二異氰酸4，4′-二苯甲烷等。
這種聚合物載體，與通式(1)或者通式(2)中所示的鋅配位基直接或者通過隔離基相結(jié)合。在此，所謂隔離基，是指為通過使鋅配位基從聚合物載體上分開而促進(jìn)捕捉物質(zhì)與鋅配位基相結(jié)合及增加溶劑的膨潤度目的而導(dǎo)入的聚合物，作為具體例可列舉如下聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚酰胺、聚酯等。另外，鋅配位基和聚合物載體或者隔離基相結(jié)合方式，作為具體例可列舉如下碳-碳結(jié)合、酯結(jié)合、羰基結(jié)合、酰胺結(jié)合、醚結(jié)合、硫化物結(jié)合、氨基結(jié)合、亞胺基結(jié)合等共價鍵結(jié)合。
本發(fā)明的通式(1)所示的鋅配位基結(jié)合的聚合物載體，作為具體例可列舉如下實例等由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的TOYOPEARL(注冊商標(biāo)) 或者，由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的ArgoGel(注冊商標(biāo)) 或者，由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的TSKgel(注冊商標(biāo))
或者，由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的Sepharose(商標(biāo)) 本發(fā)明所述通式(2)所示鋅配位基結(jié)合的聚合物載體，作為具體例可列舉如下實例等由Zn2+-四氮雜環(huán)十二烷基(サイクレン基)結(jié)合的TOYOPEARL(注冊商標(biāo)) 或者，由Zn2+-四氮雜環(huán)十二烷基結(jié)合的ArgoGel(注冊商標(biāo)) 或者，由Zn2+-四氮雜環(huán)十二烷基結(jié)合的TentaGel(注冊商標(biāo)) 所謂陰離子性取代基是指帶負(fù)電荷的取代基，作為陰離子的具體例可列舉如下2價磷酸單酯陰離子(-OPO32-)、1價磷酸二酯陰離子((-O)2PO2-)、2價膦酸陰離子(-PO32-)、1價膦酸陰離子((-)2PO2-)、1價碳酸酯陰離子(-OCO2-)、1價羧酸陰離子(-CO2-)、1價硫酸酯陰離子(-OSO3-)、1價磺酸陰離子(-SO3-)等。
所謂帶有磷酸基的物質(zhì)是指帶有2價磷酸單酯陰離子(-OPO32-)的物質(zhì)，作為該物質(zhì)的具體例可列舉如下磷酸化氨基酸、磷酸化氨基酸殘基、帶有磷酸化氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(磷酸化蛋白質(zhì))、帶有磷酸化氨基酸殘基的多肽(磷酸化多肽)、帶有磷酸化氨基酸殘基的低聚肽(磷酸化低聚肽)、脫氧核糖核酸(DNA)、磷脂、磷酸化糖類、血中的磷酸成分、排水中的磷酸成分等。
通式(1)或者通式(2)中所示鋅配位基本身與所用溶劑間的關(guān)系通常是可溶的。但是，通過將其與聚合物載體相結(jié)合，與該溶劑的關(guān)系為難溶(優(yōu)選不溶)。為此，本發(fā)明的聚合物載體在優(yōu)選條件下，能夠捕捉溶液中帶有陰離子性取代基(如磷酸基)的物質(zhì)，同時，也可從溶劑中過濾或者洗凈，因此，可以迅速且容易地從溶液中分離精制該物質(zhì)。同時，對該物質(zhì)的定量亦可使用捕捉劑。
以珠粒狀使用的捕捉劑，其用途的具體例可列舉如下金屬固定親和層析(IMAC)柱等的柱載體、用于精制或者濃縮磷酸化蛋白質(zhì)或者脫氧核糖核酸(DNA)等帶有磷酸基的物質(zhì)的柱填充劑、用于分離或者精制帶有磷酸基的物質(zhì)的磁性珠粒、用于高磷血癥治療的捕捉血中磷酸成分的制劑等。
以板狀使用的捕捉劑，其用途的具體例可列舉如下用于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)的試樣基板、用于精制或者檢出蛋白質(zhì)或者脫氧核糖核酸(DNA)等的薄片等。
以纖維狀使用的捕捉劑，其用途的具體例可列舉如下用于分離帶有磷酸基的物質(zhì)和不帶有磷酸基的物質(zhì)的分離膜、中空纖維膜過濾器等。
本發(fā)明的帶有陰離子性取代基(如磷酸基)物質(zhì)的捕捉器，填充含有上述聚合物載體的捕捉劑或者是珠?；蚶w維狀捕捉劑，具有通過過濾器進(jìn)行過濾分離的功能。在此，所謂過濾器是指，將溶解有這些捕捉劑及與這些捕捉劑相結(jié)合的帶有該取代基的物質(zhì)和不與這些捕捉基相結(jié)合的不帶有該取代基的物質(zhì)的溶液，或者，溶解有這些捕捉劑和從這些捕捉劑上解離的帶有該取代基的物質(zhì)的溶液，通過簡便的固液分離達(dá)到過濾分離的目的，而導(dǎo)入的分離材料，作為具體例可列舉如下玻璃濾器、金屬燒結(jié)濾器、膜濾器、超濾膜、石棉、玻璃棉、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚醚砜、纖維素等。另外，此過濾器不僅是安置在捕捉劑的下方，上下都可安置，通過采用2個過濾器夾持這些捕捉劑，也一并有抑制這些捕捉劑流動范圍的效果。
