本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2012年11月2日的、發(fā)明名稱為“超載和洗脫層析”的中國(guó)專利申請(qǐng)201280065729.6(pct/us2012/063242)的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求于2011年11月2日提交的臨時(shí)專利申請(qǐng)u.s.系列號(hào)61/554,898的優(yōu)先權(quán)益，其通過(guò)引用全文整合到本文中。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了從包含產(chǎn)物和至少一種污染物的組合物中純化產(chǎn)物的方法，和包含通過(guò)所述方法純化的產(chǎn)物的制劑。發(fā)明背景陰離子交換(aex)層析被普遍用于流通模式中作為單克隆抗體(mab)的平臺(tái)精制步驟。在標(biāo)準(zhǔn)的流通條件下結(jié)合aex樹(shù)脂的某些mab可以解決設(shè)備的適應(yīng)性難題。對(duì)于質(zhì)量要求通常較低的早期臨床研發(fā)階段，通過(guò)使用結(jié)合和洗脫模式的aex或混合模式的樹(shù)脂純化這些非平臺(tái)性的mab。然而，由于這些樹(shù)脂的低動(dòng)態(tài)結(jié)合容量(dbc)，晚期執(zhí)行時(shí)將需要大小約1000l的柱子，或者在較小柱子上進(jìn)行多次循環(huán)，因而限制了設(shè)備的通量。通常使用結(jié)合和洗脫層析(b/e)或流通(f/t)層析實(shí)施mab純化。目前，已經(jīng)將弱分配層析(kelley,bd等，2008biotechnolbioeng101(3):553-566；美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2007/0060741)和過(guò)載層析(pct/us2011/037977)分別導(dǎo)入到aex樹(shù)脂和陽(yáng)離子交換(cex)樹(shù)脂上，以增強(qiáng)mab純化。下文強(qiáng)調(diào)了這些層析模式每者的一般機(jī)制和限制。結(jié)合和洗脫層析：在b/e層析中，通常裝載產(chǎn)物使層析材料的dbc最大化，然后鑒別洗滌和洗脫條件，使得洗脫液中獲得最大產(chǎn)物純度。b/e層析的限制是裝載密度與實(shí)際樹(shù)脂dbc的限制。流通層析：使用f/t層析，鑒別了這樣的裝載條件，在所述條件下雜質(zhì)與層析材料強(qiáng)結(jié)合，同時(shí)產(chǎn)物流通。f/t層析允許對(duì)標(biāo)準(zhǔn)mab進(jìn)行高裝載密度，但對(duì)非平臺(tái)性mab卻不能執(zhí)行，或者能夠?qū)δ切┓瞧脚_(tái)性mab進(jìn)行f/t操作的溶液條件不能在現(xiàn)有的生產(chǎn)設(shè)備中執(zhí)行。弱分配層析：該操作模式通過(guò)鑒別溶液條件，增強(qiáng)了f/t模式，在所述溶液條件下具有mab與樹(shù)脂的弱結(jié)合(2至20g/l)。在這些條件下，雜質(zhì)比在f/t模式下的結(jié)合更強(qiáng)，因而獲得了增強(qiáng)的純化。然而，裝載條件靶向具有范圍在0.1-20內(nèi)的低產(chǎn)物分配系數(shù)(kp)。過(guò)載層析：在該層析模式下，超過(guò)層析材料對(duì)產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量裝載目標(biāo)產(chǎn)物，因而被稱為過(guò)載。所述操作模式已被證實(shí)用陽(yáng)離子交換(cex)基質(zhì)，特別是用膜提供了mab純化。然而，該方法的限制是樹(shù)脂的低產(chǎn)量，因?yàn)闆](méi)有洗脫階段。將多肽大規(guī)模的、有成本效益地純化至足以用作人治療劑的純度仍然是艱巨的難題。本文引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利申請(qǐng)和公開(kāi)都通過(guò)引用全文整合到本文中。概述本發(fā)明提供了用于從包含多肽和一種或多種污染物的組合物中純化多肽的方法，所述方法包括a)以超過(guò)層析材料對(duì)于多肽的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量的量將組合物裝載到層析材料上，b)在其中一種或多種污染物仍然與層析材料結(jié)合的條件下，從層析材料上洗脫多肽，和c)混合包含步驟a)和b)的層析流出液中的多肽的級(jí)分。在一些實(shí)施方案中，多肽是抗體或免疫粘附素。在一些實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體；例如但不限于嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是抗原結(jié)合片段；例如但不限于fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、scfv、di-scfv、bi-scfv、串聯(lián)(di,tri)-scfv、fv、sdab、三功能抗體、bite、雙抗體和三價(jià)抗體。在一些實(shí)施方案中，多肽是酶、激素、融合蛋白、含有fc的蛋白質(zhì)、免疫綴合物、細(xì)胞因子或白介素。在一些實(shí)施方案中，多肽是從包含一種或多種污染物的組合物中純化的；例如，中華倉(cāng)鼠卵巢蛋白(chop)、宿主細(xì)胞蛋白(hcp)、泄露的蛋白a、羧肽酶b、核酸、dna、產(chǎn)物變體、聚集的蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)基組分、慶大霉素、多肽片段、內(nèi)毒素和病毒性污染物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，層析材料選自混合模式材料、陰離子交換材料、疏水性相互作用材料，和親和材料。在一些實(shí)施方案中，以約層析材料對(duì)于一種或多種污染物的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量將組合物裝載到層析材料上。在一些實(shí)施方案中，多肽的層析材料的分配系數(shù)大于30或大于100。在一些實(shí)施方案中，方法提供了這樣的oec，其中洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的電導(dǎo)率的電導(dǎo)率。在其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的電導(dǎo)率的電導(dǎo)率。在一些實(shí)施方案中，方法提供了這樣的oec，其中洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的ph的ph。在其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的ph的ph。在一些實(shí)施方案中，方法的多肽在來(lái)自親和層析、陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析和疏水性相互作用層析的洗出液中。在一些實(shí)施方案中，多肽在來(lái)自蛋白a層析的洗出液中。在一些實(shí)施方案中，還通過(guò)例如病毒過(guò)濾、親和層析、陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析和/或疏水性相互作用層析進(jìn)一步純化方法的多肽。在一些實(shí)施方案中，多肽是通過(guò)例如超濾、滲濾或超濾和滲濾的組合而進(jìn)一步濃縮的。在一些實(shí)施方案中，方法的多肽還與可藥用的運(yùn)載體組合。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了在mab3的分批結(jié)合條件下，在captoadhere樹(shù)脂上的高通量篩選(hts)結(jié)果。圖1a顯示了mab3的kp常數(shù)值的等值線。圖1b顯示了在用樹(shù)脂嘗試80g/l產(chǎn)物的上清液時(shí)，mab3的實(shí)際結(jié)合容量。圖1c顯示了在用樹(shù)脂嘗試80g/l產(chǎn)物的上清液時(shí)，雜質(zhì)(宿主細(xì)胞蛋白)的實(shí)際結(jié)合容量。所有的等值線圖都是使用源自原始數(shù)據(jù)的應(yīng)答表面模型生成的。圖2顯示了優(yōu)化的oec操作模式的層析圖。用于該次運(yùn)行的mab3的裝載密度為180g/l。圖3顯示了使用mab3的oec模式的裝載優(yōu)化。圖4顯示了具有oec操作模式的靶裝載條件的層析圖。相似的裝載和洗脫條件導(dǎo)致拖尾，因而導(dǎo)致混合物體積增加了45％。用于該次運(yùn)行的mab3的裝載密度為180g/l。圖5顯示了使用mab3的oec模式的洗脫優(yōu)化。圖6顯示了級(jí)分中的雜質(zhì)分析和雜質(zhì)的累積分析。圖7顯示了在1000g/l裝載密度的oec模式下，captoadhere樹(shù)脂的mab3chop貫穿(breakthrough)分析。圖8顯示了在從70g/l至180g/l的裝載密度范圍內(nèi)試驗(yàn)性規(guī)模運(yùn)行的產(chǎn)率分析。圖9顯示了對(duì)弱分配層析操作模式和過(guò)載和洗脫層析操作模式的比較。產(chǎn)物是mab3，層析材料是captoadhere樹(shù)脂。圖10顯示了在150g/l裝載密度的oec操作模式下，qma樹(shù)脂的mab3chop分析。圖11顯示了在150g/l裝載密度的oec操作模式下，captoadhere樹(shù)脂的mab4chop分析。圖12顯示了在150g/l裝載密度的oec操作模式下，captommc樹(shù)脂的mab4chop分析。圖13顯示了在200g/l裝載密度的oec模式下，captoadhere樹(shù)脂的mab3chop貫穿分析。將mab3蛋白a混合物裝載到captoadhere樹(shù)脂上，至200g/l(超過(guò)產(chǎn)物結(jié)合容量50g/l)。chop貫穿分析顯示多至200g/lmab處理chop未貫穿。發(fā)明詳述i.定義如本文描述的術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)物”是待通過(guò)oec純化的物質(zhì)；例如，多肽。術(shù)語(yǔ)“多肽”或“蛋白質(zhì)”在本文中可互換的使用，指任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。聚合物可以是線性的或分支的，可以包含經(jīng)修飾的氨基酸，并可以被非氨基酸中斷。術(shù)語(yǔ)還涵蓋了被天然地或通過(guò)介入修飾的氨基酸聚合物；例如，形成二硫鍵、糖基化、脂化、乙?；⒘姿峄蛉魏纹渌牟僮骰蛐揎?，如與標(biāo)記組分綴合。定義還包括了例如含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本領(lǐng)域已知的其他修飾的多肽。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”具體涵蓋了抗體?！凹兓摹倍嚯?例如，抗體或免疫粘附素)意指多肽的純度增加，使所述多肽以比其在天然環(huán)境中，和/或比初始合成時(shí)，和/或比在實(shí)驗(yàn)室條件下擴(kuò)增時(shí)所存在的形式更純的形式存在。純度是一個(gè)相對(duì)的術(shù)語(yǔ)，不必然表示絕對(duì)純度。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“經(jīng)表位標(biāo)記的”指包含與“標(biāo)簽多肽”融合的多肽的嵌合多肽。標(biāo)簽多肽具有足夠多的殘基以提供可以制備抗體的表位，但也足夠短，使其不干擾與其融合的多肽的活性。標(biāo)簽多肽還優(yōu)選地相當(dāng)獨(dú)特，使抗體基本上不與其他表位交叉反應(yīng)。合適的標(biāo)簽多肽一般具有至少6個(gè)氨基酸殘基，并且通常在約8至50個(gè)氨基酸殘基之間(優(yōu)選在約10至20個(gè)氨基酸殘基之間)。用于本文目的的“活性的”或“活性”指保留了天然或天然存在的多肽的生物學(xué)和/或免疫學(xué)活性的多肽形式，其中“生物學(xué)”活性指由天然或天然存在的多肽導(dǎo)致的、除了誘導(dǎo)針對(duì)天然或天然存在的多肽具有的抗原性表位的抗體的生產(chǎn)以外的能力的生物學(xué)功能(抑制性或刺激性的)，并且“免疫學(xué)”活性指誘導(dǎo)針對(duì)天然或天然存在的多肽具有的抗原性表位的抗體的生產(chǎn)的能力。術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”使用最寬泛的含義，并且包括部分或完全阻斷、抑制或中和天然多肽的生物學(xué)活性的任何分子。類似的，術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”使用最寬泛的含義，并且包括模擬天然多肽的生物學(xué)活性的任何分子。合適的激動(dòng)劑或拮抗劑分子具體包括激動(dòng)劑或拮抗劑抗體或抗體片段、天然多肽的片段或氨基酸序列變體等。用于鑒別多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑的方法可包括將多肽與候選激動(dòng)劑或拮抗劑分子接觸，并測(cè)量通常與多肽相關(guān)的一種或多種生物學(xué)活性的可檢測(cè)的改變?！把a(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“cdc”指在存在補(bǔ)體的條件下分子裂解靶的能力。補(bǔ)體激活通路是由補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(c1q)結(jié)合與同族抗原復(fù)合的分子(例如，多肽(例如抗體))而起始的。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可以實(shí)施cdc測(cè)定法，例如，如gazzano-santoro等，j.immunol.methods202:163(1996)中所述?！敖Y(jié)合”目標(biāo)抗原(例如，腫瘤相關(guān)多肽抗原靶)的多肽是以足夠的親和力結(jié)合抗原的多肽，使得所述多肽可用作靶向表達(dá)所述抗原的細(xì)胞或組織中的診斷劑和/或治療劑，且不與其他多肽顯著地交叉反應(yīng)。在這類實(shí)施方案中，如通過(guò)熒光激活的細(xì)胞分選(facs)分析或放射性免疫沉淀(ria)所測(cè)定的，多肽與“非靶”多肽的結(jié)合程度將少于多肽與其特定靶多肽結(jié)合的約10％。關(guān)于多肽與靶分子的結(jié)合，術(shù)語(yǔ)“特異的結(jié)合”或“特異性地結(jié)合于”或特別多肽或特別多肽靶上的表位“特異性的”意指在測(cè)量上不同于非特異性的相互作用的結(jié)合。可以通過(guò)例如確定分子的結(jié)合與對(duì)照分子的結(jié)合的比較，來(lái)測(cè)量特異的結(jié)合，所述對(duì)照分子一般是不具有結(jié)合活性的結(jié)構(gòu)相似的分子。例如，可以通過(guò)與類似于靶的對(duì)照分子競(jìng)爭(zhēng)，例如，過(guò)量的未標(biāo)記的靶，來(lái)確定特異的結(jié)合。在此情況下，如果標(biāo)記的靶與探針的結(jié)合被過(guò)量的未標(biāo)記的靶競(jìng)爭(zhēng)性抑制，則表示了特異的結(jié)合。本文中的術(shù)語(yǔ)“抗體”使用最寬泛的含義，具體覆蓋了單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，和抗體片段只要其表現(xiàn)出理想的生物學(xué)活性。術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”(ig)在本文中可與抗體互換的使用?？贵w是天然存在的免疫球蛋白分子，具有全部基于免疫球蛋白折疊的可變結(jié)構(gòu)。例如，igg抗體具有通過(guò)二硫鍵合以形成功能性抗體的2條“重”鏈和2條“輕”鏈。每條重鏈和輕鏈本身包含“恒定區(qū)”(c)和“可變區(qū)”(v)。v區(qū)確定了抗體的抗原結(jié)合特異性，同時(shí)c區(qū)提供了結(jié)構(gòu)支持和與免疫效應(yīng)子的非抗原特異性相互作用中的功能。抗體或抗體的抗原結(jié)合片段的抗原結(jié)合特異性是抗體與特別抗原特異性結(jié)合的能力。通過(guò)v區(qū)的結(jié)構(gòu)特征確定抗體的抗原結(jié)合特異性。變異性并非均勻的分布在可變結(jié)構(gòu)域的110個(gè)氨基酸跨度中。相反，v區(qū)由15-30個(gè)氨基酸的被稱為框架區(qū)(fr)的相對(duì)不變的片段組成，所述框架區(qū)被每個(gè)為9-12個(gè)氨基酸長(zhǎng)的被稱為“超變區(qū)”的高度變異性的較短區(qū)域分隔開(kāi)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域每者包含4個(gè)fr，主要采用β-片層構(gòu)象，由3個(gè)超變區(qū)連接，所述超變區(qū)形成環(huán)狀連接，并且在一些情況下形成β-片層結(jié)構(gòu)的部分。每條鏈中的超變區(qū)通過(guò)fr與來(lái)自其他鏈的超變區(qū)緊密的靠在一起，對(duì)形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)作貢獻(xiàn)(參見(jiàn)kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但卻表現(xiàn)出多種效應(yīng)子功能，如抗體參與的抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(adcc)。每個(gè)v區(qū)通常包含3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(cdr，每個(gè)cdr含有“超變環(huán)”)和4個(gè)框架區(qū)?？贵w結(jié)合位點(diǎn)，以實(shí)質(zhì)的親和力與特定的理想抗原結(jié)合所必需的最小結(jié)構(gòu)單元，將因此通常包括3個(gè)cdr和至少3個(gè)、優(yōu)選4個(gè)框架區(qū)散布其中，以恰當(dāng)?shù)臉?gòu)象保持和呈遞cdr。經(jīng)典的四鏈抗體具有由配合的vh和vl結(jié)構(gòu)域定義的抗原結(jié)合位點(diǎn)。某些抗體，如駱駝和鯊魚(yú)抗體，缺少輕鏈，僅依賴于由重鏈形成的結(jié)合位點(diǎn)?？梢灾苽鋯谓Y(jié)構(gòu)域改造的免疫球蛋白，其中在缺少vh和vl之間配合的情況下，由重鏈或輕鏈單獨(dú)形成結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)“可變”指這樣的事實(shí)，即，可變結(jié)構(gòu)域的某些部分的序列在抗體之間顯著不同，并用于每個(gè)特定抗體與其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并非均勻的分布在抗體的整個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。而是集中在輕鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中被稱為超變區(qū)的3個(gè)區(qū)段中?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的更加高度保守的部分被稱為框架區(qū)(fr)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域每者包含4個(gè)fr，主要采用β-片層構(gòu)象，由3個(gè)超變區(qū)連接，所述超變區(qū)形成環(huán)狀連接，并且在一些情況下則形成β-片層結(jié)構(gòu)的部分。每條鏈中的超變區(qū)通過(guò)fr與來(lái)自其他鏈的超變區(qū)緊密的靠在一起，對(duì)形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)作貢獻(xiàn)(參見(jiàn)kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但卻表現(xiàn)出多種效應(yīng)子功能，如抗體參與的抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(adcc)。術(shù)語(yǔ)“超變區(qū)”當(dāng)用于本文中時(shí)，指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。超變區(qū)可包含來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“cdr”的氨基酸殘基(例如，大概是vl中的殘基24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)，和vh中的約31-35b(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)(kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))和/或來(lái)自“超變環(huán)”的那些殘基(例如，vl中的殘基26-32(l1)、50-52(l2)和91-96(l3)，和vh中的26-32(h1)、52a-55(h2)和96-101(h3)(chothia和leskj.mol.biol.196:901-917(1987))?！翱蚣堋被颉癴r”殘基是本文定義的超變區(qū)殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基?！翱贵w片段”包含完整抗體的部分，優(yōu)選地包含其抗原結(jié)合區(qū)。抗體片段的例子包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；雙抗體；串聯(lián)雙抗體(tadb)、線性抗體(例如，美國(guó)專利號(hào)5,641,870，實(shí)施例2；zapata等，proteineng.8(10):1057-1062(1995))；單臂抗體、單可變結(jié)構(gòu)域抗體、微抗體(minibodies)、單鏈抗體分子；由抗體片段形成的多特異性抗體(例如，包括但不限于：db-fc、tadb-fc、tadb-ch3、(scfv)4-fc、di-scfv、bi-scfv或串聯(lián)(di,tri)-scfv)；和雙特異性t細(xì)胞募召劑(bite)。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生2個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，被稱為“fab”片段，每個(gè)都具有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，和剩余的“fc”片段，該片段的名稱反映了片段易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生了具有2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并仍然能夠交聯(lián)抗原的f(ab')2片段?！癴v”是含有完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該區(qū)由處于緊密、非共價(jià)締合的1條重鏈和1條輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。在該構(gòu)象中，每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的3個(gè)超變區(qū)相互作用，在vh-vl二聚體的表面定義了抗原結(jié)合位點(diǎn)。綜上所述，6個(gè)超變區(qū)賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單可變結(jié)構(gòu)域(或僅包含抗原特異性的3個(gè)超變區(qū)的一半fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，雖然比整個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的親和力低。fab片段還含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(ch1)。fab’片段與fab片段不同，區(qū)別在于在重鏈ch1結(jié)構(gòu)域的羧基末端添加了若干殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。fab'-sh是本文中對(duì)其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基具有至少一個(gè)游離巰基的fab'的命名。f(ab')2抗體片段最初是作為之間具有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)fab'片段生產(chǎn)的?？贵w片段的其他化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。來(lái)自任何脊椎動(dòng)物的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可以分為兩類明顯不同的類型之一，稱為kappa(κ)和lambda(λ)，基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。根據(jù)其重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，抗體可以分為不同的類型。有五大類完整的抗體：iga、igd、ige、igg和igm，其中一些還進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga和iga2。對(duì)應(yīng)不同類型的抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類型的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象是普遍已知的?！皢捂渇v”或“scfv”抗體片段包含抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈中。在一些實(shí)施方案中，fv多肽還在vh和vl結(jié)構(gòu)域之間包含多肽接頭，所述多肽接頭使scfv能夠形成用于抗原結(jié)合的理想的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scfv的綜述，參見(jiàn)thepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，rosenburgandmoore編著，springer-verlag,newyork，第269-315頁(yè)(1994)中的plückthun。術(shù)語(yǔ)“雙抗體”指具有2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，所述片段包含與在同一多肽鏈中的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)相連的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)(vh-vl)。通過(guò)使用太短以至于不允許在同一鏈的2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，強(qiáng)迫結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并生成2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更詳細(xì)地描述在例如ep404,097；wo93/11161；和hollinger等，proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)中。術(shù)語(yǔ)“多特異性抗體”使用最寬泛的含義，具體覆蓋了具有多表位特異性的抗體。這類多特異性抗體包括但不限于：包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)的抗體，其中vhvl單元具有多表位特異性；具有2個(gè)或多個(gè)vl和vh結(jié)構(gòu)域的抗體，每個(gè)vhvl單元結(jié)合不同的表位；具有2個(gè)或多個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域的抗體，每個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合不同的表位；全長(zhǎng)抗體、抗體片段如fab、fv、dsfv、scfv、雙抗體、雙特異性雙抗體、三價(jià)抗體、三功能抗體、共價(jià)或非共價(jià)連接的抗體片段。“多表位特異性”指特異性結(jié)合相同或不同的靶上的兩個(gè)或多個(gè)不同的表位的能力。“單一特異性”指僅結(jié)合一個(gè)表位的能力。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，多特異性抗體是以5μm至0.001pm、3μm至0.001pm、1μm至0.001pm、0.5μm至0.001pm或0.1μm至0.001pm的親和力結(jié)合每個(gè)表位的igg抗體。表達(dá)方式“單結(jié)構(gòu)域抗體”(sdab)或“單可變結(jié)構(gòu)域(svd)抗體”一般指這樣的抗體，所述抗體中的單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(vh或vl)可以賦予抗原結(jié)合。換言之，單可變結(jié)構(gòu)域不需要為了識(shí)別靶抗原而與另一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域相互作用。單結(jié)構(gòu)域抗體的例子包括源自駱駝科動(dòng)物(羊駝和駱駝)和軟骨魚(yú)(例如護(hù)士鯊)的抗體，和通過(guò)重組方法源自人和小鼠抗體的抗體(nature(1989)341:544-546；devcompimmunol(2006)30:43-56；trendbiochemsci(2001)26:230-235；trendsbiotechnol(2003):21:484-490；wo2005/035572；wo03/035694；febslett(1994)339:285-290；wo00/29004；wo02/051870)。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”在本文中用于指從基本均質(zhì)的抗體的群體中獲得的抗體，即，構(gòu)成群體的單個(gè)抗體是相同的和/或結(jié)合相同表位，除了可能在生產(chǎn)單克隆抗體的過(guò)程中產(chǎn)生的可能的變體外，這類變體一般以少量存在。與通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制品相反，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了其特異性外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)還在于不被其他的免疫球蛋白污染。修飾語(yǔ)“單克隆”表示抗體的特征是從基本均質(zhì)的抗體群體獲得的，并不理解為要求通過(guò)任何特定的方法生產(chǎn)抗體。例如，待根據(jù)本文提供的方法使用的單克隆抗體可以通過(guò)kohler等，nature256:495(1975)首次描述的雜交瘤方法或者可以通過(guò)重組dna方法制備(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)4,816,567)。還可以使用例如clackson等，nature352:624-628(1991)和marks等，j.mol.biol.222:581-597(1991)中描述的技術(shù)，從噬菌體抗體文庫(kù)中分離“單克隆抗體”。本文中的單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分是與源自特定物種的抗體的相應(yīng)序列相同或同源的，或者屬于特定的抗體類型或亞類，而鏈的其余部分是與源自另一種物種的抗體的相應(yīng)序列相同或同源的，或者屬于另一種抗體類型或亞類，以及這類抗體的片段，只要所述片段表現(xiàn)出理想的生物學(xué)活性(美國(guó)專利號(hào)4,816,567；morrison等，proc.natl.acad.sci.usa81:6851-6855(1984))。本文中的目標(biāo)嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)類化的”抗體，所述抗體包含源自非人靈長(zhǎng)類(例如，舊世界猴，如狒狒、恒河猴或食蟹猴)的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列(美國(guó)專利號(hào)5,693,780)。非人(例如，鼠)抗體的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗體。在絕大部分情況下，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體超變區(qū)的殘基被具有理想特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)，如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類的超變區(qū)殘基取代。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(qū)(fr)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改善抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含基本上全部的至少1個(gè)，通常2個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中，所有的或基本上所有的超變環(huán)都對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的超變環(huán)，并且所有的或基本上所有的fr都是人免疫球蛋白序列的fr，除了如上述的fr取代。人源化抗體任選地還包含免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)jones等，nature321:522-525(1986)；riechmann等，nature332:323-329(1988)；和presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。出于本文的目的，“完整抗體”是包含重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域以及fc區(qū)的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如，人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選的，完整抗體具有一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)子功能?！疤烊豢贵w”通常是約150,000道爾頓的異四聚化的糖蛋白，由2條相同的輕(l)鏈和2條相同的重(h)鏈組成。每條輕鏈通過(guò)1個(gè)共價(jià)的二硫鍵與重鏈相連，而不同的免疫球蛋白同種型的重鏈之間的二硫鍵數(shù)量也不同。每條重鏈和輕鏈還具有規(guī)律間隔的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈在一個(gè)末端具有可變結(jié)構(gòu)域(vh)，之后具有多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(vl)，在另一端具有恒定結(jié)構(gòu)域；輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域與重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域?qū)R，輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域?qū)R。特定的氨基酸殘基被認(rèn)為形成了輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的界面?！奥懵兜目贵w”是未與異源分子(如細(xì)胞毒性部分或放射性標(biāo)記)綴合的抗體(如本文定義)。在一些實(shí)施方案中，抗體的“效應(yīng)子功能”指歸因于抗體的fc區(qū)(天然序列fc區(qū)或氨基酸序列變體fc區(qū))的那些生物學(xué)活性，且隨抗體同種型而不同?？贵w效應(yīng)子功能的例子包括：c1q結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體的下調(diào)。“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”和“adcc”指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，在所述反應(yīng)中，表達(dá)fc受體(fcr)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如，天然殺傷(nk)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別在靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，然后導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解。用于介導(dǎo)adcc的主要細(xì)胞，nk細(xì)胞，僅表達(dá)fcγriii，而單核細(xì)胞表達(dá)fcγri、fcγrii和fcγriii。ravetch和kinet,annu.rev.immunol9:457-92(1991)的第464頁(yè)的表3概括了在造血細(xì)胞上的fcr表達(dá)。為了評(píng)估目標(biāo)分子的adcc活性，可以實(shí)施體外adcc測(cè)定法，如美國(guó)專利號(hào)5,500,362或5,821,337所述。用于這類測(cè)定法的效應(yīng)子細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(pbmc)和天然殺傷(nk)細(xì)胞。可選的或額外的，可以在體內(nèi)評(píng)估目標(biāo)分子的adcc活性，例如在動(dòng)物模型中，如clynes等，proc.natl.acad.sci.(usa)95:652-656(1998)中公開(kāi)的動(dòng)物模型。“人效應(yīng)子細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種fcr并實(shí)施效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞至少表達(dá)fcγriii并執(zhí)行adcc效應(yīng)子功能。介導(dǎo)adcc的人白細(xì)胞的例子包括外周血單核細(xì)胞(pbmc)、天然殺傷(nk)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性t細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；pbmc和nk細(xì)胞是優(yōu)選的。術(shù)語(yǔ)“fc受體”或“fcr”用于描述與抗體的fc區(qū)結(jié)合的受體。在一些實(shí)施方案中，fcr是天然序列的人fcr。此外，優(yōu)選的fcr是結(jié)合igg抗體的fcr(γ受體)，包括fcγri、fcγrii和fcγriii亞類的受體，包括這些受體的等位變體和備選地可變剪切形式。fcγrii受體包括fcγriia(活化型受體)和fcγriib(抑制型受體)，其具有差別主要在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的類似的氨基酸序列。活化型受體fcγriia在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的激活基序(itam)。抑制型受體fcγriib在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(itim)。(參見(jiàn)annu.rev.immunol.15:203-234(1997))。ravetch和kinet,annu.rev.immunol9:457-92(1991)；capel等，immunomethods4:25-34(1994)；和dehaas等，j.lab.clin.med.126:330-41(1995)中對(duì)fcr進(jìn)行了綜述。其他fcr，包括將來(lái)待鑒定的那些，都被本文中的術(shù)語(yǔ)“fcr”涵蓋。該術(shù)語(yǔ)還包括新生兒受體fcrn，這是負(fù)責(zé)母體igg向胎兒轉(zhuǎn)移的受體(guyer等，j.immunol.117:587(1976)和kim等，j.immunol.24:249(1994))。本文使用的術(shù)語(yǔ)“順序”涉及層析時(shí)指第一層析后接第二層析。在第一層析和第二層析之間也可以包括其他步驟。本文使用的術(shù)語(yǔ)“連續(xù)”涉及層析時(shí)指具有直接相連的，或允許在兩種層析材料之間連續(xù)流動(dòng)的一些其他機(jī)制的第一層析材料和第二層析材料?！拔廴疚铩敝概c理想的多肽產(chǎn)物不同的材料。污染物包括但不限于：宿主細(xì)胞材料，如chop；泄露的蛋白a；核酸；理想多肽的變體、片段、聚集物或衍生物；另一種多肽；內(nèi)毒素；病毒性污染物；細(xì)胞培養(yǎng)基組分等。在一些例子中，污染物可以是宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(hcp)，來(lái)自例如但不限于細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、鳥(niǎo)類細(xì)胞、真菌細(xì)胞。層析材料的“動(dòng)態(tài)結(jié)合容量”是在未結(jié)合產(chǎn)物顯著的貫穿出現(xiàn)前，材料在實(shí)際的流動(dòng)條件下將要結(jié)合的產(chǎn)品(例如多肽)的量。本文使用的“分配系數(shù)”kp指產(chǎn)物(例如多肽)在靜止相中的摩爾濃度除以產(chǎn)物在移動(dòng)相中的摩爾濃度?！把b載密度”指與一定體積的層析材料(例如數(shù)升)接觸的組合物的量，例如克。在一些例子中，裝載密度用g/l表示。本文中提及“約”一定數(shù)值或參數(shù)時(shí)，包括(描述了)對(duì)于數(shù)值或參數(shù)本身的變異。例如，涉及“約x”的描述包括了對(duì)“x”的描述。如本文和所附權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式“a”或“the”包括了復(fù)數(shù)指代，除非語(yǔ)境中另外明確指出。應(yīng)理解，本文描述的本發(fā)明的方面和變異包括了“由方面和變異組成”和/或“基本由方面和變異組成”。ii.純化方法本文提供了使用過(guò)載和洗脫層析(oec)從包含產(chǎn)物和至少一種污染物的組合物中純化產(chǎn)物(如多肽)的方法。oec提供了這樣的操作模式，其中在單種層析模式中實(shí)現(xiàn)不同的層析模式提供的好處。oec可以在多種樹(shù)脂上執(zhí)行，同時(shí)提供增強(qiáng)的雜質(zhì)去除和顯著的生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)，如更小的柱體積，更好的設(shè)備適合度和更低的成本。oec的操作模式可以分解為3種不同的組分。1.過(guò)載–將組合物裝載到層析材料上，使產(chǎn)物(如多肽)裝載到層析材料上的量超過(guò)材料對(duì)于產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量(dbc)。在一些實(shí)施方案中，確定雜質(zhì)與層析材料強(qiáng)烈結(jié)合的裝載條件，如ph和電導(dǎo)率。在一些實(shí)施方案中，選擇層析條件，使得即使產(chǎn)物貫穿，絕大多數(shù)，如果不是所有的雜質(zhì)不貫穿。在一些實(shí)施方案中，組合物的裝載量是或者接近材料對(duì)于一種或多種污染物的dbc。過(guò)載模式允許所利用的層析材料超過(guò)材料對(duì)于產(chǎn)物的典型dbc。2.混合–洗脫液中的產(chǎn)物，如多肽的混合開(kāi)始于產(chǎn)物貫穿。由于裝載條件是使雜質(zhì)在貫穿期間繼續(xù)結(jié)合，因此可以在層析的裝載階段在洗脫液中獲得清潔的產(chǎn)物混合物。3.洗脫–在結(jié)束將組合物裝載到層析材料后，使用經(jīng)鑒別的洗脫條件，從層析材料上洗脫產(chǎn)物(如多肽)，所述洗脫條件使得洗脫結(jié)合的產(chǎn)物，同時(shí)大部分的雜質(zhì)仍然與層析材料結(jié)合。在一些方面，oec顯著增加層析材料利用，超過(guò)材料對(duì)于產(chǎn)物的dbc，從而提供相比其他層析方法的好處。例如，高10倍的層析材料利用可以導(dǎo)致顯著更低的成本。與其中優(yōu)化層析材料的裝載以最大化產(chǎn)物(如多肽)與層析樹(shù)脂的結(jié)合的傳統(tǒng)的結(jié)合和洗脫層析不同，可以優(yōu)化oec裝載條件以最大化污染物與層析材料的結(jié)合而并非產(chǎn)物與層析材料的結(jié)合。在一些方面，向?qū)游霾牧涎b載的組合物的量超過(guò)層析材料對(duì)于多肽的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量。在裝載層析材料的過(guò)程中，一些產(chǎn)物將在洗滌中貫穿，而一些產(chǎn)物仍然與層析材料結(jié)合。在結(jié)束裝載后，可以從層析材料中洗脫與層析材料結(jié)合的剩余產(chǎn)物。在一些上述實(shí)施方案中，層析材料是層析柱。在一些上述實(shí)施方案中，層析材料是層析膜。在本發(fā)明的一些方面，以約層析材料對(duì)組合物中的一種或多種污染物的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量將組合物裝載到層析材料上。在一些實(shí)施方案中，以超過(guò)層析材料對(duì)產(chǎn)物的結(jié)合容量的量將組合物裝載到層析材料上。在一些實(shí)施方案中，以約層析材料對(duì)一種或多種污染物的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量并超過(guò)層析材料對(duì)產(chǎn)物的結(jié)合容量將組合物裝載到層析材料上。在一些實(shí)施方案中，以層析材料對(duì)產(chǎn)物的dbc的20倍將組合物裝載到層析材料上。在一些實(shí)施方案中，以層析材料對(duì)產(chǎn)物的dbc的100倍將組合物裝載到層析材料上。在一些實(shí)施方案中，以約層析材料對(duì)組合物中的所有污染物的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量將組合物裝載到層析材料上。在一些實(shí)施方案中，以約層析材料對(duì)組合物中的所有污染物的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量并超過(guò)層析材料對(duì)產(chǎn)物的結(jié)合容量將組合物裝載到層析材料上。在一些實(shí)施方案中，以少于層析材料對(duì)所有污染物的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量并超過(guò)層析材料對(duì)產(chǎn)物的結(jié)合容量將組合物裝載到層析材料上。在一些上述實(shí)施方案中，層析材料位于層析柱中。在一些實(shí)施方案中，層析柱是工業(yè)規(guī)模的層析柱。在一些上述實(shí)施方案中，層析材料是層析膜?？梢酝ㄟ^(guò)確定特定層析材料的產(chǎn)物或污染物的分配系數(shù)(kp)作為ph和反離子濃度的函數(shù)，估算層析材料對(duì)產(chǎn)物和一種或多種污染物的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量。例如，可以確定層析材料(例如混合模式樹(shù)脂)對(duì)多肽的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量?？梢酝ㄟ^(guò)用過(guò)量的產(chǎn)物和/或污染物挑戰(zhàn)結(jié)合，確定在具體的ph和反離子濃度組合條件下，層析材料對(duì)產(chǎn)物或污染物的實(shí)際結(jié)合容量。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)產(chǎn)物(例如多肽)的kp大于約30時(shí)實(shí)施oec。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)產(chǎn)物的kp大于約50時(shí)實(shí)施oec。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)產(chǎn)物的kp大于約75時(shí)實(shí)施oec。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)產(chǎn)物的kp大于約100時(shí)實(shí)施oec?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)量特定層析材料在不同的ph和反離子濃度下的kp和動(dòng)態(tài)結(jié)合容量，確定包含產(chǎn)物(如多肽)和污染物的特定組合物的oec條件。可以進(jìn)行高通量篩選以確定這樣的oec條件，其中污染物結(jié)合高且可以在不洗脫絕大部分如果不是全部的污染物的條件下洗脫產(chǎn)物。例如，可以在高通量系統(tǒng)中，在多種ph和反離子濃度的緩沖液中孵育組合物與層析材料；例如在多孔板的孔中。在孵育期之后，分離層析材料和上清液，確定上清液中的產(chǎn)物或污染物的量。在一些實(shí)施方案中，使用低濃度的組合物確定kp。在一些實(shí)施方案中，使用高濃度的組合物確定動(dòng)態(tài)結(jié)合容量。除了提供關(guān)于層析材料對(duì)特定產(chǎn)物和污染物的kp和動(dòng)態(tài)結(jié)合容量的信息外，高通量篩選在ph和反離子濃度方面對(duì)于裝載和洗脫條件提供了指導(dǎo)。例如，在一些實(shí)施方案中，通過(guò)高通量篩選選擇裝載緩沖液的ph和反離子濃度，使污染物與層析材料的結(jié)合最大化，也還使洗出液中的產(chǎn)物(例如多肽)量最大化，同時(shí)使洗出液中的污染物，例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的量最小化。在一些實(shí)施方案中，在通過(guò)高通量篩選確定的ph和電導(dǎo)率下，將組合物裝載到層析材料上，其中組合物中約所有的污染物都結(jié)合在層析材料上。在一些實(shí)施方案中，在通過(guò)高通量篩選確定的ph和電導(dǎo)率下，從層析材料上洗脫產(chǎn)物，其中從層析材料上洗脫了約所有的產(chǎn)物，而約所有的污染物仍然結(jié)合在層析材料上。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了(例如，通過(guò)使用高通量篩選技術(shù))用于鑒別操作條件的方法，所述操作條件導(dǎo)致層析材料結(jié)合最大量的污染物，而不論每ml層析材料結(jié)合的產(chǎn)物的量。篩選步驟用于鑒別這樣的洗脫條件，所述洗脫條件使結(jié)合的產(chǎn)物從層析材料上洗脫而雜質(zhì)仍然與層析材料緊密結(jié)合。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，層析材料是包含能夠進(jìn)行一種或多種下列功能的官能團(tuán)的混合模式材料：陰離子交換、陽(yáng)離子交換、形成氫鍵和疏水性相互作用。在一些實(shí)施方案中，混合模式材料包含能夠進(jìn)行陰離子交換和疏水性相互作用的官能團(tuán)。混合模式材料可含有n-苯甲基-n-甲基乙醇胺、4-巰基-乙基-吡啶,己胺或苯丙胺作為配體，或含有交聯(lián)的聚丙烯胺?；旌夏Ｊ讲牧系睦影╟aptoadhere樹(shù)脂、qma樹(shù)脂、captommc樹(shù)脂、mephypercel樹(shù)脂、heahypercel樹(shù)脂、ppahypercel樹(shù)脂或chromasorb膜或sartobindstic。在一些實(shí)施方案中，混合模式材料是captoadhere樹(shù)脂。在一些上述實(shí)施方案中，混合模式材料是混合模式層析柱。在一些上述實(shí)施方案中，混合模式材料是混合模式膜。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，層析材料是離子交換層析材料；例如，陰離子交換層析材料或陽(yáng)離子交換層析材料。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，層析材料是陰離子交換材料。在一些實(shí)施方案中，陰離子交換層析材料是帶正電且具有用于交換流過(guò)或流通固相的含水溶液中的陰離子的自由的陰離子的固相。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，陰離子交換材料可以是膜、棒狀或樹(shù)脂。在一個(gè)實(shí)施方案中，陰離子交換材料可以是樹(shù)脂。在一些實(shí)施方案中，陰離子交換材料可包含伯胺、仲銨、叔胺或季銨離子官能團(tuán)、多胺官能團(tuán)或二乙氨乙基官能團(tuán)。在一些上述實(shí)施方案中，陰離子交換層析材料是陰離子交換層析柱。在一些上述實(shí)施方案中，陰離子交換層析材料是陰離子交換層析膜。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，層析材料是陽(yáng)離子交換材料。在一些實(shí)施方案中，陽(yáng)離子交換材料是帶負(fù)電且具有用于交換流過(guò)或流通固相的含水溶液中的陽(yáng)離子的自由的陽(yáng)離子的固相。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，陽(yáng)離子交換材料可以是膜、棒狀或樹(shù)脂。在一些實(shí)施方案中，陽(yáng)離子交換材料可以是樹(shù)脂。陽(yáng)離子交換材料可包含羧酸官能團(tuán)或磺酸官能團(tuán)，例如但不限于磺酸鹽、羧酸、羧甲基磺酸、磺異丁基、磺乙基、羧基、磺丙基、磺?；⒒茄跻一蛘姿猁}。在一些上述實(shí)施方案中，陽(yáng)離子交換層析材料是陽(yáng)離子交換層析柱。在一些上述實(shí)施方案中，陽(yáng)離子交換層析材料是陽(yáng)離子交換層析膜。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，層析材料不是陽(yáng)離子交換層析材料。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，離子交換材料可利用常規(guī)的層析材料或?qū)α鞯膶游霾牧?。常?guī)的層析材料包括例如：灌注性材料(例如，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)樹(shù)脂)和擴(kuò)散性材料(例如，交聯(lián)的瓊脂糖樹(shù)脂)。