本發(fā)明的帶有陰離子性取代基(特別是磷酸基)物質(zhì)的捕捉器具，作為具體例可列舉如下由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的TOYOPEARL(注冊商標(biāo))柱、由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的Sepharose(商標(biāo))柱、由Zn2+-四氮雜環(huán)十二烷基結(jié)合的TOYOPEARL(注冊商標(biāo))柱、由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的Sepharose(商標(biāo))離心式過濾設(shè)備等。
本發(fā)明的帶有陰離子性取代基(如磷酸基)物質(zhì)的捕捉方法，利用了與聚合物載體相結(jié)合的鋅配位基與該物質(zhì)相結(jié)合的原理。而且，根據(jù)捕捉該物質(zhì)時的規(guī)模或者狀態(tài)，可以選擇諸如珠粒、板、纖維等的聚合物載體，根據(jù)用途不同進(jìn)行對應(yīng)的物質(zhì)的捕捉。
另外，本發(fā)明的帶有陰離子性取代基(如磷酸基)物質(zhì)的捕捉方法為，例如使該物質(zhì)在為生理條件的中性條件下等與本發(fā)明的聚合物載體相結(jié)合，隨后，例如通過改變?nèi)芤旱膒H值、具有緩沖作用的酸和其鹽或者堿和其鹽的種類、緩沖液或者溶液所含鹽濃度的變化等，使結(jié)合的該物質(zhì)從本發(fā)明的聚合物載體上解離。之所以可以捕捉該物質(zhì)，進(jìn)而釋放捕捉的該物質(zhì)，是由于該物質(zhì)與本發(fā)明的聚合物載體的結(jié)合因例如溶液的pH值、具有緩沖作用的酸和其鹽或者堿和其鹽的種類、緩沖液或者溶液所含鹽的濃度等的緣故而改變。
同時，本發(fā)明的帶有陰離子性取代基(如磷酸基)物質(zhì)的捕捉方法，也包含通過添加例如乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合劑，使結(jié)合的該物質(zhì)從本發(fā)明的聚合物載體上解離。之所以可釋放捕捉的該物質(zhì)，是由于例如乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合劑將鋅離子從該物質(zhì)與本發(fā)明的聚合物載體的結(jié)合體中抽出，從而解離結(jié)合的該物質(zhì)。
這樣，使用迅速且容易的捕捉方法，對帶有陰離子性取代基(如磷酸基)物質(zhì)進(jìn)行分離精制及回收，可以通過改變例如溶液的pH值、具有緩沖作用的酸和其鹽或者堿和其鹽的種類、緩沖液或者溶液所含鹽的濃度，或者，通過添加例如乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合劑，而隨意進(jìn)行。
實施例以下，通過列舉實施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但本發(fā)明不僅限于下述所記載的實施例。另外，這些實施例中的鋅離子(Zn2+)擔(dān)載量(單位mmol Zn2+/g或者μmol Zn2+/ml)，表示為相對于鋅配位基結(jié)合的聚合物載體總量的鋅離子含量值。
實施例1將TOYOPEARL(注冊商標(biāo))AF-Epoxy-650M 10g和四氮雜環(huán)十二烷6.9g和碳酸鉀2.2g的乙醇溶液75ml，在40℃攪拌4天。反應(yīng)液過濾洗凈后，將所得珠粒和硝酸鋅六水合物12g的水溶液75ml，在40℃攪拌2天。反應(yīng)液過濾洗凈后，進(jìn)行減壓干燥，得到由Zn2+-四氮雜環(huán)十二烷基結(jié)合的TOYOPEARL(注冊商標(biāo))12g(0.3mmol Zn2+/g)。
實施例2向帶有聚乙烯制過濾器的柱內(nèi)填充由Zn2+-四氮雜環(huán)十二烷基結(jié)合的TOYOPEARL(注冊商標(biāo))100mg(0.3mmol Zn2+/g)，制成由Zn2+-四氮雜環(huán)十二烷基結(jié)合的TOYOPEARL(注冊商標(biāo))柱。
實施例3用50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)使由Zn2+-四氮雜環(huán)十二烷基結(jié)合的TOYOPEARL(注冊商標(biāo))柱膨潤。向柱內(nèi)添加以50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)調(diào)節(jié)過的10mM 4-硝基苯甲酸鈉溶液1.0ml，之后，添加50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)2.0ml并使其流出。收集流出液，使用紫外可見光分光光度計對流出液中的1價4-硝基苯甲酸陰離子的捕捉率進(jìn)行測量，結(jié)果為100％。
實施例4用50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)使由Zn2+-四氮雜環(huán)十二烷基結(jié)合的TOYOPEARL(注冊商標(biāo))柱膨潤。向柱內(nèi)添加以50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)調(diào)節(jié)過的10mM 4-硝基苯磷酸二鈉溶液1.0ml，之后，添加50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)2.0ml并使其流出。收集流出液，使用紫外可見光分光光度計對流出液中的2價4-硝基苯磷酸陰離子的捕捉率進(jìn)行測量，結(jié)果為98％。
實施例5將1，3-二氨基-2-丙醇33g和2-吡啶羧基醛116g和氰基三羥基硼酸(シアノトリヒドロほう酸)鈉50g的甲醇溶液500ml，在室溫攪拌3天。經(jīng)過后處理后，用柱層析法精制，得到合成中間體34g。
將合成中間體18g和6-溴甲基煙酸甲酯12g和碳酸鉀14g的N，N-二甲基甲酰胺溶液225ml，在50℃攪拌1小時。經(jīng)過后處理后，用柱層析法精制，得到甲酯體22g。
將甲酯體17g和1.0M氫氧化鈉水溶液83ml的甲醇溶液40ml，在室溫攪拌1小時。中和后，用柱層析法精制，得到N-(5-羧基-2-吡啶基)甲基-N，N’，N’-三[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙醇13g。
實施例6將TOYOPEARL(注冊商標(biāo))AF-Amino-650M 1.2g和N-(5-羧基-2-吡啶基)甲基-N，N’，N’-三[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙醇450mg和雙環(huán)己基碳二亞胺210mg和1-羥苯并三唑150mg的N，N-二甲基甲酰胺溶液10ml，在40℃攪拌18小時。反應(yīng)液過濾洗凈后，將所得珠粒和乙酸鋅二水合物480mg和10M氫氧化鈉水溶液0.10ml的乙醇溶液7.0ml，在40℃攪拌18小時。反應(yīng)液過濾洗凈后，將所得珠粒和1.0M高氯酸鈉水溶液3.0ml的水溶液7.0ml，在40℃攪拌18小時。反應(yīng)液過濾洗凈后，進(jìn)行減壓干燥，得到由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的TOYOPEARL(注冊商標(biāo))1.0g(0.5mmol Zn2+/g)。
實施例7向帶有聚乙烯制過濾器的柱內(nèi)填充由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的TOYOPEARL(注冊商標(biāo))100mg(0.5mmol Zn2+/g)，制成由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的TOYOPEARL(注冊商標(biāo))柱。
實施例8用50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)/乙腈(1/1)溶液使由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的TOYOPEARL(注冊商標(biāo))柱膨潤。向柱內(nèi)添加以50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)/乙腈(1/1)溶液調(diào)節(jié)過的10mM 4-硝基苯甲酸鈉溶液1.0ml，之后，添加50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)/乙腈(1/1)溶液2.0ml并使其流出。收集流出液，使用紫外可見光分光光度計對流出液中的1價4-硝基苯甲酸陰離子的捕捉率進(jìn)行了測量，結(jié)果為100％。隨后，添加50mM磷酸緩沖液(pH3.0)/乙腈(1/1)溶液50ml并使其流出。收集流出液，使用紫外可見光分光光度計對流出液中的1價4-硝基苯甲酸陰離子的回收率進(jìn)行了測量，結(jié)果為100％。
實施例9
用50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)使由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的TOYOPEARL(注冊商標(biāo))柱膨潤。向柱內(nèi)添加以50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)調(diào)節(jié)過的10mM 4-硝基苯磷酸二鈉溶液1.0ml，之后，添加50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)2.0ml并使其流出。收集流出液，使用紫外可見光分光光度計對流出液中的2價4-硝基苯磷酸陰離子的捕捉率進(jìn)行了測量，結(jié)果為100％。隨后，添加作為淋洗液的50mM磷酸緩沖液(pH3.0)50ml并使其流出。收集流出液，使用紫外可見光分光光度計對流出液中的2價4-硝基苯磷酸陰離子的回收率進(jìn)行了測量，結(jié)果為89％，然而，添加作為淋洗液的50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)50ml并使其流出，收集流出液，使用紫外可見光分光光度計對流出液中的2價4-硝基苯磷酸陰離子的回收率進(jìn)行了測量，結(jié)果為0％。
實施例10將1，3-二氨基-2-丙醇33g和2-吡啶羧基醛116g和氰基三羥基硼酸鈉50g的甲醇溶液500ml，在室溫攪拌3天。經(jīng)過后處理后，用柱層析法精制，得到合成中間體34g。
將合成中間體18g和6-溴甲基煙酸甲酯12g和碳酸鉀14g的N，N-二甲基甲酰胺溶液225ml，在50℃攪拌1小時。經(jīng)過后處理后，用柱層析法精制，得到甲酯體22g。