在一些實(shí)施方案中，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)樹(shù)脂可以是poros樹(shù)脂。在一些實(shí)施方案中，交聯(lián)的瓊脂糖樹(shù)脂可以是磺丙基-sepharosefastflow(spsff)樹(shù)脂。對(duì)流層析材料可以是膜(例如，聚醚砜)或棒狀材料(例如，交聯(lián)的聚合物)。聚醚砜膜可以是mustang。交聯(lián)的聚合物棒狀材料可以是交聯(lián)的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯-二甲基丙烯酸乙二醇酯共聚物。陰離子交換材料的例子是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于：poroshq50、porospi50、porosd、mustangq、qsepharoseff和deaesepharose。陽(yáng)離子交換材料的例子是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于：mustangs、sartobinds、so3monolith、sceramichyperd、porosxs、poroshs50、poroshs20、spsff、sp-sepharosexl(spxl)、cmsepharosefastflow、captos、fractogelsehicap、fractogelso3或fractogelcoo。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，陽(yáng)離子交換材料是poroshs50。在一些實(shí)施方案中，poroshs樹(shù)脂可以是poroshs50μm或poroshs20μm顆粒。在本發(fā)明的一些方面，層析材料是疏水性相互作用層析材料。疏水性相互作用層析(hic)是液相層析技術(shù)，其根據(jù)疏水性分離生物分子。hic層析材料的例子包括但不限于：toyopearlhexyl650、toyopearbutyl650、toyopearlphenyl650、toyopearlether650、source、resource、sepharosehi-trap、octylsepharose、phenylsepharose。在一些上述實(shí)施方案中，hic層析材料是hic層析柱。在一些上述實(shí)施方案中，hic層析材料是hic層析膜。在本發(fā)明的一些方面，層析材料是羥磷灰石(hap)層析材料。羥磷灰石層析材料的例子包括但不限于haultrogel和cht羥磷灰石。在一些上述實(shí)施方案中，hap層析材料是hap層析柱。在一些上述實(shí)施方案中，hap層析材料是hap層析膜。在本發(fā)明的一些方面，層析材料是親和層析材料。親和層析材料的例子包括但不限于用蛋白a或蛋白g衍生的層析材料。親和層析材料的例子包括但不限于：prosep-va、prosep-vaultraplus、proteinasepharosefastflow、tyopearlproteina、mabselect、mabselectsure和mabselectsurelx。在一些上述實(shí)施方案中，親和層析材料是親和層析柱。在一些上述實(shí)施方案中，親和層析材料是親和層析膜?？梢詢?yōu)化組合物在層析材料上的裝載，用于通過(guò)oec分離產(chǎn)物和污染物。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)物是多肽。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)化組合物在層析材料上的裝載，用于污染物與層析材料的結(jié)合。例如，可以在多種不同的ph的裝載緩沖液中，將組合物裝載到層析材料(例如層析柱)上，而裝載緩沖液的電導(dǎo)率是恒定的。可選的，可以在多種不同的電導(dǎo)率的裝載緩沖液中，將組合物裝載到層析材料上，而裝載緩沖液的ph是恒定的。在結(jié)束將組合物裝載到層析材料上和從層析材料上洗脫產(chǎn)物至混合級(jí)分中之后，混合級(jí)分中的污染物的量提供了關(guān)于對(duì)于給定的ph或電導(dǎo)率的產(chǎn)物和污染物的分離的信息。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，以大于約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l、2000g/l或5000g/l層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到層析材料上。在一些實(shí)施方案中，以約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l或2000g/l層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到層析材料上?？梢约s30g/l和2000g/l之間、30g/l和1000g/l之間、30g/l和200g/l之間、30g/l和180g/l之間、50g/l和2000g/l之間、50g/l和1000g/l之間、50g/l和200g/l之間、50g/l和180g/l之間、150g/l和2000g/l之間、150g/l和1500g/l之間、150g/l和1000g/l之間、200g/l和1000g/l之間、200g/l和1500g/l之間、300g/l和1500g/l之間、400g/l和1000g/l之間或500g/l和1000g/l之間的層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到層析材料上。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，以大于約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l、2000g/l或5000g/l混合模式層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到混合模式層析材料上。在一些實(shí)施方案中，以約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l或2000g/l混合模式層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到混合模式層析材料上?？梢约s30g/l和2000g/l之間、30g/l和1000g/l之間、30g/l和200g/l之間、30g/l和180g/l之間、50g/l和2000g/l之間、50g/l和1000g/l之間、50g/l和200g/l之間、50g/l和180g/l之間、150g/l和2000g/l之間、150g/l和1500g/l之間、150g/l和1000g/l之間、200g/l和1000g/l之間、200g/l和1500g/l之間、300g/l和1500g/l之間、400g/l和1000g/l之間或500g/l和1000g/l之間的混合模式層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到混合模式層析材料上。在一些實(shí)施方案中，以70g/l至180g/l的密度將多肽裝載到層析材料上。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，混合模式層析是captoadhere樹(shù)脂。在一些實(shí)施方案中，以70g/l至180g/l的密度將多肽裝載到captoadhere層析材料上。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，多肽是抗體或其片段。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，以大于約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l、2000g/l或5000g/l陰離子交換層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到陰離子交換層析材料上。在一些實(shí)施方案中，以約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l或2000g/l陰離子交換層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到陰離子交換層析材料上?？梢约s30g/l和2000g/l之間、30g/l和1000g/l之間、30g/l和200g/l之間、30g/l和180g/l之間、50g/l和2000g/l之間、50g/l和1000g/l之間、50g/l和200g/l之間、50g/l和180g/l之間、150g/l和2000g/l之間、150g/l和1500g/l之間、150g/l和1000g/l之間、200g/l和1000g/l之間、200g/l和1500g/l之間、300g/l和1500g/l之間、400g/l和1000g/l之間或500g/l和1000g/l之間的陰離子交換層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到陰離子交換層析材料上。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，以大于約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l、2000g/l或5000g/l陽(yáng)離子交換層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到陽(yáng)離子交換層析材料上。在一些實(shí)施方案中，以約30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l、110g/l、120g/l、130g/l、140g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、300g/l、400g/l、500g/l、550g/l、600g/l、650g/l、700g/l、800g/l、900g/l、1000g/l或2000g/l陽(yáng)離子交換層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到陽(yáng)離子交換層析材料上。可以約30g/l和2000g/l之間、30g/l和1000g/l之間、30g/l和200g/l之間、30g/l和180g/l之間、50g/l和2000g/l之間、50g/l和1000g/l之間、50g/l和200g/l之間、50g/l和180g/l之間、150g/l和2000g/l之間、150g/l和1500g/l之間、150g/l和1000g/l之間、200g/l和1000g/l之間、200g/l和1500g/l之間、300g/l和1500g/l之間、400g/l和1000g/l之間或500g/l和1000g/l之間的陽(yáng)離子交換層析材料中的任一的多肽的裝載密度將組合物裝載到陽(yáng)離子交換層析材料上。上述方法還可以包括裝載到蛋白a親和層析材料的步驟。在一些實(shí)施方案中，多肽產(chǎn)物是在oec之前首先通過(guò)蛋白a親和層析純化的抗體或其片段。裝載到蛋白a親和層析材料的步驟一般但不必需是在其他層析步驟之前實(shí)施的。在一些實(shí)施方案中，裝載到蛋白a親和層析材料的步驟可以與過(guò)載的交換和洗脫層析的順序步驟組合。在一些實(shí)施方案中，順序步驟是連續(xù)的。在一些實(shí)施方案中，連續(xù)純化使用相同的流速、電導(dǎo)率和/或ph?？梢詢?yōu)化在oec模式下產(chǎn)物(如多肽)從層析材料上的洗脫，用于產(chǎn)生具有最少污染物和處于最小混合體積的產(chǎn)物。例如，可以在裝載緩沖液中將組合物裝載到層析材料(例如層析柱)上。在結(jié)束裝載后，可以在多種不同ph的緩沖液中洗脫產(chǎn)物，而洗脫緩沖液的電導(dǎo)率是恒定的。可選的，可以在多種不同電導(dǎo)率的緩沖液中洗脫產(chǎn)物，而洗脫緩沖液的ph是恒定的。在結(jié)束從層析材料上洗脫產(chǎn)物之后，混合級(jí)分中的污染物的量提供了關(guān)于對(duì)于給定的ph或電導(dǎo)率的產(chǎn)物和污染物的分離信息。大數(shù)量的級(jí)分(例如，8倍柱體積)的產(chǎn)物洗脫表示洗脫譜“拖尾”。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使洗脫拖尾最小化。可以根據(jù)例如緩沖液的理想ph、緩沖液的理想電導(dǎo)率、目標(biāo)蛋白質(zhì)的特征和純化方法，使用多種緩沖液。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，方法包括使用緩沖液。緩沖液可以是裝載緩沖液、平衡緩沖液或洗滌緩沖液。在一些實(shí)施方案中，裝載緩沖液、平衡緩沖液和/或洗滌緩沖液中的一種或多種是相同的。在一些實(shí)施方案中，裝載緩沖液、平衡緩沖液和/或洗滌緩沖液是不同的。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，緩沖液包含鹽。裝載緩沖液可包含氯化鈉、醋酸鈉或其混合物。在一些實(shí)施方案中，裝載緩沖液是氯化鈉緩沖液。在一些實(shí)施方案中，裝載緩沖液是醋酸鈉緩沖液。本文使用的裝載是將組合物裝載到層析材料上。裝載緩沖液是用于將包含目標(biāo)產(chǎn)物的組合物裝載到層析材料上的緩沖液。可以在裝載待純化的組合物之前，用平衡緩沖液平衡層析材料。在一些例子中，在將組合物裝載到層析材料上之后和從固相上洗脫目標(biāo)多肽之前，使用洗滌緩沖液。然而，可以通過(guò)洗滌緩沖液從層析材料上去除一些目標(biāo)產(chǎn)物(例如多肽)(例如，與流通型模式相似)。本文使用的洗脫是從層析材料上去除產(chǎn)物(例如多肽)。洗脫緩沖液是用于從層析材料上洗脫多肽或其他目標(biāo)產(chǎn)物的緩沖液。在許多情況下，洗脫緩沖液具有不同于裝載緩沖液的物理特征。例如，洗脫緩沖液可具有不同于裝載緩沖液的電導(dǎo)率或不同于裝載緩沖液的ph。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有低于裝載緩沖液的電導(dǎo)率。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有高于裝載緩沖液的電導(dǎo)率。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有低于裝載緩沖液的ph。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有高于裝載緩沖液的ph。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有不同于裝載緩沖液的電導(dǎo)率和ph。洗脫緩沖液可以具有更高或更低電導(dǎo)率和更高或更低ph的任意組合。電導(dǎo)率指含水溶液在兩個(gè)電極之間傳導(dǎo)電流的能力。在溶液中，電流通過(guò)離子運(yùn)輸而流動(dòng)。因此，伴隨含水溶液中存在的離子量增加，溶液將具有更高的電導(dǎo)率。測(cè)量電導(dǎo)率的基礎(chǔ)單位是siemen(或姆歐)、姆歐(ms/cm)，可以使用電導(dǎo)儀測(cè)量，如多種模型的orion電導(dǎo)儀。由于電解電導(dǎo)率是溶液中的離子攜帶電流的容量，因此可以通過(guò)改變其中的離子濃度改變?nèi)芤旱碾妼?dǎo)率。例如，可以改變?nèi)芤褐械木彌_劑濃度和/或鹽(例如，氯化鈉、醋酸鈉或氯化鉀)濃度以獲得理想的電導(dǎo)率。優(yōu)選地，修飾多種緩沖液的鹽濃度來(lái)獲得理想的電導(dǎo)率。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，裝載緩沖液具有大于約4.0ms/cm、4.5ms/cm、5.0ms/cm、5.5ms/cm、6.0ms/cm、6.5ms/cm、7.0ms/cm、7.5ms/cm、8.0ms/cm、8.5ms/cm、9.0ms/cm、9.5ms/cm或10ms/cm中的任一的電導(dǎo)率。電導(dǎo)率可以在約4ms/cm和17ms/cm之間、4ms/cm和10ms/cm之間、4ms/cm和7ms/cm之間、5ms/cm和17ms/cm之間、5ms/cm和10ms/cm之間或5ms/cm和7ms/cm之間中的任一。在一些實(shí)施方案中，電導(dǎo)率是約4ms/cm、4.5ms/cm、5.0ms/cm、5.5ms/cm、6.0ms/cm、6.5ms/cm、7.0ms/cm、7.5ms/cm、8.0ms/cm、8.5ms/cm、9.0ms/cm、9.5ms/cm或10ms/cm中的任一。在一個(gè)方面，電導(dǎo)率是裝載緩沖液、平衡緩沖液和/或洗滌緩沖液的電導(dǎo)率。在一些實(shí)施方案中，裝載緩沖液、平衡緩沖液和洗滌緩沖液中的一種或多種的電導(dǎo)率是相同的。在一些實(shí)施方案中，裝載緩沖液的電導(dǎo)率不同于洗滌緩沖液和/或平衡緩沖液的電導(dǎo)率。在一些實(shí)施方案中，在具有約5.5ms/cm的電導(dǎo)率的緩沖液中，將組合物裝載到混合模式層析材料上。在一些實(shí)施方案中，多肽是抗體或其片段。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的電導(dǎo)率的電導(dǎo)率。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有小于約0.0ms/cm、0.5ms/cm、1.0ms/cm、1.5ms/cm、2.0ms/cm、2.5ms/cm、3.0ms/cm、3.5ms/cm、4.0ms/cm、4.5ms/cm、5.0ms/cm、5.5ms/cm、6.0ms/cm、6.5ms/cm或7.0ms/cm中的任一的電導(dǎo)率。電導(dǎo)率可以在約0ms/cm和7ms/cm之間、1ms/cm和7ms/cm之間、2ms/cm和7ms/cm之間、3ms/cm和7ms/cm之間或4ms/cm和7ms/cm之間、0ms/cm和5.0ms/cm之間、1ms/cm和5ms/cm之間、2ms/cm和5ms/cm之間、3ms/cm和5ms/cm之間或4ms/cm和5ms/cm之間中的任一。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的電導(dǎo)率是約0.0ms/cm、0.5ms/cm、1.0ms/cm、1.5ms/cm、2.0ms/cm、2.5ms/cm、3.0ms/cm、3.5ms/cm、4ms/cm、4.5ms/cm、5.0ms/cm、5.5ms/cm、6.0ms/cm、6.5ms/cm或7.0ms/cm中的任一。在一些實(shí)施方案中，上述洗脫緩沖液用于混合模式oec、陰離子交換oec、陽(yáng)離子交換oec、親和oec或hicoec。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的電導(dǎo)率的電導(dǎo)率。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有大于約5.5ms/cm、6.0ms/cm、6.5ms/cm、7.0ms/cm、7.5ms/cm、8.0ms/cm、8.5ms/cm、9.0ms/cm、9.5ms/cm、10ms/cm、11ms/cm、12ms/cm、13ms/cm、14ms/cm、15ms/cm、16ms/cm、17.0ms/cm、18.0ms/cm、19.0ms/cm、20.0ms/cm、21.0ms/cm、22.0ms/cm、23.0ms/cm、24.0ms/cm或25.0ms/cm中的任一的電導(dǎo)率。電導(dǎo)率可以在約5.5ms/cm和17ms/cm之間、6.0ms/cm和17ms/cm之間、7ms/cm和17ms/cm之間、8ms/cm和17ms/cm之間、9ms/cm和17ms/cm之間或10ms/cm和17ms/cm之間中的任一。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的電導(dǎo)率是約5.5ms/cm、6.0ms/cm、6.5ms/cm、7.0ms/cm、7.5ms/cm、8.0ms/cm、8.5ms/cm、9.0ms/cm、9.5ms/cm、10ms/cm、11ms/cm、12ms/cm、13ms/cm、14ms/cm、15ms/cm、16ms/cm或17.0ms/cm中的任一。在一些實(shí)施方案中，上述洗脫緩沖液用于混合模式oec、陰離子交換oec、陽(yáng)離子交換oec、親和oec或hicoec。在一些實(shí)施方案中，在約4至約1ms/cm的電導(dǎo)率中，從混合模式層析上洗脫多肽。在一些實(shí)施方案中，在約4至約1ms/cm的電導(dǎo)率中，從captoadhere層析上洗脫多肽。在一些實(shí)施方案中，在約4ms/cm至約1ms/cm的電導(dǎo)率中，從captoadhere層析上洗脫抗體或其片段。在任何上述實(shí)施方案的一些方面，通過(guò)階梯梯度或線性梯度，洗脫緩沖液的電導(dǎo)率改變自裝載和/或洗滌緩沖液的電導(dǎo)率。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在具有約5.5ms/cm電導(dǎo)率的緩沖液中，將包含多肽的組合物裝載到層析材料上，并在具有約4ms/cm電導(dǎo)率的洗脫緩沖液中從層析材料上洗脫多肽。在一些實(shí)施方案中，裝載緩沖液具有約5.5ms/cm的電導(dǎo)率并且洗脫緩沖液具有約3ms/cm的電導(dǎo)率。在一些實(shí)施方案中，裝載緩沖液具有約5.5ms/cm的電導(dǎo)率并且洗脫緩沖液具有約2ms/cm的電導(dǎo)率。在一些實(shí)施方案中，裝載緩沖液具有約5.5ms/cm的電導(dǎo)率并且洗脫緩沖液具有約1ms/cm的電導(dǎo)率。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，層析材料是captoadhere樹(shù)脂。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，多肽是抗體或其片段。在任何上述實(shí)施方案的一些方面，通過(guò)階梯梯度或通過(guò)線性梯度，洗脫緩沖液的電導(dǎo)率改變自裝載和/或洗滌緩沖液的電導(dǎo)率。在一些實(shí)施方案中，在約5.5ms/cm將包含多肽的組合物裝載到captoadhere層析上，并通過(guò)從約5.5ms/cm至約1ms/cm的線性電導(dǎo)率梯度在約5倍柱體積(cv)中從captoadhere層析上洗脫目標(biāo)多肽。在一些實(shí)施方案中，在約5.5ms/cm將包含多肽的組合物裝載到captoadhere層析上，并通過(guò)從約5.5ms/cm至約1ms/cm的線性電導(dǎo)率梯度在10.0cv中從captoadhere層析上洗脫目標(biāo)多肽。在一些實(shí)施方案中，在約10ms/cm將包含多肽的組合物裝載到captoadhere層析上，并通過(guò)從約10.0ms/cm至約1ms/cm的線性電導(dǎo)率梯度在約5cv中從captoadhere層析上洗脫目標(biāo)多肽。在一些實(shí)施方案中，在約10ms/cm將包含多肽的組合物裝載到captoadhere層析上，并通過(guò)從約10.0ms/cm至約1ms/cm的線性電導(dǎo)率梯度在約10cv中從captoadhere層析上洗脫目標(biāo)多肽。在一些實(shí)施方案中，在約10ms/cm將包含多肽的組合物裝載到captoadhere層析上，并通過(guò)從約10.0ms/cm至約1ms/cm的線性電導(dǎo)率梯度在約15cv中從captoadhere層析上洗脫目標(biāo)多肽。在任何上述實(shí)施方案的一些方面，通過(guò)階梯梯度或通過(guò)線性梯度，洗脫緩沖液的電導(dǎo)率改變自裝載和/或洗滌緩沖液的電導(dǎo)率。在一些實(shí)施方案中，在約5.5ms/cm將包含多肽的組合物裝載到層析材料上，并通過(guò)在5.5ms/cm至1ms/cm之間的線性電導(dǎo)率梯度在5倍柱體積中，5.5ms/cm至1ms/cm在10倍柱體積中，從層析材料上洗脫目標(biāo)多肽。在一些實(shí)施方案中，在約10ms/cm將包含多肽的組合物裝載到層析材料上，并通過(guò)在10.0ms/cm至1ms/cm之間的線性電導(dǎo)率梯度在5倍柱體積中，10.0ms/cm至約1ms/cm在10倍柱體積中，10.0ms/cm至1ms/cm在15倍柱體積中，從層析材料上洗脫目標(biāo)多肽。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，裝載緩沖液具有小于約10、9、8、7、6或5中任一的ph。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，裝載緩沖液具有大于約4、5、6、7、8或9中任一的ph。裝載緩沖液可具有在約4和9之間、4和8之間、4和7之間、5和9之間、5和8之間、5和7之間、5和6之間中任一的ph。在一些實(shí)施方案中，裝載緩沖液的ph是約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8中的任一。ph可以是裝載緩沖液、平衡緩沖液或洗滌緩沖液的ph。在一些實(shí)施方案中，裝載緩沖液、平衡緩沖液和/或洗滌緩沖液中的一種或多種的ph是相同的。在一些實(shí)施方案中，裝載緩沖液的ph不同于平衡緩沖液和/或洗滌緩沖液的ph。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的ph的ph。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有小于約8、7、6、5、4、3或2中的任一的ph。洗脫緩沖液的ph可以是在約4和9之間、4和8之間、4和7之間、4和6之間、4和5之間、5和9之間、5和8之間、5和7之間、5和6之間、6和9之間、6和8之間、6和7之間中的任一。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的ph是約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0中的任一。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的ph的ph。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有大于約5、6、7、8或9中的任一的ph。洗脫緩沖液的ph可以是在約4和9之間、5和9之間、6和9之間、7和9之間、8和9之間、4和8之間、5和8之間、6和8之間、7和8之間、4和7之間、5和7之間，和6和7之間中的任一。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的ph是約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0中的任一。在任何上述實(shí)施方案的一些方面，通過(guò)階梯梯度或線性梯度，洗脫緩沖液的ph改變自裝載和/或洗滌緩沖液的ph。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，流速小于約50cv/hr、40cv/hr或30cv/hr中的任一。流速可以是在約5cv/hr和50cv/hr之間、10cv/hr和40cv/hr之間，或18cv/hr和36cv/hr之間中的任一。在一些實(shí)施方案中，流速是約9cv/hr、18cv/hr、25cv/hr、30cv/hr、36cv/hr或40cv/hr中的任一。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，流速小于約100cm/hr、75cm/hr或50cm/hr中的任一。流速可以是在約25cm/hr和150cm/hr之間、25cm/hr和100cm/hr之間、50cm/hr和100cm/hr之間或65cm/hr和85cm/hr之間中的任一。床高度是所使用的層析材料的高度。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，床高度大于約3cm、10cm或15cm中的任一。床高度可以是在約3cm和35cm之間、5cm和15cm之間、3cm和10cm之間，或5cm和8cm之間中的任一。在一些實(shí)施方案中，床高度是約3cm、5cm、10cm，或15cm中的任一。在一些實(shí)施方案中，床高度是基于負(fù)載中的多肽或污染物的量決定的。