將甲酯體10g和乙二胺23g的甲醇溶液100ml，在室溫攪拌3天。經(jīng)過后處理后，用柱層析法精制，得到N-{5-[N-(2-氨基)乙基]氨基甲酰基-2-吡啶基}甲基-N，N’，N’-三[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙醇10g。
實施例11將NHS-活化的Sepharose(商標(biāo))4FF的20mM乙腈溶液5.0ml和N-{5-[N-(2-氨基)乙基]氨基甲?；?2-吡啶基}甲基-N，N’，N’-三[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙醇的5.0mM乙腈溶液5.0ml，在50℃攪拌1小時。反應(yīng)液過濾洗凈后，再經(jīng)過20mM碳酸鈉水溶液的洗凈，得到由N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙醇基結(jié)合的Sepharose(商標(biāo))5.0ml。
實施例12向帶有聚丙烯制過濾器的柱內(nèi)填充由N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙醇基結(jié)合的Sepharose(商標(biāo))1.0ml，用100mM2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液(pH6.0)和20mM乙酸鋅水溶液的混合液5.0ml、100mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液(pH6.0)和0.1mM乙酸鋅水溶液的混合溶液5.0ml、TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)和0.5M氯化鈉水溶液的混合液5.0ml平衡化，制成由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的Sepharose(商標(biāo))柱。
實施例13向由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的Sepharose(商標(biāo))柱內(nèi)，添加牛血清白蛋白(分子量66,000磷酸化絲氨酸殘基×0)50μg和雞蛋白白蛋白(分子量45,000磷酸化絲氨酸殘基×2)50μg和牛αs1-酪蛋白(分子量24,000磷酸化絲氨酸殘基×8)50μg和牛αs1-非磷酸化型酪蛋白(分子量24,000磷酸化絲氨酸殘基×0)50μg和牛β-酪蛋白(分子量25,000磷酸化絲氨酸殘基×5)50μg。隨后，按下列順序添加各緩沖液并使其流出TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)和0.5M氯化鈉水溶液的混合溶液1.0ml2次、TRIS-乙酸緩沖液(pH7.0)1.0ml 4次、10mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0m l、15mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、20mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0m l、25mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、30mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、35mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、40mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、45mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、50mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、60mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、70mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、80mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、90mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、100mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、200mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、300mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、400mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、500mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml。將流出液濃縮后，進(jìn)行斑點實驗(スポツトレ)，以十二烷基硫酸納一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分離，之后，用科麥西亮藍(lán)(クマシ一ブリリアントブル一)(CBB)染色。電泳圖的前半部分如圖1所示、后半部分如圖2所示。在圖1及圖2中，可得到確認(rèn)，按照最初流出的是沒有磷酸化絲氨酸殘基的牛血清白蛋白，隨后是磷酸化絲氨酸殘基數(shù)量由少到多的順序，雞蛋白白蛋白、牛β-化酪蛋白、牛αs1-酪蛋白流出。
實施例14向微量吸移管端頭中填入纖維素制濾紙，填充從由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的Sepharose(商標(biāo))柱中取出的由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的Sepharose(商標(biāo))10μl，之后，用纖維素制濾紙蓋住，制成由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的Sepharose(商標(biāo))的端頭。
實施例15采用裝上由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的Sepharose(商標(biāo))端頭的微量吸移管，吸入以含有0.50M硝酸鈉的100mM TRIS-乙酸緩沖劑(pH7.4)調(diào)節(jié)過的0.22mMp60c-src肽521-533和0.18mM磷酸化p60c-src肽521-533的混合溶液10μl，進(jìn)行5分鐘平衡化后排出。之后，用含有0.50硝酸鈉的100mMTRIS-乙酸緩沖液(pH7.4)10μl進(jìn)行5次洗凈。隨后，用10mM磷酸緩沖液(pH7.0)10μl進(jìn)行6次洗凈，回收洗液，用高速液相色譜儀進(jìn)行純度測定，其結(jié)果為磷酸化p60c-src肽521-533 100％，p60c-src肽521-5330％。
實施例16向PS20 ProteinChip(注冊商標(biāo))Array(陣列)中加入以100mM碳酸氫鈉水溶液/乙腈(1/3)溶液調(diào)節(jié)的0.38M N-{5-[N-(2-氨基)乙基]氨基甲酰基-2-吡啶基}甲基-N，N’，N’-三[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙醇溶液3.0μl，在室溫反應(yīng)4小時。進(jìn)而，加入以100mM碳酸氫鈉水溶液調(diào)節(jié)的0.50M 2-氨基乙醇溶液3.0μl，在室溫反應(yīng)4小時。洗凈后，用以100mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液(pH6.0)調(diào)節(jié)的0.50M乙酸鋅溶液洗凈，得到由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的ProteinChip(注冊商標(biāo))Array。
實施例17向由Zn2+2-N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙氧基結(jié)合的ProteinChip(注冊商標(biāo))Array中加入以100mM TRIS-乙酸緩沖液(pH7.4)調(diào)節(jié)的0.94mM 4-甲基繖形基(ウンベリフェリル)磷酸二鈉溶液3.0μl，在室溫進(jìn)行1小時平衡化后回收。收集回收液，使用紫外可見光分光光度計對回收液中的2價4-甲基繖形基磷酸陰離子的捕捉率進(jìn)行測定，為16％。
比較例1向帶有聚乙烯制過濾器的柱內(nèi)填充TOYOPEARL(注冊商標(biāo))AF-Epoxy-650M 100mg，用50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)進(jìn)行膨潤。向柱內(nèi)添加以50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)調(diào)節(jié)過的10mM 4-硝基苯磷酸二鈉溶液1.0ml，之后添加50mM TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)2.0ml并使其流出。收集流出液，使用紫外可見光分光光度計對流出液中的2價4-硝基苯磷酸陰離子的捕捉率進(jìn)行測定，為0.5％。
比較例2向帶有聚丙烯制過濾器的柱內(nèi)填充由N，N，N’，N’-四[(2-吡啶基)甲基]-1，3-二氨基-2-丙醇基結(jié)合的Sepharose(商標(biāo))1.0ml，以TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)和0.5M氯化鈉水溶液的混合液5.0ml平衡化。向柱內(nèi)添加牛血清白蛋白(分子量66,000磷酸化絲氨酸殘基×0)50μg和雞蛋白白蛋白(分子量45,000磷酸化絲氨酸殘基×2)50μg和牛αs1-酪蛋白(分子量24,000磷酸化絲氨酸殘基×8)50μg和牛αs1-非磷酸化型酪蛋白(分子量24,000磷酸化絲氨酸殘基×0)50μg和牛β-酪蛋白(分子量25,000磷酸化絲氨酸殘基×5)50μg。