在一些實(shí)施方案中，層析是在具有大于約1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、40ml、50ml、75ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml、800ml、900ml、1l、2l、3l、4l、5l、6l、7l、8l、9l、10l、25l、50l、100l、200l、300l、400l、500l、600l、700l、800l、900l或100l的體積的容器柱中。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，從層析中收集級(jí)分。在一些實(shí)施方案中，收集的級(jí)分大于約0.01cv、0.02cv、0.03cv、0.04cv、0.05cv、0.06cv、0.07cv、0.08cv、0.09cv、0.1cv、0.2cv、0.3cv、0.4cv、0.5cv、0.6cv、0.7cv、0.8cv、0.9cv、1.0cv、2.0cv、3.0cv、4.0cv、5.0cv、6.0cv、7.0cv、8.0cv、9.0cv或10.0cv。在一些實(shí)施方案中，混合含有產(chǎn)物(例如多肽)的級(jí)分。在一些實(shí)施方案中，混合含有來(lái)自負(fù)載級(jí)分和來(lái)自洗脫級(jí)分的多肽的級(jí)分。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定級(jí)分中的多肽的量；例如，可以通過(guò)uv光譜確定級(jí)分中的多肽的量。在一些實(shí)施方案中，混合含有可檢測(cè)的多肽片段的級(jí)分。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，至少一種污染物是宿主細(xì)胞材料，如chop；泄露的蛋白a；核酸；理想多肽的變體、片段、聚集物或衍生物；另一種多肽；內(nèi)毒素；病毒性污染物；細(xì)胞培養(yǎng)基組分、羧肽酶b、慶大霉素等中的任何一種或多種。在一些例子中，污染物可以是來(lái)自例如但不限于細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、鳥(niǎo)類細(xì)胞、真菌細(xì)胞的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(hcp)。宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(hcp)是來(lái)自生產(chǎn)多肽的細(xì)胞的蛋白質(zhì)。例如，chop是來(lái)自宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)，即，中華倉(cāng)鼠卵巢蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(“elisa”)或mesoscalediscovery(“mso”)測(cè)量chop的量。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，hcp(例如，chop)的量降低大于約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一。hcp的量可以降低約10％和99％之間、30％和95％之間,30％和99％之間、50％和95％之間,50％和99％之間、75％和99％之間，或85％和99％之間中的任一。在一些實(shí)施方案中，hcp的量可以降低約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或98％中的任一。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從(一個(gè)或多個(gè))純化步驟回收的組合物中的hcp的量和在(一個(gè)或多個(gè))純化步驟之前的組合物中的hcp的量，確定降低。聚集的多肽可以是高分子量(hmw)蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，聚集的多肽是目標(biāo)多肽的多聚物。hmw蛋白質(zhì)可以是二聚體，多至8x單體，或更大的目標(biāo)多肽。用于測(cè)量聚集的蛋白質(zhì)(例如，hmw蛋白質(zhì))的方法是本領(lǐng)域已知的，并描述在實(shí)施例章節(jié)中。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，聚集的蛋白質(zhì)的量降低大于約5％,10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一。聚集的蛋白質(zhì)的量可以降低約10％和99％之間、30％和95％之間、30％和99％之間、50％和95％之間、50％和99％之間、75％和99％之間，或85％和99％之間中的任一。聚集的蛋白質(zhì)的量可以降低約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從(一個(gè)或多個(gè))純化步驟回收的組合物中的聚集的蛋白質(zhì)(例如，hmw蛋白質(zhì))的量和在(一個(gè)或多個(gè))純化步驟之前的組合物中的聚集的蛋白質(zhì)(例如，hmw蛋白質(zhì))的量，確定降低。片段多肽可以是低分子量(lmw)蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，片段化多肽是目標(biāo)多肽的片段。lmw蛋白質(zhì)的例子包括但不限于：fab(片段抗原結(jié)合)、fc(片段，可結(jié)晶)區(qū)或目標(biāo)抗體的兩種或任何隨機(jī)片段化部分的組合。測(cè)量片段化蛋白質(zhì)(例如，lmw蛋白質(zhì))的方法是本領(lǐng)域已知的，并描述在實(shí)施例章節(jié)中。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，lmw蛋白質(zhì)的量降低大于約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一。lmw蛋白質(zhì)的量可以降低約10％和99％之間、30％和95％之間、30％和99％之間、50％和95％之間、50％和99％之間、75％和99％之間，或85％和99％之間中的任一。lmw蛋白質(zhì)的量可以降低約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從(一個(gè)或多個(gè))純化步驟回收的組合物中的片段化蛋白質(zhì)(例如，lmw蛋白質(zhì))的量和在(一個(gè)或多個(gè))純化步驟之前的組合物中的片段化蛋白質(zhì)(例如，lmw蛋白質(zhì))的量，確定降低。泄露的蛋白a是從其所結(jié)合的固相上脫離或洗下的蛋白a。例如，泄露的蛋白a可以是從蛋白a層析柱上泄露的?？梢酝ㄟ^(guò)例如elisa測(cè)量蛋白a的量。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，泄露的蛋白a的量降低大于約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任一。泄露的蛋白a的量可以降低約10％和99％之間、30％和95％之間、30％和99％之間、50％和95％之間、50％和99％之間、75％和99％之間，或85％和99％之間中的任一。在一些實(shí)施方案中，泄露的蛋白a的量降低約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從(一個(gè)或多個(gè))純化步驟回收的組合物中的泄露的蛋白a的量和在(一個(gè)或多個(gè))純化步驟之前的組合物中的泄露的蛋白a的量，確定降低。測(cè)量dna(如宿主細(xì)胞dna)的方法是本領(lǐng)域已知的，并描述在實(shí)施例章節(jié)中。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，dna的量降低大于約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任一。dna的量可以降低約10％和99％之間、30％和95％之間、30％和99％之間、50％和95％之間、50％和99％之間、75％和99％之間，或85％和99％之間中的任一。dna的量可以降低約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％中的任一。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從(一個(gè)或多個(gè))純化步驟回收的組合物中的dna的量和在(一個(gè)或多個(gè))純化步驟之前的組合物中的dna的量，確定降低。細(xì)胞培養(yǎng)基組分指存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中的組分。細(xì)胞培養(yǎng)基可以是在收獲細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基組分是慶大霉素。可以通過(guò)elisa測(cè)量慶大霉素的量。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基組分的量降低大于約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任一。細(xì)胞培養(yǎng)基組分的量可以降低約10％和99％之間、30％和95％之間、30％和99％之間、50％和95％之間、50％和99％之間、75％和99％之間，或85％和99％之間中的任一。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基組分的量降低約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％中的任一。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)比較從(一個(gè)或多個(gè))純化步驟回收的組合物中的細(xì)胞培養(yǎng)基組分的量和在(一個(gè)或多個(gè))純化步驟之前的組合物中的細(xì)胞培養(yǎng)基組分的量，確定降低。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，方法還可以包括在本文所述的任何oec之前或之后的一個(gè)或多個(gè)的純化步驟。其他純化流程包括例如，離子交換層析，如陰離子交換層析和陽(yáng)離子交換層析、親和層析，如蛋白a層析和蛋白g層析、混合模式層析,羥磷灰石層析；凝膠過(guò)濾層析；親和層析；凝膠電泳；透析；乙醇沉淀；逆相hplc；硅膠層析；層析聚焦；sds-page；硫酸銨沉淀；和金屬螯合柱以結(jié)合多肽的表位標(biāo)記形式。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，方法還包括回收純化的多肽。在一些實(shí)施方案中，純化的多肽是從本文所述的任何純化步驟中回收的。層析步驟可以是陽(yáng)離子交換層析、混合模式層析或蛋白a層析。在一些實(shí)施方案中，oec層析是混合模式層析，并且其他層析是陰離子交換層析。在一些實(shí)施方案中，oec層析是混合模式層析，并且其他層析是陽(yáng)離子交換層析。在一些實(shí)施方案中，oec層析是混合模式層析，并且其他層析是hic層析。在一些實(shí)施方案中，oec層析是陰離子交換層析，并且其他層析是陽(yáng)離子交換層析。在一些實(shí)施方案中，oec層析是陰離子交換層析，并且其他層析是混合模式層析。在一些實(shí)施方案中，oec層析是陰離子交換層析，并且其他層析是hic層析。在一些實(shí)施方案中，oec層析是陽(yáng)離子交換層析，并且其他層析是陰離子交換層析。在一些實(shí)施方案中，oec層析是陽(yáng)離子交換層析，其他層析是混合模式層析。在一些實(shí)施方案中，oec層析是陽(yáng)離子交換層析，并且其他層析是hic層析。在一些實(shí)施方案中，oec層析是hic層析，并且其他層析是混合模式層析。在一些實(shí)施方案中，oec層析是hic層析，并且其他層析是陰離子交換層析。在一些實(shí)施方案中，oec層析是hic層析，并且其他層析是陽(yáng)離子交換層析。在一些實(shí)施方案中，在oec后，通過(guò)病毒過(guò)濾進(jìn)一步純化多肽。病毒過(guò)濾是去除多肽純化補(bǔ)料流中的病毒性污染物。病毒過(guò)濾的例子包括超濾和微濾。在一些實(shí)施方案中，使用細(xì)小病毒濾器純化多肽。在一些實(shí)施方案中，在用oec模式層析后濃縮多肽。濃縮方法的例子是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于超濾和滲濾。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，方法還包括組合純化方法純化的多肽與可藥用的運(yùn)載體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約6.5的ph和約5.3ms/cm至約5.6ms/cm的電導(dǎo)率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到captoadhere樹(shù)脂上，裝載密度為每升captoadhere樹(shù)脂150-200g抗體；b)用約6.5的ph和約1ms/cm的電導(dǎo)率的包含100mm2-(n-嗎啉代)乙磺酸(mes)的洗脫緩沖液，從樹(shù)脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約6.5的ph和約5.3ms/cm至約5.6ms/cm的電導(dǎo)率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到在1.6-10.8l柱中的captoadhere樹(shù)脂上，裝載密度為每升captoadhere樹(shù)脂70-180g抗體；b)用約6.5的ph和約1ms/cm的電導(dǎo)率的包含100mmmes的洗脫緩沖液，從樹(shù)脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約8.6的ph和小于約6ms/cm的電導(dǎo)率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到captoadhere樹(shù)脂上，裝載密度為每升captoadhere樹(shù)脂約200g抗體；b)用約6.5的ph和約1ms/cm的電導(dǎo)率的20mmmes的洗脫緩沖液，從樹(shù)脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約6.1的ph和小于約6ms/cm的電導(dǎo)率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到captoadhere樹(shù)脂上，裝載密度為每升captoadhere樹(shù)脂約200g抗體；b)用約6.0的ph和約0.65ms/cm的電導(dǎo)率的20mmmes的洗脫緩沖液，從樹(shù)脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約5.5的ph和小于約6ms/cm的電導(dǎo)率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到captoadhere樹(shù)脂上，裝載密度為每升captoadhere樹(shù)脂約200g抗體；b)用約4.9的ph和約1.1ms/cm的電導(dǎo)率的20mmmes的洗脫緩沖液，從樹(shù)脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約6.5的ph和小于約6ms/cm的電導(dǎo)率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到captoadhere樹(shù)脂上，裝載密度為每升captoadhere樹(shù)脂約200g抗體；b)用約6.5的ph和約1ms/cm的電導(dǎo)率的20mmmes的洗脫緩沖液，從樹(shù)脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約6.5的ph和小于約5.5ms/cm的電導(dǎo)率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到qma樹(shù)脂上，裝載密度為每升qma樹(shù)脂約103g抗體；b)用約6.5的ph和約1ms/cm的電導(dǎo)率的20mmmes的洗脫緩沖液，從樹(shù)脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約5.5的ph和小于約6ms/cm的電導(dǎo)率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到porosxs樹(shù)脂上，裝載密度為每升porosxs樹(shù)脂約200g抗體；b)用ph約5.5的50-350mm醋酸洗脫緩沖液，從樹(shù)脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于純化抗體的方法，包括：a)在具有約7.0的ph和小于約6ms/cm的電導(dǎo)率的裝載緩沖液中，將包含抗體的組合物裝載到captommc樹(shù)脂上，裝載密度為每升captommc樹(shù)脂約147g抗體；b)用約6.5的ph和約1ms/cm的電導(dǎo)率的20mmmes的洗脫緩沖液，從樹(shù)脂上洗脫抗體；和收集包含抗體的混合物。iii.多肽提供的多肽用于純化多肽的任何方法和包含通過(guò)本文所述方法純化的多肽的制劑中。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)使用過(guò)載和洗脫層析，純化多肽的方法。在一些實(shí)施方案中，多肽是治療性多肽。在一些實(shí)施方案中，多肽是拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，多肽是激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，多肽是抗體。在一些實(shí)施方案中，多肽是經(jīng)表位標(biāo)記的。在一些實(shí)施方案中，多肽保留生物學(xué)和/或免疫學(xué)活性。在一些實(shí)施方案中，多肽是拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，多肽啟動(dòng)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性。在一些實(shí)施方案中，多肽是抗體或免疫粘附素。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，多肽是通過(guò)使用混合模式層析基質(zhì)的oec純化的。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，多肽是通過(guò)使用陰離子交換層析基質(zhì)的oec純化的。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，多肽是通過(guò)使用陽(yáng)離子交換層析基質(zhì)的oec純化的。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，多肽是通過(guò)使用hic層析基質(zhì)的oec純化的。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，多肽是通過(guò)使用hap層析基質(zhì)的oec純化的。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，多肽是通過(guò)使用親和層析基質(zhì)的oec純化的。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，多肽是通過(guò)使用不是，或不包括陽(yáng)離子交換層析的層析基質(zhì)的oec純化的。在一些實(shí)施方案中，多肽具有大于約5,000道爾頓、10,000道爾頓、15,000道爾頓、25,000道爾頓、50,000道爾頓、75,000道爾頓、100,000道爾頓、125,000道爾頓或150,000道爾頓中任一的分子量。多肽可具有約50,000道爾頓至200,000道爾頓之間、或100,000道爾頓至200,000道爾頓之間中任一的分子量?？蛇x的，本文使用的多肽可具有約120,000道爾頓或約25,000道爾頓的分子量。pi是等電點(diǎn)，是特定分子或表面不帶任何電荷的ph。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，多肽的pi可以是在約6至10之間、7至9之間，或8至9之間中的任一。在一些實(shí)施方案中，多肽具有約6、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10中任一的pi。待使用本文所述方法純化的多肽一般是使用重組技術(shù)生產(chǎn)的。用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法描述在例如美國(guó)專利號(hào)5,534,615和4,816,567中，通過(guò)引用具體整合到本文中。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)蛋白質(zhì)是在cho細(xì)胞中生產(chǎn)的(參見(jiàn)例如wo94/11026)。當(dāng)使用重組技術(shù)時(shí)，多肽可以在胞內(nèi)生產(chǎn)、在周質(zhì)空間生產(chǎn)或直接分泌到培養(yǎng)基中?？梢詮呐囵B(yǎng)基或從宿主細(xì)胞裂解液中回收多肽?？梢酝ㄟ^(guò)多種物理或化學(xué)的方法破裂用于表達(dá)多肽的細(xì)胞，如凍融循環(huán)、超聲、機(jī)械破裂或細(xì)胞裂解劑。如果多肽是在胞內(nèi)生產(chǎn)的，作為第一步驟，通過(guò)例如離心或超濾去除宿主細(xì)胞或裂解的片段的微粒殘?jiān)?。carter等，bio/technology10：163-167(1992)描述了用于分離分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間中的多肽的流程。簡(jiǎn)而言之，在存在醋酸鈉(ph3.5)、edta和苯甲磺酰氟(pmsf)的條件下，使細(xì)胞漿融解約30min?？梢酝ㄟ^(guò)離心去除細(xì)胞殘?jiān)?。?dāng)多肽是分泌到培養(yǎng)基中時(shí)，一般首先使用可商購(gòu)的多肽濃縮濾器，例如amicon或milliporepellicon超濾單元，濃縮來(lái)自這類表達(dá)體系的上清液。上述步驟中的任一步都可以包括蛋白酶抑制劑，如pmsf，以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素，以抑制外來(lái)污染物的生長(zhǎng)?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明方法純化的多肽的例子包括但不限于免疫球蛋白、免疫粘附素、抗體、酶、激素、融合蛋白、含有fc的蛋白質(zhì)、免疫綴合物、細(xì)胞因子和白介素。多肽的例子包括但不限于：哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，如腎素；激素；生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺素；甲狀腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素a-鏈；胰島素b-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血糖素；凝血因子如因子viiic、因子ix、組織因子和vonwillebrands因子；抗凝血因子，如蛋白c；心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖維蛋白溶酶原激活劑，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活劑(t-pa)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；rantes(受激活調(diào)節(jié)正常t細(xì)胞表達(dá)和分泌因子)；人巨噬細(xì)胞炎性蛋白(mip-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；muellerian-抑制性物質(zhì)；松弛素a-鏈；松弛素b-鏈；原松弛素；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；酶；微生物蛋白質(zhì)，如β-內(nèi)酰胺酶；dna酶；ige；細(xì)胞毒性t-淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(ctla)，如ctla-4；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)；激素或生長(zhǎng)因子的受體；蛋白a或d；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如骨源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(bdnf)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3、-4、-5或-6(nt-3、nt-4、nt-5或nt-6)或神經(jīng)生長(zhǎng)因子如ngf-b；血小板源性生長(zhǎng)因子(pdgf)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如afgf和bfgf；表皮生長(zhǎng)因子(egf)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(tgf)，如tgf-α和tgf-β，包括tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、tgf-β4或tgf-β5；胰島素樣生長(zhǎng)因子-i和-ii(igf-i和igf-ii)；des(1-3)-igf-i(腦igf-i)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白質(zhì)(igfbp)；細(xì)胞因子；cd蛋白，如cd3、cd4、cd8、cd19和cd20；紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)性因子；免疫毒素；融合多肽，即，包含兩個(gè)或多個(gè)異源多肽或其片段并由重組核酸編碼的多肽；含有fc的多肽，例如包含與第二多肽融合的免疫球蛋白fc區(qū)或其片段的融合蛋白；免疫綴合物；骨形態(tài)生成蛋白(bmp)；干擾素，如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(csf)，例如m-csf、gm-csf和g-csf；白介素(il)，例如il-1至il-10；超氧化物歧化酶；t-細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒性抗原，例如aids衣殼的一部分；運(yùn)輸?shù)鞍?；歸巢受體；地址素；調(diào)控蛋白；整聯(lián)蛋白如cd11a、cd11b、cd11c、cd18、icam、vla-4和vcam；腫瘤相關(guān)抗原，如ca125(卵巢癌抗原)或her2、her3或her4受體；免疫粘附素；和任何上述蛋白質(zhì)的片段和/或變體，以及與蛋白質(zhì)，包括例如任何上述蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體，包括抗體片段。(a)抗體在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，用于純化多肽的任何方法和包含通過(guò)本文所述方法純化的多肽的制劑中的多肽是抗體?？