隨后，按下列順序添加各緩沖液并使其流出TRIS-鹽酸緩沖液(pH7.0)和0.5M氯化鈉水溶液的混合液1.0ml 2次、TRIS-乙酸緩沖液(pH7.0)1.0ml 4次、10mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、15mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、20mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、25mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、30mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、35mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、40mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、45mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、50mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、60mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、70mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、80mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、90mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、100mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、200mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、300mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、400mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml、500mM磷酸緩沖液(pH7.0)1.0ml。將流出液濃縮后，進(jìn)行斑點實驗(スポツトレ)，以十二烷基硫酸納一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分離，之后，用科麥西亮藍(lán)(CBB)染色。電泳圖的前半部分如圖3所示、后半部分如圖4所示。在圖3及圖4中，可以得到確認(rèn)的是，從最初開始是牛血清白蛋白、雞蛋白白蛋白、牛β-酪蛋白、牛αs1-酪蛋白流出。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的由指定的鋅配位基結(jié)合的聚合物載體，在一定條件下，與陰離子性取代基(如磷酸基)結(jié)合，同時，由于整體具有溶劑難溶性(優(yōu)選溶劑不溶性)，所以成為使分離精制帶有該取代基物質(zhì)容易、安全且廉價的捕捉劑。同時，通過使用此聚合物載體，提供一種以過濾器可以簡單分離精制的捕捉器具及在中性條件下使其結(jié)合，隨后，在一定條件下使其解離，迅速且容易的捕捉方法。
權(quán)利要求
1.一種聚合物載體，為通式(1)所示鋅配位基直接或通過隔離基結(jié)合的聚合物載體， 式中，R相互間可相同或不同，為氫原子、碳原子數(shù)為1-16的烷基、?；?、烷氧羰基、酰基烷基、烷氧羰基烷基、羧基烷基、氨基甲酰基烷基、氰基烷基、羥基烷基、氨基烷基或者鹵代烷基(在此，這些基團(tuán)的烷基部分的碳原子數(shù)是1-16)、羧基、氨基甲?；?、氰基、羥基、氨基或者鹵素基團(tuán)。
2.一種帶有陰離子性取代基的物質(zhì)的捕捉劑，其中，含有權(quán)利要求1的聚合物載體或通式(2)所示的鋅配位基直接或通過隔離基結(jié)合的聚合物載體。
3.權(quán)利要求2的捕捉劑，其特征在于，陰離子性取代基為磷酸基。
4.權(quán)利要求2或3的捕捉劑，其特征在于，捕捉劑呈珠粒狀。
5.權(quán)利要求2或3的捕捉劑，其特征在于，捕捉劑呈板狀。
6.權(quán)利要求2或3的捕捉劑，其特征在于，捕捉劑呈纖維狀。
7.一種帶有陰離子性取代基的物質(zhì)的捕捉器具，其中，填充有權(quán)利要求2-4或6之一的捕捉劑，具有以過濾器進(jìn)行過濾分離的功能。
8.一種帶有陰離子性取代基的物質(zhì)的捕捉方法，其中，包括通過使帶有陰離子性取代基物質(zhì)與權(quán)利要求2-6之一的捕捉劑相結(jié)合而進(jìn)行捕捉的步驟。
9.權(quán)利要求8的方法，其特征在于，在該捕捉步驟之后，還包括將帶有陰離子性取代基的物質(zhì)從捕捉劑上解離的步驟。
全文摘要
指定的鋅配位基直接或通過隔離基以共價結(jié)合的聚合物載體，在一定條件下，具有與陰離子性取代基(如磷酸基)相結(jié)合的特性，同時，整體表現(xiàn)為溶劑難溶性(優(yōu)選溶劑不溶性)，可以捕捉帶有陰離子性取代基(如磷酸基)的物質(zhì)，并且，可容易進(jìn)行分離精制。
文檔編號B01J41/12GK1756792SQ20048000585
公開日2006年4月5日 申請日期2004年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月4日
發(fā)明者小池透, 山本陽介, 竹田宏紀(jì), 佐野吉男, 用貝智子 申請人:瑪奈克股份有限公司