贵w的分子靶包括cd蛋白及其配體，例如但不限于：(i)cd3、cd4、cd8、cd19、cd11a、cd20、cd22、cd34、cd40、cd79α(cd79a)和cd79β(cd79b)；(ii)erbb受體家族的成員，如egf受體、her2、her3或her4受體；(iii)細(xì)胞粘附分子，如lfa-1、mac1、p150,95、vla-4、icam-1、vcam和αv/β3整聯(lián)蛋白，包括其α或β亞基(例如，抗cd11a、抗cd18或抗cd11b抗體)；(iv)生長(zhǎng)因子，如vegf；ige；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(ob)受體；mpl受體；ctla-4；蛋白c、br3、c-met、組織因子、β7等；和(v)細(xì)胞表面和跨膜腫瘤相關(guān)抗原(taa)，如美國(guó)專利號(hào)7,521,541中所述。其他示例性抗體包括選自但不限于：抗雌激素受體抗體、抗孕激素受體抗體、抗p53抗體、抗her-2/neu抗體、抗egfr抗體、抗組織蛋白酶d抗體、抗bcl-2抗體、抗e-鈣粘素抗體、抗ca125抗體、抗ca15-3抗體、抗ca19-9抗體、抗c-erbb-2抗體、抗p-糖蛋白抗體、抗cea抗體、抗視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白抗體、抗ras原癌蛋白抗體、抗lewisx抗體、抗ki-67抗體、抗pcna抗體、抗cd3抗體、抗cd4抗體、抗cd5抗體、抗cd7抗體、抗cd8抗體、抗cd9/p24抗體、抗cd10抗體、抗cd11a抗體、抗cd11c抗體、抗cd13抗體、抗cd14抗體、抗cd15抗體、抗cd19抗體、抗cd20抗體、抗cd22抗體、抗cd23抗體、抗cd30抗體、抗cd31抗體、抗cd33抗體、抗cd34抗體、抗cd35抗體、抗cd38抗體、抗cd41抗體、抗lca/cd45抗體、抗cd45ro抗體、抗cd45ra抗體、抗cd39抗體、抗cd100抗體、抗cd95/fas抗體、抗cd99抗體、抗cd106抗體、抗泛素抗體、抗cd71抗體、抗c-myc抗體、抗細(xì)胞角蛋白抗體、抗波形蛋白抗體、抗hpv蛋白質(zhì)抗體、抗κ輕鏈抗體、抗λ輕鏈抗體、抗黑色素體抗體、抗前列腺特異性抗原抗體、抗s-100抗體、抗τ抗原抗體、抗纖維蛋白抗體、抗角蛋白抗體和抗tn-抗原抗體。(i)多克隆抗體在一些實(shí)施方案中，抗體是多克隆抗體。多克隆抗體優(yōu)選由多次皮下(sc)或腹腔內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑的動(dòng)物內(nèi)產(chǎn)生?？墒褂秒p功能劑或衍生劑，例如，馬來(lái)酰亞胺苯甲酰硫代琥珀酰亞胺酯(通過(guò)半胱氨酸殘基綴合)、n-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、socl2，或r1n＝c＝nr，其中r和r1是不同的烷基，綴合相關(guān)抗原與對(duì)待免疫物種是免疫原性的多肽，例如鑰孔蟲(chóng)血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制劑。通過(guò)組合例如100μg或5μg多肽或綴合物(分別用于兔或小鼠)和3倍體積的弗氏完全佐劑，并在多個(gè)位點(diǎn)皮內(nèi)注射所述溶液，來(lái)用抗原、免疫原性綴合物或衍生物免疫動(dòng)物。1個(gè)月后，通過(guò)在多個(gè)位點(diǎn)皮下注射肽或綴合物的原始量的1/5至1/10和弗氏完全佐劑，強(qiáng)化動(dòng)物。7至14天后，將動(dòng)物放血，測(cè)定血清的抗體滴度。加強(qiáng)動(dòng)物，直到滴度平臺(tái)。在一些實(shí)施方案中，用相同抗原與不同多肽綴合，和/或通過(guò)不同交聯(lián)劑綴合的綴合物加強(qiáng)動(dòng)物。還在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中作為多肽融合物生產(chǎn)綴合物。此外，恰當(dāng)?shù)氖褂镁奂瘎?，如明礬，來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。(ii)單克隆抗體在一些實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。單克隆抗體是從基本均質(zhì)的抗體群體中獲得的，即，構(gòu)成群體的單個(gè)抗體是相同的和/或結(jié)合相同表位，除了在生產(chǎn)單克隆抗體的過(guò)程中產(chǎn)生的可能的變體外，這類變體一般只存在微量。因此，修飾語(yǔ)“單克隆”表示抗體的特征不是不同的或多克隆抗體的混合物。例如，單克隆抗體可以通過(guò)使用首先由kohler等，nature256:495(1975)描述的雜交瘤方法制備，或者可以由重組dna方法制備(美國(guó)專利號(hào)4,816,567)。在雜交瘤方法中，如本文所述接種小鼠或其他恰當(dāng)?shù)乃拗鲃?dòng)物，如田鼠，引發(fā)生產(chǎn)或能夠生產(chǎn)特異性結(jié)合用于免疫接種的多肽的抗體的淋巴細(xì)胞。可選的，可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后，使用合適的融合劑(如聚乙二醇)，將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤融合，形成雜交瘤細(xì)胞(goding,monoclonalantibodies：principlesandpractice，第59-103頁(yè)(academicpress,1986))。將如此制備的雜交瘤細(xì)胞接種并生長(zhǎng)在合適的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種抑制未融合的親代骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺少次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hgprt或hprt)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基一般將包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(hat培養(yǎng)基)，上述物質(zhì)阻止hgprt缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，骨髓瘤細(xì)胞是高效融合、支持選擇的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的抗體的穩(wěn)定高水平生產(chǎn)的那些細(xì)胞，并且對(duì)于培養(yǎng)基如hat培養(yǎng)基敏感。其中，在一些實(shí)施方案中，骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，如源自可獲得自salkinstitutecelldistributioncenter,sandiego,californiausa的mopc-21和mpc-11小鼠腫瘤，和可獲得自美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心(americantypeculturecollection,rockville,marylandusa)的sp-2或x63-ag8-653細(xì)胞的細(xì)胞系。還描述了人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞系用于生產(chǎn)人單克隆抗體(kozbor,j.immunol.133:3001(1984)；brodeur等，monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications，第51-63頁(yè)(marceldekker,inc.,newyork,1987))。測(cè)定生長(zhǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基生產(chǎn)針對(duì)抗原的單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)免疫沉淀或體外結(jié)合測(cè)定，如放射性免疫測(cè)定(ria)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)，確定雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體的結(jié)合特異性?？梢酝ㄟ^(guò)munson等，anal.biochem.107:220(1980)的scatchard分析，確定單克隆抗體的結(jié)合親和力。在鑒別出生產(chǎn)具有理想的特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，可以通過(guò)極限稀釋法亞克隆所述克隆，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法生長(zhǎng)(goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice，第59-103頁(yè)(academicpress,1986))。用于該目的的合適培養(yǎng)基包括例如，d-mem或rpmi-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞可以作為動(dòng)物的腹水腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)。通過(guò)常規(guī)的免疫球蛋白純化工藝，例如，多肽a-sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，從培養(yǎng)基、腹水或血清中合適地分離由亞克隆分泌的單克隆抗體。使用常規(guī)方法(例如，通過(guò)使用能夠特異結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)，對(duì)編碼單克隆抗體的dna方便地分離和測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，雜交瘤細(xì)胞充當(dāng)這類dna的來(lái)源。一經(jīng)分離，就可以將dna放入表達(dá)載體中，然后將所述載體轉(zhuǎn)染到否則不生產(chǎn)免疫球蛋白多肽的宿主細(xì)胞中，如大腸桿菌細(xì)胞、猿類cos細(xì)胞、中華倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組的宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的dna在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述包括skerra等，curr.opinioninimmunol.5:256-262(1993)和plückthun,immunol.revs.,130:151-188(1992)。在另一實(shí)施方案中，可以從使用mccafferty等，nature348:552-554(1990)描述的技術(shù)生成的抗體噬菌體文庫(kù)中，分離抗體或抗體片段。clackson等，nature352:624-628(1991)和marks等，j.mol.biol.222:581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫(kù)分離鼠和人抗體。后續(xù)出版物描述了通過(guò)鏈改組生產(chǎn)高親和力(nm范圍)的人抗體(marks等，bio/technology10:779-783(1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(kù)的對(duì)策(waterhouse等，nuc.acids.res.21:2265-2266(1993))。因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行的備選方案。dna也可以是修飾的，例如，通過(guò)用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列替代同源的鼠序列(美國(guó)專利號(hào)4,816,567；morrison等，proc.natlacad.sci.usa81:6851(1984))，或者通過(guò)共價(jià)連接免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列。通常，這類非免疫球蛋白多肽取代抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或者取代抗體的1個(gè)抗原組合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域，以生成包含具有對(duì)抗原的特異性的1個(gè)抗原組合位點(diǎn)和具有對(duì)不同抗原的特異性的另一個(gè)抗原組合位點(diǎn)的嵌合二價(jià)抗體。在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，抗體是iga、igd、ige、igg或igm。在一些實(shí)施方案中，抗體是igg單克隆抗體。(iii)人源化抗體在一些實(shí)施方案中，抗體是人源化抗體。本領(lǐng)域已描述了用于人源化非人抗體的方法。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體具有從非人來(lái)源導(dǎo)入其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基，通常來(lái)自“輸入”的可變結(jié)構(gòu)域。人源化基本可以按照winter及其同事(jones等，nature321:522-525(1986)；riechmann等，nature332:323-327(1988)；verhoeyen等，science239:1534-1536(1988))的方法實(shí)施，通過(guò)用人抗體的相應(yīng)序列取代超變區(qū)序列。因此，這類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利號(hào)4,816,567)，其中基本上少于整個(gè)人可變結(jié)構(gòu)域被來(lái)自非人物種的相應(yīng)序列取代。在實(shí)踐上，人源化抗體通常是這樣的人抗體，其中一些超變區(qū)殘基以及可能一些fr殘基被來(lái)自嚙齒類抗體的類似位點(diǎn)上的殘基取代。對(duì)于降低抗原性而言，待用于制備人源化抗體的輕鏈和重鏈的人可變結(jié)構(gòu)域的選擇是非常重要的。根據(jù)所謂的“最適”方法，針對(duì)已知的人可變結(jié)構(gòu)域序列的完整文庫(kù)，篩選嚙齒類抗體的可變結(jié)構(gòu)域序列。接受與嚙齒類最近似的人序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(fr)(sims等，j.immunol.151:2296(1993)；chothia等，j.mol.biol.196:901(1987))。另一種方法使用源自輕鏈或重鏈可變區(qū)的特定亞組的所有人抗體的共有序列的特定框架區(qū)。相同的框架可以用于若干種不同的人源化抗體(carter等，proc.natl.acad.sci.usa89:4285(1992)；presta等，j.immunol.151:2623(1993))。更重要的是，將要人源化的抗體保留了對(duì)抗原的高親和力和其他有利的生物學(xué)特性。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，在方法的一些實(shí)施方案中，通過(guò)使用親代和人源化序列的三維模型分析親代序列和多種概念性的人源化產(chǎn)物的方法，制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)獲得的和熟知的?？色@得示例和展示選定的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。對(duì)這些展示物的觀察允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，即，分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。藉此，可以從受體和輸入序列選擇和組合fr殘基，從而實(shí)現(xiàn)理想的抗體特征，如對(duì)于(一種或多種)靶抗原增加的親和力。一般而言，超變區(qū)殘基直接且大部分實(shí)質(zhì)地參與影響抗原結(jié)合。(v)人抗體在一些實(shí)施方案中，抗體是人抗體。作為人源化的備選方案，可以生成人抗體。例如，現(xiàn)在可以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠)，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在免疫接種后能夠在缺少內(nèi)源性免疫球蛋白生產(chǎn)的條件下，生產(chǎn)完全的人抗體庫(kù)。例如，已描述了在嵌合和種系突變體小鼠中純合缺失抗體重鏈連接區(qū)(jh)基因?qū)е聦?duì)內(nèi)源性抗體生產(chǎn)的完整抑制。在這類種系突變體小鼠中轉(zhuǎn)移人種系免疫球蛋白基因陣列將導(dǎo)致在抗原刺激后生產(chǎn)人抗體。參見(jiàn)例如jakobovits等，proc.natl.acad.sci.usa90:2551(1993)；jakobovits等，nature362:255-258(1993)；bruggermann等，yearinimmuno.7:33(1993)；和美國(guó)專利號(hào)5,591,669；5,589,369；和5,545,807?？蛇x的，可以使用噬菌體展示技術(shù)(mccafferty等，nature348:552-553(1990))，從來(lái)自未免疫接種的供體的免疫球蛋白可變(v)結(jié)構(gòu)域基因庫(kù)中，體外生產(chǎn)人抗體和抗體片段。根據(jù)該技術(shù)，將抗體v結(jié)構(gòu)域基因符合讀框地克隆到絲狀噬菌體(如m13或fd)的主要或次要外殼多肽基因中，并作為功能性抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面。由于絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈dna拷貝，基于抗體功能特性的選擇也導(dǎo)致選擇編碼表現(xiàn)出這些特性的抗體的基因。因此，噬菌體模擬了b細(xì)胞的一些特性?？梢砸远喾N方式實(shí)施噬菌體展示；其綜述參見(jiàn)例如johnson,kevins.和chiswell,davidj.,currentopinioninstructuralbiology3:564-571(1993)。v-基因區(qū)段的若干來(lái)源可用于噬菌體展示。clackson等，nature352:624-628(1991)從源自經(jīng)免疫接種的小鼠的脾臟的v基因的小隨機(jī)組合文庫(kù)中，分離出抗惡唑酮抗體的多種陣列?？梢詷?gòu)建來(lái)自未經(jīng)免疫接種的人供體的v基因庫(kù)，并基本上按照marks等，j.mol.biol.222:581-597(1991)或griffith等，emboj.12:725-734(1993)描述的技術(shù)分離針對(duì)抗原(包括自身抗原)的多種陣列的抗體。還參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,565,332和5,573,905。還可以通過(guò)體外活化的b細(xì)胞生成人抗體(參見(jiàn)美國(guó)專利5,567,610和5,229,275)。(v)抗體片段在一些實(shí)施方案中，抗體是抗體片段。已研發(fā)了多種用于生產(chǎn)抗體片段的技術(shù)。傳統(tǒng)上，這些片段是經(jīng)由對(duì)完整抗體的蛋白水解消化得到的(參見(jiàn)例如，morimoto等，journalofbiochemicalandbiophysical方法24:107-117(1992)和brennan等，science229:81(1985))。然而，現(xiàn)在可以通過(guò)重組宿主細(xì)胞直接生產(chǎn)這些片段。例如，可以從如上所述的抗體噬菌體文庫(kù)中分離抗體片段?？蛇x的，可以直接從大腸桿菌中回收f(shuō)ab'-sh片段，并化學(xué)偶聯(lián)形成f(ab')2片段(carter等，bio/technology10:163-167(1992))。根據(jù)另一種方法，可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中分離f(ab')2片段。用于生產(chǎn)抗體片段的其他技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。在其他實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈fv片段(scfv)。參見(jiàn)wo93/16185；美國(guó)專利號(hào)5,571,894；和美國(guó)專利號(hào)5,587,458?？贵w片段還可以是“線性抗體”，例如美國(guó)專利5,641,870所述。這類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。在一些實(shí)施方案中，提供了本文所述的抗體的片段。在一些實(shí)施方案中，抗體片段是抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合片段選自由fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、scfv、fv和雙抗體組成的組。(vi)雙特異性抗體在一些實(shí)施方案中，抗體是雙特異性抗體。雙特異性抗體是具有對(duì)于至少2種不同的表位的結(jié)合特異性的抗體。示例性雙特異性抗體可結(jié)合2種不同的表位?？蛇x的，雙特異性抗體結(jié)合臂可以與結(jié)合白細(xì)胞上的觸發(fā)分子的臂組合，所述觸發(fā)分子如t細(xì)胞受體分子(例如cd2或cd3)，或igg的fc受體(fcγr)，如fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)和fcγriii(cd16)，從而對(duì)細(xì)胞聚焦細(xì)胞防御機(jī)制。雙特異性抗體可以作為全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如，f(ab')2雙特異性抗體)制備。用于制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是基于共表達(dá)2條免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)，其中2條鏈具有不同的特異性(millstein等，nature305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)搭配，這些雜交瘤(四價(jià)體瘤(quadroma))生產(chǎn)潛在的10種不同抗體分子的混合物，其中僅1種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過(guò)親和層析步驟純化正確的分子，是非常麻煩的，產(chǎn)率也低。類似的方法公開(kāi)在wo93/08829和traunecker等，emboj.,10:3655-3659(1991)中。根據(jù)不同的方法，融合具有理想的結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域(抗體-抗原組合位點(diǎn))和免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列。在一些實(shí)施方案中，所述融合是與包含鉸鏈、ch2和ch3區(qū)的至少一部分的免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合。在一些實(shí)施方案中，含有輕鏈結(jié)合必需的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(ch1)存在于至少一種融合體中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體，以及需要時(shí)，免疫球蛋白輕鏈的dna，插入到獨(dú)立的表達(dá)載體中，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物中。當(dāng)在構(gòu)建中使用的不等比例的3種多肽鏈提供了最佳產(chǎn)率時(shí)，這為調(diào)節(jié)實(shí)施方案中的3種多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，當(dāng)?shù)缺壤闹辽?種多肽鏈的表達(dá)獲得高產(chǎn)率時(shí)，或者當(dāng)比例并非特別重要時(shí)，可以將2條或全部3條多肽鏈的編碼序列插入到1個(gè)表達(dá)載體中。在該方法的一些實(shí)施方案中，雙特異性抗體由在一臂中的具有第一結(jié)合特異性的雜合的免疫球蛋白重鏈，和在另一臂中的雜合的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。發(fā)現(xiàn)該不對(duì)稱結(jié)構(gòu)協(xié)助從不需要的免疫球蛋白鏈的組合中分離理想的雙特異性化合物，因?yàn)閮H一半的雙特異性分子存在免疫球蛋白輕鏈，提供了促進(jìn)分離的方式。該方法公開(kāi)在wo94/04690中。生成雙特異性抗體的其他細(xì)節(jié)參見(jiàn)例如suresh等，methodsinenzymology121:210(1986)。根據(jù)美國(guó)專利號(hào)5,731,168中描述的另一種方法，可以改造在一對(duì)抗體分子之間的界面，使從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的異二聚體百分比最大化。在一些實(shí)施方案中，界面至少包括抗體恒定結(jié)構(gòu)域的ch3結(jié)構(gòu)域的一部分。在該方法中，用較大的側(cè)鏈(例如，酪氨酸或色氨酸)取代來(lái)自第一抗體分子的界面中的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈。通過(guò)用較小的氨基酸側(cè)鏈(例如，丙氨酸或蘇氨酸)取代大的氨基酸側(cè)鏈，在第二抗體分子的界面上生成與(一個(gè)或多個(gè))大側(cè)鏈相同或相似大小的補(bǔ)償性“空洞”。這為增加異二聚體相比其他不需要的終產(chǎn)物(如同二聚體)的產(chǎn)率提供了機(jī)制。雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異源綴合的”抗體。例如，異源綴合物中的抗體之一可以與抗生物素蛋白偶聯(lián)，另一個(gè)與生物素偶聯(lián)。已經(jīng)提出這類抗體例如將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向至不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)4,676,980)，和用于治療hiv感染(wo91/00360、wo92/200373和ep03089)?？梢允褂萌魏畏奖愕慕宦?lián)方法制備異源綴合抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域普遍已知的，公開(kāi)在美國(guó)專利號(hào)4,676,980中，還公開(kāi)了多種其他的交聯(lián)技術(shù)。文獻(xiàn)中還描述了從抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可以使用化學(xué)連接制備雙特異性抗體。brennan等，science229：81(1985)描述了這樣的方法，其中完整抗體被蛋白水解切割以生成f(ab')2片段。在存在二巰基化物絡(luò)合劑亞砷酸鈉的條件下，還原這些片段，以穩(wěn)定鄰位的二巰基化物，阻止形成分子間二硫鍵。然后，生成的fab'片段被轉(zhuǎn)化成硫代硝基苯甲酸鹽(thionitrobenzoate)(tnb)衍生物。然后，通過(guò)用巰基乙胺還原，將fab'-tnb衍生物中的一種再轉(zhuǎn)化為fab'-巰基，并與等摩爾量的其他fab'-tnb衍生物混合以形成雙特異性抗體。生產(chǎn)的雙特異性抗體可用作用于酶的選擇性固定的活性劑。還描述了用于制備和從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中直接分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，使用亮氨酸拉鏈生產(chǎn)雙特異性抗體。kostelny等，j.immunol.148(5):1547-1553(1992)。通過(guò)基因融合，連接來(lái)自fos和jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與2個(gè)不同抗體的fab'部分。在鉸鏈區(qū)還原抗體同二聚體形成單體，并然后重新氧化形成抗體異二聚體。該方法還可用于生產(chǎn)抗體同二聚體。hollinger等，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)描述的“雙抗體”技術(shù)提供了用于制備雙特異性抗體片段的備選機(jī)制。片段包含通過(guò)接頭與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)相連的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)，所述接頭太短以至不允許同一鏈上的2個(gè)結(jié)構(gòu)域配對(duì)。因此，強(qiáng)迫1個(gè)片段的vh和vl結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)片段的的互補(bǔ)的vl和vh結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而形成2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了另一種通過(guò)使用單鏈fv(sfv)二聚體制備雙特異性抗體片段的對(duì)策。參見(jiàn)gruber等，j.immunol.152:5368(1994)?？紤]具有二價(jià)以上的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。tutt等，j.immunol.147：60(1991)。(vii)多價(jià)抗體在一些實(shí)施方案中，抗體是多價(jià)抗體。多價(jià)抗體可以比二價(jià)抗體更快地被表達(dá)抗體所結(jié)合的抗原的細(xì)胞內(nèi)化(和/或異化)。本文提供的抗體可以是具有3個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如，四價(jià)抗體)的多價(jià)抗體(是除igm類以外的)，其可以通過(guò)重組表達(dá)編碼抗體多肽鏈的核酸而方便的生產(chǎn)。多價(jià)抗體可包含二聚化結(jié)構(gòu)域和3個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域包含fc區(qū)或鉸鏈區(qū)(或由之組成)。在該方案中，抗體將包含fc區(qū)和3個(gè)或多個(gè)在fc區(qū)氨基末端的抗原結(jié)合位點(diǎn)。本文中優(yōu)選的多價(jià)抗體包含3個(gè)至約8個(gè)，但優(yōu)選4個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(或由之組成)。多價(jià)抗體至少包含一條多肽鏈(并優(yōu)選2條多肽鏈)，其中(一條或多條)多肽鏈包含2個(gè)或更多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。例如，(一條或多條)多肽鏈可包含vd1-(x1)n-vd2-(x2)n-fc，其中vd1是第一可變結(jié)構(gòu)域，vd2是第二可變結(jié)構(gòu)域，fc是fc區(qū)中的1條多肽鏈，x1和x2代表氨基酸或多肽，n是0或1。例如，(一條或多條)多肽鏈可包含：vh-ch1-柔性接頭-vh-ch1-fc區(qū)鏈；或vh-ch1-vh-ch1-fc區(qū)鏈。本文中的多價(jià)抗體優(yōu)選還包含至少2條(并優(yōu)選4條)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域多肽。本文中的多價(jià)抗體可例如包含從約2條至約8條輕鏈可變結(jié)構(gòu)域多肽。本文考慮的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域多肽包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，和任選地還包含cl結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，抗體是多特異性抗體。多特異性抗體的例子包括但不限于：包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)的抗體，其中vhvl單元具有多表位特異性；具有2個(gè)或多個(gè)vl和vh結(jié)構(gòu)域的抗體，每個(gè)vhvl單元結(jié)合不同的表位；具有2個(gè)或多個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域的抗體，每個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合不同的表位；已經(jīng)共價(jià)或非共價(jià)連接的全長(zhǎng)抗體、抗體片段，如fab、fv、dsfv、scfv、雙抗體、雙特異性雙抗體、三價(jià)抗體、三功能抗體、抗體片段。在一些實(shí)施方案中，抗體具有多表位特異性；例如特異性結(jié)合位于相同或不同靶位上的2個(gè)或更多個(gè)不同表位的能力。在一些實(shí)施方案中，抗體是單特異性的；例如，僅結(jié)合1個(gè)表位的抗體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，多特異性抗體是以5μm至0.001pm、3μm至0.001pm、1μm至0.001pm、0.5μm至0.001pm，或0.1μm至0.001pm的親和力結(jié)合每個(gè)表位的igg抗體。(viii)其他的抗體修飾理想的是關(guān)于效應(yīng)子功能修飾本文提供的抗體，從而例如增強(qiáng)抗體的抗原依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)。這可以是通過(guò)在抗體的fc區(qū)中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換實(shí)現(xiàn)的?？蛇x的或額外的，可以在fc區(qū)中導(dǎo)入(一個(gè)或多個(gè))半胱氨酸殘基，從而允許在該區(qū)形成鏈間二硫鍵。因而生成的同二聚體抗體可具有改善的內(nèi)化能力和/或增加的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(adcc)。參見(jiàn)caron等，j.expmed.176:1191-1195(1992)和shopes,b.j.,immunol.148:2918-2922(1992)。還可以使用wolff等，cancerresearch53:2560-2565(1993)所述的異雙功能交聯(lián)接頭，制備具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同二聚體抗體?？蛇x的，具有雙重fc區(qū)的抗體可被改造，并從而可具有增強(qiáng)的補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解和adcc能力。參見(jiàn)stevenson等，anti-cancerdrugdesign3:219-230(1989)。為了增加抗體的血清半衰期，可以如us2006/0067930所述在抗體中產(chǎn)生氨基酸改變，其通過(guò)引用全文整合到本文中。(b)多肽變體和修飾本文所述的多肽，包括抗體的(一種或多種)氨基酸序列修飾可用于純化本文所述的多肽(例如，抗體)的方法。(i)變體多肽“多肽變體”意指這樣的多肽，優(yōu)選活性多肽，所述多肽如本文定義與多肽的全長(zhǎng)天然序列、缺少信號(hào)肽的多肽序列、多肽的有或無(wú)信號(hào)肽的胞外結(jié)構(gòu)域具有至少約80％的氨基酸序列同一性。這類多肽變體包括例如這樣的多肽，其中在全長(zhǎng)天然氨基酸序列的n或c-末端添加或缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。通常，tat多肽變體將與全長(zhǎng)天然序列多肽序列、缺少信號(hào)肽的多肽序列、多肽的有或無(wú)信號(hào)肽的胞外結(jié)構(gòu)域具有至少約80％氨基酸序列同一性，可選的至少約85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一的氨基酸序列同一性。任選的，相比天然的多肽序列，變體多肽將具有不超過(guò)1個(gè)的保守氨基酸替換，可選的，相比天然的多肽序列，不超過(guò)約2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)中任一的保守氨基酸替換。變體多肽可以在n端或c端截短，或者可缺少內(nèi)部殘基，例如相比全長(zhǎng)天然多肽時(shí)。某些變體多肽可缺少對(duì)理想的生物學(xué)活性不必需的氨基酸殘基?？梢酝ㄟ^(guò)多種常規(guī)技術(shù)中的任一種制備這些具有截短、缺失和插入的變體多肽。理想的變體多肽可以是化學(xué)合成的。另一種合適的技術(shù)涉及分離和通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)擴(kuò)增編碼理想的變體多肽的核酸片段。在pcr中的5'和3'引物處應(yīng)用定義核酸片段的理想的末端的寡核苷酸。優(yōu)選的，變體多肽與本文公開(kāi)的天然多肽共享至少一種生物學(xué)和/或免疫學(xué)活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合物，長(zhǎng)度范圍從1個(gè)殘基至含有上百個(gè)或更多個(gè)殘基的多肽，以及在序列內(nèi)插入單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。末端插入的例子包括具有n-末端甲硫氨酰殘基的抗體或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其他插入變體包括抗體的n-或c-末端與酶或多肽的融合體，所述酶或多肽增加了抗體的血清半壽期。例如，理想的是改善多肽的結(jié)合親和力和/或其他生物學(xué)特性。通過(guò)向抗體核酸中導(dǎo)入恰當(dāng)?shù)暮塑账岣淖儯蛲ㄟ^(guò)肽合成，制備多肽的氨基酸序列變體。這類修飾包括例如在多肽的氨基酸序列中缺失和/或插入和/或替換殘基。在最終構(gòu)建體中實(shí)現(xiàn)刪除、插入和替換的任意組合，只要最終構(gòu)建體具有理想的特征。氨基酸改變也可以改變多肽(例如，抗體)的翻譯后過(guò)程，如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量或位置。可以通過(guò)比較多肽序列與同源的已知多肽分子的序列并使高同源性區(qū)域中發(fā)生的氨基酸序列改變的數(shù)量最小化，發(fā)現(xiàn)用于確定可以插入、替換或缺失哪個(gè)氨基酸殘基而對(duì)理想活性沒(méi)有負(fù)面影響的指導(dǎo)條例。用于鑒別多肽(例如，抗體)的某些殘基或區(qū)是用于誘變的優(yōu)選的位置的有效方法被稱為“丙氨酸篩選誘變”，如cunningham和wells,science244:1081-1085(1989)中所述。在本文中，鑒別了殘基或靶殘基的組(例如，帶電殘基，如arg、asp、his、lys和glu)，并通過(guò)中性或帶負(fù)電的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或苯丙氨酸)取代，影響氨基酸與抗原的相互作用。然后，通過(guò)在，或?qū)τ谌〈稽c(diǎn)導(dǎo)入另外的或其他的變體，細(xì)化那些對(duì)替換表現(xiàn)出功能敏感性的氨基酸位置。因此，盡管用于導(dǎo)入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先確定的，突變的本質(zhì)本身是不需要預(yù)先確定的。例如，為了分析在給定位點(diǎn)突變的表現(xiàn)，在靶密碼子或區(qū)進(jìn)行ala篩選或隨機(jī)誘變，并篩選具有理想活性的表達(dá)的抗體變體。另一種變體類型是氨基酸替換變體。這些變體的抗體分子中具有至少一個(gè)氨基酸殘基被不同的殘基取代。替換誘變最感興趣的位點(diǎn)包括超變區(qū)，但也考慮fr改變。下表1在“優(yōu)選替換”的標(biāo)題下顯示了保守替換。如果這類替換導(dǎo)致生物學(xué)活性的改變，則可以導(dǎo)入更實(shí)質(zhì)性的改變(在表1中命名為“示例性替換”)或如下文參照氨基酸類別時(shí)進(jìn)一步所述，并篩選產(chǎn)物。表1.原始?xì)埢纠蕴鎿Q優(yōu)選替換ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；asp,lys；argglnasp(d)glu；asnglucys(c)ser；alasergln(q)asn；gluasnglu(e)asp；glnaspgly(g)alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸leuleu(l)正亮氨酸；ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)trp；leu；val；ile；ala；tyrtyrpro(p)alaalaserthrthrthr(t)val；sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸leu通過(guò)選擇這樣的替換，實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性修飾，所述替換維持(a)替換區(qū)域中的多肽骨架結(jié)構(gòu)，例如，作為片層或螺旋構(gòu)象；(b)分子在靶位點(diǎn)的電荷或疏水性；或(c)側(cè)鏈體積的效果顯著不同?？梢愿鶕?jù)其側(cè)鏈特性的相似性對(duì)氨基酸分組(a.l.lehninger,biochemistry，第2版，第73-75頁(yè)，worthpublishers,newyork(1975))：(1)非極性：ala(a)、val(v)、leu(l)、ile(i)、pro(p)、phe(f)、trp(w)、met(m)(2)不帶電的極性：gly(g)、ser、thr(t)、cys(c)、tyr(y)、asn(n)、gln(q)(3)酸性：asp(d)、glu(e)(4)堿性：lys(k)、arg(r)、his(h)可選的，可以基于共同的側(cè)鏈特性，將天然存在的殘基分組：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)堿性：his、lys、arg；(5)影響鏈取向的殘基：gly、pro；(6)芳香族：trp、tyr、phe。非保守替換限定為將上述類型之一的成員交換為另一種類型。還可以替換不參與維持抗體的正確構(gòu)象的任何半胱氨酸殘基，一般是用絲氨酸，以改善分子的氧化穩(wěn)定性，并阻止異常交聯(lián)。相反，可以向多肽添加(一個(gè)或多個(gè))半胱氨酸鍵，以改善穩(wěn)定性(特別的是當(dāng)抗體是抗體片段，如fv片段時(shí))。特別優(yōu)選的替換變體類型涉及替換親代抗體(例如，人源化抗體)的一個(gè)或多個(gè)超變區(qū)殘基。一般而言，所獲得的選定用于進(jìn)一步研發(fā)的(一種或多種)變體將具有相對(duì)于生成其的親代抗體改善的生物學(xué)特性。用于生成這類替換變體的常規(guī)方法涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡(jiǎn)而言之，突變?nèi)舾沙儏^(qū)位點(diǎn)(例如，6-7個(gè)位點(diǎn))，以在每個(gè)位點(diǎn)生成所有的可能的氨基替換。如此生成的抗體變體以絲狀噬菌體顆粒的單價(jià)形式展示，作為與包裝在每個(gè)顆粒中的m13的基因iii產(chǎn)物的融合物。然后，如本文公開(kāi)的篩選經(jīng)噬菌體展示的變體的生物學(xué)活性(例如，結(jié)合親和力)。為了鑒別用于修飾的候選超變區(qū)位點(diǎn)，可以實(shí)施丙氨酸掃描誘變，鑒別對(duì)抗原結(jié)合有顯著貢獻(xiàn)的超變區(qū)殘基。可選的或額外的，有利的是分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以鑒別抗體和靶之間的接觸點(diǎn)。這類接觸殘基和臨近的殘基是根據(jù)本文所述技術(shù)進(jìn)行替換的候選物。一旦生成這類變體，就將變體組進(jìn)行本文所述的篩選，并可以選擇在一個(gè)或多個(gè)相關(guān)測(cè)定法中具有優(yōu)秀特性的抗體用于進(jìn)一步研發(fā)。多肽的另一種類型的氨基酸變體改變了抗體的原始糖基化模式。多肽可包含非氨基酸部分。例如，多肽可以是糖基化的。這類糖基化可以在宿主細(xì)胞或宿主生物表達(dá)多肽的過(guò)程中天然發(fā)生，或者可以是由人為干預(yù)產(chǎn)生的故意的修飾。改變意指刪除多肽中可見(jiàn)的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分，和/或添加多肽中不存在的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。多肽糖基化通常是n-連接的或o-連接的。n-連接的指碳水化合物部分連接到天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-x-絲氨酸和天冬酰胺-x-蘇氨酸，其中x是除脯氨酸以外的任何氨基酸，是用于酶促連接碳水化合物部分和天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。因此，多肽中存在這些三肽序列之一產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。o-連接糖基化指連接糖n-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一與羥基氨基酸，最常見(jiàn)是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。通過(guò)改變氨基酸序列使其含有上述三肽序列中的一種或多種，方便地實(shí)現(xiàn)向多肽添加糖基化位點(diǎn)(用于n-連接的糖基化位點(diǎn))。還可以通過(guò)對(duì)原始抗體的序列添加或替換一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基進(jìn)行改變(用于o-連接的糖基化位點(diǎn))。可以化學(xué)地、或酶促地、或通過(guò)突變替換編碼作為糖基化靶的氨基酸殘基的密碼子，實(shí)現(xiàn)去除存在于多肽上的碳水化合物部分?？梢酝ㄟ^(guò)使用多種內(nèi)切和外切糖苷酶，實(shí)現(xiàn)酶促切割多肽上的碳水化合物部分。其他修飾包括分別將谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基脫酰胺為相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基，脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酰和蘇氨酰殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的α-氨基的甲基化，n-末端胺的乙?；腿魏蝐-末端羧基的酰胺化。(ii)嵌合多肽可以以形成包含與另一種異源多肽或氨基酸序列融合的多肽的嵌合分子的方式修飾本文描述的多肽。在一些實(shí)施方案中，嵌合分子包含多肽與標(biāo)簽多肽的融合物，所述標(biāo)簽多肽提供了抗標(biāo)簽抗體可以選擇性結(jié)合的表位。表位標(biāo)簽一般位于多肽的氨基或羧基末端?？梢允褂冕槍?duì)標(biāo)簽多肽的抗體檢測(cè)多肽的這類經(jīng)表位標(biāo)記的形式的存在。此外，提供表位標(biāo)簽使多肽能夠通過(guò)親和純化而方便的純化，所述親和純化使用抗標(biāo)簽抗體或另一種類型的結(jié)合表位標(biāo)簽的親和基質(zhì)。在可選的實(shí)施方案中，嵌合分子可包含多肽與免疫球蛋白或與免疫球蛋白的特定區(qū)的融合物。嵌合分子的二價(jià)形式被稱為“免疫粘附素”。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“免疫粘附素”表示組合了異源多肽的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)子功能的抗體樣分子。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包含具有理想的結(jié)合特異性的、除了抗體的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)以外的(即，是“異源的”)氨基酸序列與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是連續(xù)的氨基酸序列，至少包含受體或配體的結(jié)合位點(diǎn)。免疫粘附素的免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列可以獲得自任何免疫球蛋白，如igg-1、igg-2、igg-3或igg-4亞型、iga(包括iga-1和iga-2)、ige、igd或igm。ig融合體優(yōu)選包括用多肽的可溶的形式(刪除或失活了跨膜結(jié)構(gòu)域)替換ig分子內(nèi)的至少一個(gè)可變區(qū)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫球蛋白融合體包括igg1分子的鉸鏈、ch2和ch3，或鉸鏈、ch1、ch2和ch3區(qū)。(iii)多肽綴合物用于多肽制劑中的多肽可以與細(xì)胞毒性劑綴合，如化療劑、生長(zhǎng)抑制劑、毒素(例如，細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射性綴合物)?？梢允褂糜糜谏蛇@類綴合物的化療劑。此外，可以使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉毒素a鏈、白喉毒素的非結(jié)合的活性片段、內(nèi)毒素a鏈(來(lái)自綠膿假單胞菌(pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素a鏈、相思豆毒素a鏈、塑蓮根毒素a鏈、α-帚曲霉素、油桐(aleuritesfordii)蛋白,石竹素蛋白、美洲商陸(phytolacaamericana)蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordicacharantia)抑制劑、麻瘋樹(shù)毒蛋白、巴豆毒蛋白、石堿草(sapaonariaofficinalis)抑制劑、白樹(shù)毒素、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、依諾霉素和tricothecene?？衫枚喾N放射性核苷酸生產(chǎn)放射綴合的多肽。例子包括212bi、131i、131in、90y和186re。使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑，如n-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二巰基)丙酯(spdp)、亞氨基硫烷(it)、酰亞胺酯的雙功能衍生物(如二亞胺代己二酸二甲酯hcl)、活性酯(如二琥珀酰亞胺辛二酸酯)、醛類(如戊二醛)、雙疊氮化合物(如雙(對(duì)疊氮苯甲酰)己二胺)、雙重氮衍生物(如雙-(對(duì)重氮苯甲酰)-乙二胺)、二異氰酸鹽(如tolyene2,6-二異氰酸)和雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制備多肽和細(xì)胞毒性劑的綴合物。例如，可以如vitetta等，science238：1098(1987)所述制備蓖麻毒素免疫毒素。碳-14-標(biāo)記的1-異硫氰基苯甲基3-甲基二乙烯三胺五乙酸(mx-dtpa)是示例性的用于綴合放射性核苷酸與多肽的螯合劑。本文還考慮了多肽與一種或多種小分子毒素(如加利車霉素、美登木素生物堿(maytansinoid)、trichothene和cc1065)以及這些毒素的具有毒素活性的衍生物的綴合物。美登木素生物堿是有絲分裂抑制劑，其通過(guò)抑制微管蛋白聚合發(fā)揮作用。美登素是從東非灌木齒葉美登木(maytenusserrata)中首次分離的。之后發(fā)現(xiàn)某些微生物也生產(chǎn)美登木素生物堿，如美登醇和c-3美登醇酯。還考慮合成的美登醇及其衍生物和類似物。存在許多本領(lǐng)域已知的用于制備多肽-美登木素生物堿綴合物的連接基團(tuán)，包括例如在美國(guó)專利號(hào)5,208,020中公開(kāi)的。連接基團(tuán)包括二硫化物基團(tuán)、硫醚基團(tuán)、酸不穩(wěn)定型基團(tuán)、光不穩(wěn)定型基團(tuán)、肽酶不穩(wěn)定型基團(tuán)，或酯酶不穩(wěn)定型基團(tuán)，如上述專利中公開(kāi)的，優(yōu)選二硫化物和硫醚基團(tuán)。接頭可以在多個(gè)位置與美登木素生物堿分子連接，取決于連接的類型。例如，可以通過(guò)使用常規(guī)的偶聯(lián)技術(shù)，通過(guò)與羥基反應(yīng)形成酯鍵。反應(yīng)可以發(fā)生在具有羥基的c-3位置、用羥甲基修飾的c-14位置、用羥基修飾的c-15位置和具有羥基的c-20位置。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在美登醇或美登醇類似物的c-3位成鍵。另一種目標(biāo)綴合物包含與一個(gè)或多個(gè)加利車霉素分子綴合的多肽。抗生素的加利車霉素家族能夠在亞皮摩爾濃度下產(chǎn)生雙鏈dna破裂。關(guān)于制備加利車霉素家族的綴合物，參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,712,374。可使用的加利車霉素的結(jié)構(gòu)類似物包括但不限于：γ1i、α2i、α3i、n-乙酰-γ1i、psag和θ1i?？贵w可以綴合的另一種抗腫瘤藥物是qfa，其是抗葉酸劑。加利車霉素和qfa都具有胞內(nèi)作用位點(diǎn)，且都不易于越過(guò)細(xì)胞膜。因此，這些活性劑通過(guò)多肽(例如，抗體)介導(dǎo)的內(nèi)化作用的細(xì)胞攝入，極大地增強(qiáng)了它們的細(xì)胞毒性效應(yīng)。其他可與本文所述的多肽綴合的抗腫瘤劑包括bcnu、鏈脲霉素、長(zhǎng)春新堿和5-氟尿嘧啶，被統(tǒng)稱為ll-e33288復(fù)合物的活性劑的家族，以及埃斯波霉素。在一些實(shí)施方案中，多肽可以是在多肽和具有核酸裂解活性的化合物(例如，核酶或dna內(nèi)切核酸酶，如脫氧核糖核酸酶；dna酶)之間的綴合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽(例如，抗體)可以與“受體”(如鏈霉親和素)綴合用于腫瘤預(yù)靶向，其中將多肽受體綴合物施用給患者，隨后使用清除劑從循環(huán)中去除未結(jié)合的綴合物，然后施用與細(xì)胞毒性劑(例如，放射性核苷酸)綴合的“配體”(例如，抗生物素蛋白)。在一些實(shí)施方案中，多肽可以與前藥活化酶綴合，所述酶將前藥(例如，肽類化療劑)轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥。免疫綴合物的酶組分包括任何能夠作用于前藥，使其轉(zhuǎn)化為更高活性的細(xì)胞毒性形式的酶。有用的酶包括但不限于：可用于將含有磷酸鹽的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；可用于將含有硫酸鹽的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳基硫酸酯酶；可用于將無(wú)毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥物，5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；可用于將含有肽的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的蛋白酶，如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶b和l)；可用于轉(zhuǎn)化含有d-氨基酸取代基的前藥的d-丙氨酰羧肽酶；可用于將糖基化的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的碳水化合物切割酶，如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；可用于將用β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的β-內(nèi)酰胺酶；和可分別用于將用苯氧乙?；虮揭阴；诎被幯苌乃幬镛D(zhuǎn)化為游離藥物的青霉素酰胺酶，如青霉素v酰胺酶或青霉素g酰胺酶?？蛇x的，可以使用具有酶促活性的抗體，在本領(lǐng)域也被稱為“抗體酶(abzyme)”，將前藥轉(zhuǎn)化為游離的活性藥物。(iv)其他多肽的另一種類型的共價(jià)修飾包含連接多肽與多種非蛋白質(zhì)類聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。還可以將多肽包埋在微膠囊中，所述微膠囊是通過(guò)例如凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合(分別例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)，在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)中，或在粗乳液中制備的。這類技術(shù)公開(kāi)在remington’spharmaceuticalsciences，第18版，gennaro,a.r.,編,(1990)中。iv.獲得用于制劑和方法中的多肽可以使用本領(lǐng)域普遍已知的方法獲得用于本文所述方法中的多肽，包括重組方法。下列章節(jié)提供了對(duì)這些方法的指導(dǎo)。(a)多核苷酸“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互換的使用，指任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合物，并且包括dna和rna。可以從任何來(lái)源獲得編碼多肽的多核苷酸，包括但不限于：從認(rèn)為具有多肽mrna并以可檢測(cè)的水平表達(dá)所述mrna的組織制備的cdna文庫(kù)。因此，可以從來(lái)自人組織制備的cdna文庫(kù)中便利的獲得編碼多肽的多核苷酸。還可以從基因組文庫(kù)或者通過(guò)已知的合成方法(例如，自動(dòng)化的核酸合成)獲得多肽編碼基因。例如，多核苷酸可以編碼整個(gè)免疫球蛋白分子鏈，如輕鏈或重鏈。完整的重鏈不僅包括重鏈可變區(qū)(vh)，還包括重鏈恒定區(qū)(ch)，所述重鏈恒定區(qū)通常包含3個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域：ch1、ch2和ch3；和“鉸鏈”區(qū)。在一些情況下，存在恒定區(qū)是理想的?？梢杂啥嗪塑账峋幋a的其他多肽包括結(jié)合抗原的抗體片段，如單結(jié)構(gòu)域抗體(“dab”)、fv、scfv、fab'和f(ab')2和“微抗體(minibody)”。微抗體(通常)是二價(jià)的抗體片段，從中切除了ch1和ck或cl結(jié)構(gòu)域。由于微抗體小于常規(guī)抗體，因此，其應(yīng)該在臨床/診斷用途中實(shí)現(xiàn)更好的組織滲透性，但由于二價(jià)，其應(yīng)該保持比單價(jià)抗體片段(如dab)更高的結(jié)合親和力。因此，除非上下文另外指出，否則本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”不僅涵蓋完整的抗體分子，還涵蓋上述類型的結(jié)合抗原的抗體片段。優(yōu)選地，存在于編碼的多肽中的每個(gè)框架區(qū)將包含相對(duì)于相應(yīng)的人受體框架的至少一個(gè)氨基酸替換。因此，例如，框架區(qū)可包含相對(duì)于受體框架區(qū)的共計(jì)3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸替換。適當(dāng)?shù)兀疚乃龅亩嗪塑账峥梢允欠蛛x的和/或純化的。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸是分離的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“分離的多核苷酸”意指分子是從其通常的或天然的環(huán)境中移出的或分離的，或者生產(chǎn)所述分子的方式使其不存在于其通常的或天然的環(huán)境中。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸是純化的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“純化的”意指已經(jīng)去除了至少一些污染分子或物質(zhì)。適當(dāng)?shù)?，多核苷酸是基本純化的，使相關(guān)的多核苷酸構(gòu)成了組合物中存在的主要(即，最高豐度的)多核苷酸。(b)表達(dá)多核苷酸下列說(shuō)明主要涉及通過(guò)培養(yǎng)用含有編碼多肽的多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生產(chǎn)多肽。當(dāng)然，也考慮本領(lǐng)域普遍已知可用于制備多肽的備選方法。例如，可以通過(guò)使用固相技術(shù)的直接肽合成(參見(jiàn)例如，stewart等，solid-phasepeptidesynthesisw.h.freemanco.,sanfrancisco,calif.(1969)；merrifield,j.am.chem.soc.85:2149-2154(1963))，生產(chǎn)恰當(dāng)?shù)陌被嵝蛄谢蚱洳糠??？梢允褂檬止ぜ夹g(shù)或通過(guò)自動(dòng)化，實(shí)施體外蛋白質(zhì)合成?？梢允褂美鏰ppliedbiosystems肽合成儀(fostercity,calif.)和生產(chǎn)商的說(shuō)明，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化合成。多肽的多個(gè)部分可以單獨(dú)化學(xué)合成并使用化學(xué)或酶促方法組合以生產(chǎn)理想的多肽。將本文所述的多核苷酸插入到(一個(gè)或多個(gè))表達(dá)載體中，用于生產(chǎn)多肽。術(shù)語(yǔ)“控制序列”指在特定的宿主生物中，表達(dá)有效連接的編碼序列所必需的dna序列?？刂菩蛄邪ǖ幌抻冢?jiǎn)?dòng)子(例如，天然相關(guān)的或異源啟動(dòng)子)、信號(hào)序列、增強(qiáng)子元件和轉(zhuǎn)錄終止序列。當(dāng)多核苷酸處于與另一種多核苷酸序列的功能性關(guān)系之中時(shí)，所述多核苷酸是“有效連接的”。例如，前序列或分泌先導(dǎo)序列的核酸是與多肽的核酸有效連接的如果其表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子是與編碼序列有效連接的如果其影響序列的轉(zhuǎn)錄；或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)是與編碼序列有效連接的如果其位置協(xié)助翻譯。一般而言，“有效連接的”意指連接的核酸序列是連續(xù)的，而在分泌先導(dǎo)序列的情況下，連接的核酸序列是連續(xù)的，并位于閱讀相中。然而，增強(qiáng)子不必是連續(xù)的。連接是通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)連接實(shí)現(xiàn)的。如果不存在這類位點(diǎn)，則根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸適體或接頭。對(duì)于抗體，輕鏈和重鏈可以克隆到相同或不同的表達(dá)載體中。編碼免疫球蛋白鏈的核酸片段是與(一個(gè)或多個(gè))表達(dá)載體中的控制序列有效連接的，所述控制序列確保免疫球蛋白多肽的表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)普遍已知的方法，將含有多核苷酸序列(例如，可變重鏈和/或可變輕鏈編碼序列，和任選的表達(dá)控制序列)的載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，所述方法取決于細(xì)胞宿主的類型而不同。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)染是常用于原核細(xì)胞的，而磷酸鈣處理、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、生物微粒轟擊或基于病毒的轉(zhuǎn)染也可用于其他的細(xì)胞宿主(一般參見(jiàn)sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual(coldspringharborpress，第2版，1989)。用于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的其他方法包括使用凝聚胺(polybrene)、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體、電穿孔和顯微注射。對(duì)于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可以將轉(zhuǎn)基因顯微注射到受精卵中，或者可以摻入到胚胎干細(xì)胞的基因組中，和將這類細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移到去核卵細(xì)胞中。(c)載體術(shù)語(yǔ)“載體”包括表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化載體和穿梭載體。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”意指能夠在體內(nèi)或體外表達(dá)的構(gòu)建體。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化載體”意指能夠從一個(gè)對(duì)象轉(zhuǎn)移到另一個(gè)對(duì)象的構(gòu)建體，所述對(duì)象可以是相同物種，或者可以是不同物種。如果構(gòu)建體能夠從一種物種轉(zhuǎn)移到另一物種中，如從大腸桿菌(escherichiacoli)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到細(xì)菌(如芽孢桿菌屬細(xì)菌)中，則轉(zhuǎn)化載體有時(shí)也被稱為“穿梭載體”。構(gòu)建體甚至能夠從大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌(agrobacterium)，再到植物中。可以將載體轉(zhuǎn)化到如下所述的提供多肽的表達(dá)的合適的宿主細(xì)胞中。多種載體是可公開(kāi)獲得的。載體可以是例如質(zhì)粒、粘粒、病毒顆?；蚴删w的形式?？梢酝ㄟ^(guò)多種方法將合適的核酸序列插入到載體中。一般而言，使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，將dna插入到(一個(gè)或多個(gè))恰當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶位點(diǎn)中。構(gòu)建含有一種或多種上述組分的合適載體應(yīng)用了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。載體可以是例如質(zhì)粒、病毒或噬菌體載體，其提供了復(fù)制起點(diǎn)，任選用于表達(dá)所述多核苷酸的啟動(dòng)子和任選所述啟動(dòng)子的調(diào)控子。載體可含有本領(lǐng)域普遍已知的一個(gè)或多個(gè)可選擇的標(biāo)志物基因。這些表達(dá)載體在宿主生物中通常是可復(fù)制的，作為附加體或作為宿主染色體dna的整合部分。(d)宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞可以是例如細(xì)菌、酵母或其他真菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。被遺傳改造的轉(zhuǎn)基因多細(xì)胞宿主生物可用于生產(chǎn)多肽。生物可以是例如轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物(例如，轉(zhuǎn)基因山羊或小鼠品系)。合適的原核生物包括但不限于真細(xì)菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物，例如腸桿菌科(enterobacteriaceae)，如大腸桿菌。多種大腸桿菌菌株是可公眾獲得的，如大腸桿菌k12菌株mm294(atcc31,446)；大腸桿菌x1776(atcc31,537)；大腸桿菌菌株w3110(atcc27,325)和k5772(atcc53,635)。其他合適的原核宿主細(xì)胞包括腸桿菌科，如埃希氏菌(escherichia)，如大腸桿菌、腸桿菌屬(enterobacter)、歐文氏菌屬(erwinia)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙門(mén)氏菌屬(salmonella)，如鼠傷寒沙門(mén)氏菌(salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌屬(serratia)，如粘質(zhì)沙雷氏菌(serratiamarcescans)和志賀氏菌屬(shigella)，以及芽孢桿菌屬(bacilli)，如枯草芽孢桿菌(b.subtilis)和地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)(例如，地衣芽孢桿菌41p)、假單胞菌屬(pseudomonas)，如綠膿假單胞菌(p.aeruginosa)和鏈霉菌屬(streptomyces)。這些例子是示例性的，而非限制性的。菌株w3110是一個(gè)特別優(yōu)選的宿主或親代宿主，因?yàn)樗怯糜谥亟M多核苷酸產(chǎn)物發(fā)酵的通常的宿主菌株。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞分泌最少量的蛋白水解酶。例如，可以修飾菌株w3110，以在編碼宿主內(nèi)源性多肽的基因中產(chǎn)生遺傳突變，這類宿主的例子包括大腸桿菌w3110菌株1a2，其具有完整的基因型tona；大腸桿菌w3110菌株9e4，其具有完整的基因型tonaptr3；大腸桿菌w3110菌株27c7(atcc55,244)，其具有完整的基因型tonaptr3phoae15(argf-lac)169degpomptkan'；大腸桿菌w3110菌株37d6，其具有完整的基因型tonaptr3phoae15(argf-lac)169degpomptrbs7ilvgkan'；大腸桿菌w3110菌株40b4，其是具有非卡那霉素抗性degp缺失突變的菌株37d6；和具有突變的周質(zhì)蛋白酶的大腸桿菌菌株?？蛇x的，體外克隆方法，例如pcr或其他核酸聚合酶反應(yīng)是合適的。在這些原核宿主中，可以制備表達(dá)載體，所述表達(dá)載體通常含有與宿主細(xì)胞相容的表達(dá)控制序列(例如復(fù)制起點(diǎn))。此外，可以存在任意數(shù)量的多種普遍已知的啟動(dòng)子，如乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子系統(tǒng)，或來(lái)自噬菌體λ的啟動(dòng)子系統(tǒng)。啟動(dòng)子通?？刂票磉_(dá)，任選地具有操縱子序列，和具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列等，用于起始和完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。可使用真核微生物表達(dá)。真核微生物，如絲狀真菌或酵母是多肽編碼載體的合適的克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其他的包括粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)；克魯維酵母屬(kluyveromyces)宿主，例如乳酸克魯維酵母(k.lactis)(mw98-8c、cbs683、cbs4574)、脆壁克魯維酵母(k.fragilis(atcc12,424))、保加利亞克魯維酵母(k.bulgaricus(atcc16,045))、威克克魯維酵母(k.wickeramii(atcc24,178))、k.waltii(atcc56,500)、果蠅克魯維酵母(k.drosophilarum(atcc36,906))、耐熱克魯維酵母(k.thermotolerans)和馬克思克魯維酵母(k.marxianus)；耶氏酵母屬(yarrowia(ep402,226))；巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)；假絲酵母屬(candida)；里氏木霉(trichodermareesia)；粗糙脈孢霉(neurosporacrassa)；許旺酵母屬(schwanniomyces)，如西方許旺酵母(schwanniomycesoccidentalis)；和絲狀真菌，如脈孢霉屬(neurospora)、青霉屬(penicillium)、彎頸霉屬(tolypocladium)和曲霉屬(aspergillus)宿主，如構(gòu)巢曲霉(a.nidulans)和黑曲霉(a.niger)。甲基營(yíng)養(yǎng)缺陷型酵母在本文中是合適的，包括但不限于：能夠在甲醇中生長(zhǎng)的酵母，選自漢森酵母屬(hansenula)、假絲酵母屬、克勒克酵母屬(kloeckera)、畢赤酵母屬(pichia)、酵母屬(saccharomyces)、球擬酵母屬(torulopsis)和紅酵母屬(rhodotorula)組成的屬。酵母屬是優(yōu)選的酵母宿主，其具有合適的載體，所述載體具有理想的表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子)、復(fù)制起點(diǎn)、終止序列等。典型的啟動(dòng)子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。誘導(dǎo)型酵母啟動(dòng)子尤其包括來(lái)自醇脫氫酶、異細(xì)胞色素c和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子等。除微生物以外，也可以使用哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)和生產(chǎn)本文所述的多肽，且在一些情況下是優(yōu)選的(參見(jiàn)winnacker,fromgenestoclonesvchpublishers,n.y.,n.y.(1987))。對(duì)于一些實(shí)施方案，真核細(xì)胞是優(yōu)選的，因?yàn)楸绢I(lǐng)域中已經(jīng)研發(fā)了多種能夠分泌異源多肽(例如，整個(gè)免疫球蛋白)的合適的宿主細(xì)胞系，包括cho細(xì)胞系、多種cos細(xì)胞系、hela細(xì)胞，優(yōu)選骨髓瘤細(xì)胞系或經(jīng)轉(zhuǎn)化的b細(xì)胞或雜交瘤。在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞是cho細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子是用sv40(cos-7，atcccrl1651)轉(zhuǎn)化的猴腎cv1細(xì)胞系；人胎腎細(xì)胞系(293或亞克隆用于在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的293細(xì)胞)；胎鼠腎細(xì)胞(bhk，atccccl10)；中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-dhfr(cho或cho-dp-12細(xì)胞系)；小鼠支持細(xì)胞；猴腎細(xì)胞(cv1atccccl70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(vero-76，atcccrl-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(hela，atccccl2)；犬腎細(xì)胞(mdck，atccccl34)；布法羅大鼠肝細(xì)胞(brl3a，atcccrl1442)；人肺細(xì)胞(w138，atccccl75)；人肝細(xì)胞(hepg2,hb8065)；小鼠乳腺腫瘤(mmt060562，atccccl51)；tri細(xì)胞；mrc5細(xì)胞；fs4細(xì)胞；和人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系(hepg2)。v.制劑和制備制劑的方法本文還提供了包含通過(guò)本文所述方法純化的多肽(例如，抗體)的制劑，和制備制劑的方法。例如，純化的多肽可以與可藥用的運(yùn)載體組合。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)混合具有理想純度的多肽與任選的可藥用的運(yùn)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(remington’spharmaceuticalsciences，第16版，osol、a.編著(1980))，可以制備多肽制劑用于以凍干制劑或含水溶液的形式儲(chǔ)藏。本文使用的“運(yùn)載體”包括可藥用的運(yùn)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，其對(duì)在應(yīng)用的劑量和濃度下暴露于其的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物是無(wú)毒的。通常，生理上可接受的運(yùn)載體是含水的ph緩沖溶液?？山邮艿倪\(yùn)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用劑量和濃度下對(duì)受體是無(wú)毒的，并且包括緩沖劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如，十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或芐醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯，如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚；雷鎖酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如edta；糖類，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽的反離子，如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如，zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)和/或非離子型表面活性劑，如tweentm、pluronicstm或聚乙二醇(peg)。在一些實(shí)施方案中，多肽制劑中的多肽保持了功能性活性。用于體內(nèi)施用的制劑必須是無(wú)菌的。可以通過(guò)無(wú)菌濾膜過(guò)濾方便的實(shí)現(xiàn)。本文中的制劑還可含有對(duì)治療的特定適應(yīng)癥所必需的一種以上的活性化合物，優(yōu)選地是具有并不不利地影響彼此的互補(bǔ)活性的那些化合物。例如，除多肽外，理想的是在一個(gè)制劑內(nèi)包括額外的多肽(例如，抗體)?？蛇x的或額外的，組合物還可包含化療劑、細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)抑制劑、抗激素劑和/或心血管保護(hù)劑。這類分子合適的以對(duì)預(yù)期目的有效的量的組合存在。v.制品由本文所述的方法純化的多肽和/或包含通過(guò)本文所述方法純化的多肽的制劑可以包含在制品中。制品可包含含有多肽和/或多肽制劑的容器。優(yōu)選地，制品包含：(a)容器，所述容器在容器中包含含有本文所述的多肽或多肽制劑的組合物；和(b)具有用于向?qū)ο笫┯弥苿┑恼f(shuō)明的包裝說(shuō)明書(shū)。制品包含容器，和位于容器上或與容器相連的標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書(shū)。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以用多種材料制成，如玻璃或塑料。容器持有或含有制劑，并可具有無(wú)菌的進(jìn)口(例如，容器可以是靜脈溶液袋或具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的小瓶)。組合物中的至少一種活性劑是多肽。標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書(shū)說(shuō)明了組合物在對(duì)象中的用途，對(duì)所提供的多肽和任何其他藥物的給藥劑量和時(shí)間間隔給予具體指導(dǎo)。制品還可以包括其他從商業(yè)和用戶角度有利的材料，包括其他緩沖劑、稀釋劑、過(guò)濾器、針頭和注射器。在一些實(shí)施方案中，容器是注射器。在一些實(shí)施方案中，注射器還包含在注射裝置中。在一些實(shí)施方案中，注射裝置是自動(dòng)注射器?！鞍b說(shuō)明書(shū)”用于指習(xí)慣性地包含在治療性產(chǎn)物的商業(yè)包裝中的說(shuō)明書(shū)，含有關(guān)于適應(yīng)癥、用法、劑量、施用、禁忌癥候，與包裝產(chǎn)物組合的其他治療性產(chǎn)物的信息，和/或?qū)κ褂眠@類治療性產(chǎn)物的警告。vi.示例性實(shí)施方案在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于從包含多肽和一種或多種污染物的組合物中純化多肽的方法，所述方法包括a)以超過(guò)層析材料對(duì)于多肽的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量的量將組合物裝載到層析材料上，b)在其中一種或多種污染物仍然與層析材料結(jié)合的條件下，從層析材料上洗脫多肽，和c)混合包含步驟a)和b)的層析流出液中的多肽的級(jí)分。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，多肽是抗體或免疫粘附素。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，多肽是免疫粘附素。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，多肽是抗體。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。在上述實(shí)施方案的另一實(shí)施方案中，單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，單克隆抗體是igg單克隆抗體。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，抗體是抗原結(jié)合片段。在上述實(shí)施方案的另一實(shí)施方案中，抗原結(jié)合片段選自fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、scfv、di-scfv、bi-scfv、串聯(lián)(di,tri)-scfv、fv、sdab、三功能抗體、bite、雙抗體或三價(jià)抗體。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，多肽選自酶、激素、融合蛋白、含有fc的蛋白質(zhì)、免疫綴合物、細(xì)胞因子或白介素。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，至少一種污染物是中華倉(cāng)鼠卵巢蛋白(chop)、宿主細(xì)胞蛋白(hcp)、泄露的蛋白a、羧肽酶b、核酸、dna、產(chǎn)物變體、聚集的蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)基組分、慶大霉素、多肽片段、內(nèi)毒素和病毒性污染物中的任何一種或多種。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，層析材料選自混合模式材料、陰離子交換材料、疏水性相互作用材料和親和材料。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，裝載密度在約50g/l至約2000g/l之間。在上述實(shí)施方案的另一實(shí)施方案中，裝載密度在約200g/l至約1000g/l之間。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，以約層析材料對(duì)于一種或多種污染物的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量將組合物裝載到層析材料上。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，以層析材料對(duì)于多肽的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量的20倍將組合物裝載到層析材料上。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，層析材料的多肽分配系數(shù)大于30。在上述實(shí)施方案的仍然其他的實(shí)施方案中，層析材料的多肽分配系數(shù)大于100。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，方法還包括使用裝載緩沖液和洗脫緩沖液。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的電導(dǎo)率的電導(dǎo)率。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，裝載緩沖液具有約4.0ms至約7.0ms的電導(dǎo)率。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有約0.0ms至約7.0ms的電導(dǎo)率。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的電導(dǎo)率的電導(dǎo)率。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，裝載緩沖液具有約4.0ms至約7.0ms的電導(dǎo)率。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有約5.5ms至約17.0ms的電導(dǎo)率。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的電導(dǎo)率在約10倍柱體積(cv)中以從約5.5ms至約1.0ms的梯度減少。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的電導(dǎo)率在約15cv中以從約5.5ms至約1.0ms的梯度減少。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的電導(dǎo)率在約5cv中以從約10.0ms至約1.0ms的梯度減少。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的電導(dǎo)率在約10倍cv中以從約10.9ms至約1.0ms的梯度減少。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的ph的ph。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，裝載緩沖液具有約4至約9的ph。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有約4至約9的ph。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的ph的ph。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，裝載緩沖液具有約4至約9的ph。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液具有約4至約9的ph。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，組合物是來(lái)自親和層析、陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析和疏水性相互作用層析的洗出液。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，親和層析是蛋白a層析.在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，多肽是進(jìn)一步純化的。在上述實(shí)施方案的仍然其他的實(shí)施方案中，多肽是通過(guò)病毒過(guò)濾進(jìn)一步純化的。在上述實(shí)施方案的仍然其他的實(shí)施方案中，多肽是通過(guò)親和層析、陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析或疏水性相互作用層析中的一種或多種進(jìn)一步純化的。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，多肽是進(jìn)一步濃縮的。在上述實(shí)施方案的仍然其他的實(shí)施方案中，多肽是通過(guò)超濾、滲濾或超濾和滲濾的組合而濃縮的。在上述實(shí)施方案的其他實(shí)施方案中，方法還包括組合多肽與可藥用的運(yùn)載體。本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的所有特征都可以以任何組合方式組合。本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的每個(gè)特征都可以被用于相同、等價(jià)或相似目的的備選特征取代。因此，除非另外明確指出，否則所公開(kāi)的每個(gè)特征都只是一系列等價(jià)或相似特征的例子。下列非限制性的例子示例了本發(fā)明的其他細(xì)節(jié)。說(shuō)明書(shū)中所有參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容都通過(guò)引用明確整合到本文中。實(shí)施例下列實(shí)施例僅用于純粹的示例本發(fā)明，不應(yīng)被視為以任何方式限制本發(fā)明。下列實(shí)施例和詳細(xì)的說(shuō)明書(shū)僅供示例，而不作為限制。材料和方法除非實(shí)施例中另外指出，否則所有實(shí)施例的材料和方法都如下所示實(shí)施。mab原料所有實(shí)施例的mab原料都選自genentech(southsanfrancisco,ca,u.s.a.)的工業(yè)的、試驗(yàn)性的或小規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)批次。在細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵期后，分離細(xì)胞，并通過(guò)蛋白a層析純化澄清的液體。蛋白a混合物用于研究雜質(zhì)清除的機(jī)制。表2顯示了用于實(shí)施例中的每個(gè)mab的原料特征。表2.mab原料的特征mab定量使用uv-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(8453型g1103a；agilenttechnologies；santaclara,ca,u.s.a.)或nanodrop1000型nd-1000(thermofisherscientific；waltham,ma,u.s.a.)，通過(guò)280和320nm處的吸光值，確定抗體濃度。除抗體以外的其它物質(zhì)(即，雜質(zhì))濃度太低，以至于對(duì)uv吸光值沒(méi)有可見(jiàn)的效果。根據(jù)需要，用恰當(dāng)?shù)姆歉蓴_稀釋劑稀釋樣品至0.1–1.0吸光值單位的范圍內(nèi)。對(duì)樣品制備和uv測(cè)量實(shí)施2次，記錄平均值。mab的吸收系數(shù)是在1.42至1.645/mg·ml·cm的范圍內(nèi)。cho宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(chop)定量使用elisa定量被稱為chop的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的水平。將抗chop抗體固定在微滴度板的孔中。在孔中孵育含有chop的樣品的稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)照，再與綴合了辣根過(guò)氧化物(hrp)的抗chop抗體孵育。用對(duì)苯二胺檢測(cè)hrp酶促活性，通過(guò)在微滴度板讀板器中讀取490nm的吸光值定量chop?；趭A心elisa的原理，過(guò)氧化物酶的濃度對(duì)應(yīng)于chop濃度。elisa的測(cè)定范圍通常是5–320ng/ml，測(cè)定內(nèi)變異<10％。以ng/ml為單位報(bào)告chop值。可選的，用chop值除以mab濃度，并用ppm(百萬(wàn)分之一；例如，ngchop/mgmab)報(bào)告結(jié)果。chopelisa可用于定量樣品中的總chop水平，但沒(méi)有定量單個(gè)蛋白質(zhì)的濃度。層析操作條件captoadhere和captommccaptoadhere樹(shù)脂是從gehealthcare(uppsala,sweden)獲得的。強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(porosxs和poros50hs)是從appliedbiosystems(address)獲得的。所有的實(shí)驗(yàn)室層析實(shí)驗(yàn)都是使用來(lái)自gehealthcare(uppsala,sweden)的aktafplc層析系統(tǒng)執(zhí)行的，該系統(tǒng)利用unicorn軟件。實(shí)驗(yàn)室柱的直徑為0.66cm，高度為10–20cm。在裝載前，將柱子平衡至指明的ph和電導(dǎo)率操作條件。然后，將蛋白a混合物裝載到柱子上，再用所需的洗脫緩沖液洗脫下結(jié)合的蛋白質(zhì)。收集在裝載，過(guò)載和洗脫階段過(guò)程中的流通液或洗出液級(jí)分，然后分析雜質(zhì)。mab的裝載密度在每升樹(shù)脂100至1000g之間改變。層析混合物分析收集在裝載、過(guò)載和洗脫階段過(guò)程中的流通混合物級(jí)分(每者1倍柱體積)，分析mab濃度、chop濃度、聚集物、泄露的蛋白a、chodna和產(chǎn)率。生成累積圖作為洗脫混合級(jí)分的函數(shù)。使用等式1獲得累積產(chǎn)率。其中，對(duì)于級(jí)分i，ci是mab濃度(mg/ml)，vi是級(jí)分的體積(ml)，mp是裝載的蛋白質(zhì)的質(zhì)量(mg)。大小排阻層析通過(guò)高性能大小排阻層析測(cè)定法，確定單克隆抗體的大小異質(zhì)性。在環(huán)境溫度在1200系列hplc儀器(agilenttechnologies)上運(yùn)行由tosohbioscience(tokyo,japan)生產(chǎn)的tskg3000swxlsec柱(直徑＝7.8mm，高度＝300mm；零件號(hào)08541)，用于確定mab單體對(duì)于收集的樣品的相對(duì)水平。柱的操作流速為0.3ml/min，使用200mm磷酸鉀、250mm氯化鉀ph6.2移動(dòng)相。每個(gè)樣品注射20μg抗體。使用280nm處的uv吸光值監(jiān)控單體、lmw蛋白質(zhì)和hmw蛋白質(zhì)的分離。使用chemstation軟件(agilenttechnologies)手工分析單體、lmw蛋白質(zhì)和hmw蛋白質(zhì)的百分比。chodna定量使用實(shí)時(shí)pcr(taqmanpcr)定量產(chǎn)物樣品中的chodna。首先使用qiagen’svirusbiorobot試劑盒，提取樣品和對(duì)照中的dna。在96孔板中，用abi的序列檢測(cè)系統(tǒng)，用pcr引物和探針對(duì)提取的樣品、對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)dna進(jìn)行taqman實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)。用中國(guó)地鼠(cricetulusgriseus)基因組中的110堿基對(duì)的重復(fù)dna序列區(qū)段定義引物。用熒光報(bào)告染料在5’端和淬滅染料在3’端標(biāo)記引物。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告子的發(fā)射光譜被淬滅劑抑制。聚合酶的5’核酸酶活性水解探針，并釋放出報(bào)告子，導(dǎo)致熒光發(fā)射增加。序列檢測(cè)儀對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物的定量與dna擴(kuò)增過(guò)程中連續(xù)測(cè)量到的熒光發(fā)射光的增加成比例。dna擴(kuò)增超過(guò)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)(ct)被計(jì)算為標(biāo)準(zhǔn)曲線。生成范圍在1pg/ml-10,000pg/ml之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于定量樣品中的dna。泄露的蛋白a定量通過(guò)夾心蛋白質(zhì)-aelisa，確定蛋白a混合物中的泄露的蛋白a的水平。將雞抗葡萄球菌蛋白a抗體固定在微滴度板的孔中。樣品處理程序包括樣品稀釋和然后使用微波輔助加熱解離蛋白a/igg復(fù)合物，作為在夾心elisa上運(yùn)行樣品之前的預(yù)處理步驟。如果樣品中存在蛋白a，則將與包被的抗體結(jié)合。使用綴合了辣根過(guò)氧化物酶的抗蛋白a抗體檢測(cè)結(jié)合的蛋白a。用產(chǎn)生比色信號(hào)的2組分的tmb底物溶液定量辣根過(guò)氧化物酶的酶促活性。原料條件作用用于本研究實(shí)驗(yàn)的原料是新鮮的，或者是從冷藏(2–8℃或–70℃)中移出的，并允許其平衡至室溫。之后，必要時(shí)，用滴定劑(1.5mtris堿或1m醋酸)或稀釋劑(純水、5m氯化鈉，或5m醋酸鈉)調(diào)節(jié)ph和/或電導(dǎo)率。使用millipak20(millipore)、acropaktm20(pallcorporation)或真空過(guò)濾器(thermofisherscientific,rochester,ny,u.s.a.)，對(duì)全部原料進(jìn)行0.2μm過(guò)濾。高通量篩選使用tecanfreedomevo200機(jī)器人(tecanus,researchtrianglepark,nc)進(jìn)行液相和樹(shù)脂處理。使用96孔過(guò)濾板(seahorse800μl聚丙烯0.45μm短滴濾板，e&kscientificek-2223)孵育樹(shù)脂和蛋白質(zhì)與緩沖液。在用蛋白質(zhì)溶液孵育樹(shù)脂之后，在1200xg離心濾板3分鐘，分離溶液和樹(shù)脂。對(duì)于每個(gè)階段，將300ml溶液與50ml樹(shù)脂接觸，獲得6:1的相體積比。將每個(gè)孔平衡至恰當(dāng)?shù)膒h和醋酸鈉濃度。ph范圍是從5.00至7.5，以0.5ph單位的間隔(使用醋酸鹽緩沖ph5.00至5.5的條件，使用mes緩沖ph6.00至6.5的條件，使用mops緩沖7.00至7.5的條件)。在室溫實(shí)施所有的實(shí)驗(yàn)。將濃縮至5g/l或97mg/ml的部分純化的蛋白a混合物，交換為15mmnaoac的緩沖液作為這些實(shí)驗(yàn)的裝載液。實(shí)驗(yàn)中用5g/l挑戰(zhàn)樹(shù)脂，以確定產(chǎn)物kp值。然而，對(duì)于實(shí)際的產(chǎn)物結(jié)合容量，用97g/l挑戰(zhàn)樹(shù)脂。濾液被捕獲在收集平板中，然后使用infinitem200讀板器分析。之后，使用2個(gè)階段的2mnacl緩沖液從樹(shù)脂上剝離結(jié)合的蛋白質(zhì)，以結(jié)束質(zhì)量平衡。病毒清除研究該研究的目的是評(píng)估captoadhere對(duì)2模型病毒(mmv和x-mulv)的病毒去除能力。用幼稚樹(shù)脂裝填0.66cm直徑的柱，至20cm床高度。mab原料摻入1％病毒，然后經(jīng)過(guò)captoadhere樹(shù)脂處理。立即收集混合物，并測(cè)定裝載和洗脫樣品的病毒計(jì)數(shù)。制備使用完全培養(yǎng)基(1:10和1:100)的混合物的多次稀釋物，以確定在緩沖液組分和病毒之間的任何潛在干擾。實(shí)施例1.高通量篩選該實(shí)施例描述了用于確定層析材料的結(jié)合容量的高通量篩選方法。在分批結(jié)合條件下，對(duì)單克隆抗體mab3在captoadhere樹(shù)脂上實(shí)施高通量篩選。圖1展示了結(jié)合條件的高通量篩選的結(jié)果。在響應(yīng)表面的附圖(圖1a和1b)中，紅色表示產(chǎn)物結(jié)合區(qū)(圖1a的區(qū)8和圖1b的區(qū)7)，綠色為產(chǎn)物(例如多肽)非結(jié)合區(qū)(表示為區(qū)1)。上清液中的實(shí)際的宿主細(xì)胞蛋白(hcp)含量(ng/mg)顯示為圖1c的等值線圖。圖1a顯示了mab3的產(chǎn)物kp作為ph和反離子濃度的函數(shù)。將樹(shù)脂裝載至5g/l，使用響應(yīng)表面模型分析原始數(shù)據(jù)。然后，使用模型估算實(shí)驗(yàn)空間中對(duì)于ph和反離子濃度的任意組合的kp。數(shù)據(jù)顯示，隨著ph增加和隨著電導(dǎo)率增加，logkp也增加。logkp的增加反映了產(chǎn)物與樹(shù)脂結(jié)合的增加。為了找出樹(shù)脂上的實(shí)際產(chǎn)物結(jié)合容量，以組合了不同的ph和反離子濃度的48種不同條件，用80g/l挑戰(zhàn)樹(shù)脂(圖1b)。還分析了來(lái)自相同實(shí)驗(yàn)平板的上清液的hcp(ng/mg)，數(shù)據(jù)繪制為等值線的形式(圖1c)。使用含有數(shù)千ppm的chop的部分純化的蛋白a混合物作為高通量篩選實(shí)驗(yàn)的裝載物。圖中的綠色區(qū)(區(qū)1)表示上清液中chop的較低量，紅色區(qū)(圖1b的區(qū)8和圖1c的區(qū)9)表示上清液中chop的較高量?？梢愿鶕?jù)chop和結(jié)合數(shù)據(jù)的等值線圖確定最優(yōu)裝載和洗脫條件的設(shè)計(jì)空間。這些圖使得能夠設(shè)計(jì)流通的操作模式或結(jié)合和洗脫的操作模式。用于完整的流通層析的裝載條件一般是這樣的條件，其中產(chǎn)物結(jié)合最小化，例如多肽結(jié)合，而雜質(zhì)(chop)結(jié)合最大化。圖1b和1c之間完全重疊的綠色區(qū)(區(qū)1)提示能夠進(jìn)行f/t模式。然而，該圖中的綠色區(qū)(區(qū)1)是電導(dǎo)率很低～1ms的區(qū)。該條件需要將蛋白a混合物稀釋約4倍，可能導(dǎo)致規(guī)模上設(shè)備適合的潛在問(wèn)題。紅色區(qū)(圖1b的區(qū)7和圖1c的區(qū)8)表示mab和chop的結(jié)合區(qū)。在兩幅圖中都存在一些重疊的紅色區(qū)域。然而，圖1b顯示，在可操作的ph和反離子濃度條件下，55g/l的最大結(jié)合容量是可能的。對(duì)于～3.5g/l細(xì)胞培養(yǎng)物滴度的高滴度過(guò)程，需要在1000l柱上1個(gè)循環(huán)回收所有的產(chǎn)物(如多肽)，而在較小的柱子上則必須進(jìn)行多個(gè)循環(huán)。在oec模式中，可以基于雜質(zhì)(例如，chop)在柱上的行為選擇裝載條件。不太需要關(guān)注與柱子結(jié)合的mab的量，因?yàn)榭梢酝ㄟ^(guò)洗脫階段回收結(jié)合的mab。因此，有整個(gè)實(shí)驗(yàn)空間以設(shè)計(jì)裝載條件，從而在不受樹(shù)脂的產(chǎn)物結(jié)合容量的限制下，獲得最大的雜質(zhì)清除。盡管結(jié)合和洗脫模式允許55g/l裝載密度，oec允許約10倍高的裝載容量，從而允許用較小的柱子執(zhí)行，這反過(guò)來(lái)可以降低每克產(chǎn)物的樹(shù)脂成本，提供良好的設(shè)備適應(yīng)性。實(shí)施例2.優(yōu)化的oec模式將hts數(shù)據(jù)用于參數(shù)確定以在oec模式中操作?；谘b載密度要求、設(shè)備適應(yīng)性和雜質(zhì)清除，選擇mab3的裝載條件為ph6.5和5.5ms/cm。圖2顯示的優(yōu)化的層析運(yùn)行的裝載密度是180g/l。在裝載階段，約50g/l多肽產(chǎn)物與樹(shù)脂結(jié)合。從約0.5od開(kāi)始收集產(chǎn)物混合物，產(chǎn)物在樹(shù)脂上過(guò)載多至180g/l。在完成裝載階段后，使用具有1ms/cm的低電導(dǎo)率緩沖液(洗脫緩沖液：20mmmesph6.5)的洗脫階段，洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致相比流通層析減少10-15％混合物體積。圖3顯示了該層析運(yùn)行的產(chǎn)率和雜質(zhì)清除率。實(shí)施例3.裝載優(yōu)化進(jìn)行該研究比較hts數(shù)據(jù)和oec操作模式中的實(shí)際柱性能數(shù)據(jù)。在3種不同的ph對(duì)柱進(jìn)行裝載?；诔跏糲hop清除和產(chǎn)率數(shù)據(jù)，選擇ph6.5為最佳條件?；旌衔镏械腸hop濃度范圍在900至50至400ppm，作為裝載ph的函數(shù)。根據(jù)該研究，確定ph6.5是裝載組合物的最佳條件。此外，雖然產(chǎn)率沒(méi)有優(yōu)化，但ph6.5仍提供了最大的產(chǎn)率(圖3，表3)。表3.oec模式的裝載條件優(yōu)化實(shí)施例4.洗脫優(yōu)化進(jìn)行該研究?jī)?yōu)化oec的洗脫條件。為了回收在裝載階段期間結(jié)合的產(chǎn)物(mab3,～50g/l)，在結(jié)束裝載階段后，將若干倍柱體積的洗滌緩沖液(50mmmes，30mm醋酸鈉，ph6.5，～5.5ms/cm)流過(guò)柱子。觀察到大量拖尾，導(dǎo)致裝載階段結(jié)束時(shí)的混合物體積增加。使用與裝載緩沖液具有相似ph和電導(dǎo)率的洗滌緩沖液時(shí)，混合物體積增加約45％。該混合物體積的增加可能導(dǎo)致設(shè)備適應(yīng)性的問(wèn)題(圖4)。洗脫優(yōu)化研究的目的是獲得最大產(chǎn)率、最小chop和最大混合物體積減少。洗脫階段用于從柱上洗脫50g/l的結(jié)合產(chǎn)物。圖5顯示了層析圖的洗脫階段。較低電導(dǎo)率緩沖液在2倍柱體積內(nèi)從柱上洗脫下產(chǎn)物，導(dǎo)致更高的產(chǎn)率和較低的混合物體積(表4)。另一方面，較高電導(dǎo)率的洗脫緩沖液導(dǎo)致大于8倍柱體積的拖尾。如表4所示，在所有嘗試的洗脫緩沖液中，混合物chop都小于20ppm。因此，選擇20mmmes作為洗脫緩沖液，以增加產(chǎn)率和最小化拖尾。表4.oec的洗脫優(yōu)化實(shí)施例5.oec的雜質(zhì)分析分析來(lái)自oec的級(jí)分的雜質(zhì)。圖6a顯示了在裝載階段期間和洗脫階段期間收集的級(jí)分中的mab濃度和chop水平。在裝載階段期間，chop保持在20-25ppm之間，而在僅洗脫結(jié)合的mab的洗脫階段期間，級(jí)分的chop水平減少。累積分析證實(shí)chop和其他雜質(zhì)在整個(gè)裝載和洗脫階段都仍然是相當(dāng)一致的(圖6b)。該運(yùn)行的裝載密度是180g/l。還研究了相同裝載密度的病毒清除，使用x-mulv和mmv作為模式病毒(表5)。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)，裝載ph是6.5，裝載電導(dǎo)率是5.5ms/cm。洗脫條件是20mmmesph6.5和電導(dǎo)率～1ms/cm。表5.oec模式層析的病毒清除實(shí)施例6.最大雜質(zhì)結(jié)合容量確定為了找到通過(guò)oec模式用mab3裝載的樹(shù)脂的最大雜質(zhì)結(jié)合容量，用1000g/l蛋白a混合物挑戰(zhàn)captoadhere樹(shù)脂。裝載緩沖液是ph6.5，～5.5ms/cm；洗脫緩沖液是20mmmesph6.5，～1ms/cm。收集每50g/l的混合物樣品，分析chop和蛋白質(zhì)濃度(圖7)。對(duì)于高達(dá)800g/l的裝載密度，chop沒(méi)有貫穿，且洗出液中的chop小于20ng/mg。實(shí)施例7.以試驗(yàn)性規(guī)模執(zhí)行在大小從1.6l至10.8l的試驗(yàn)性規(guī)模柱上執(zhí)行oec操作模式。柱直徑范圍從10cm至25cm，床高度范圍是20-22cm(表6)。在ph6.5，～5.5ms/cm裝載樣品，并用20mmmesph6.5，～1ms/cm洗脫。試驗(yàn)性規(guī)模運(yùn)行中的產(chǎn)率顯示在圖8中。試驗(yàn)性規(guī)模運(yùn)行中的裝載密度覆蓋了從70至180g/l的裝載密度范圍。在全部裝載密度中，實(shí)現(xiàn)了94％的平均產(chǎn)率。在測(cè)試的裝載密度范圍內(nèi)，對(duì)產(chǎn)率沒(méi)有影響。在所有的試驗(yàn)性規(guī)模運(yùn)行中，oec模式混合物chop小于25ppm，然后在下游清除至在最終的多肽產(chǎn)物(ufdf混合物)中<2ppmchop(表7)。平均而言，在所有的試驗(yàn)性規(guī)模運(yùn)行中，hmw蛋白質(zhì)降低約1.1％(表8)，在所有的試驗(yàn)性規(guī)模運(yùn)行中，lmw蛋白質(zhì)降低約0.19％(表9)。表6.用于試驗(yàn)性規(guī)模運(yùn)行的captoadhere柱大小試驗(yàn)性規(guī)模運(yùn)行bh直徑(cm)cv(l)第1次運(yùn)行21101.6第2次運(yùn)行21101.6第3次運(yùn)行20143.1第4次運(yùn)行19142.9第5次運(yùn)行19142.9第6次運(yùn)行222510.8第7次運(yùn)行222510.8第8次運(yùn)行21.5101.7第9次運(yùn)行20143.1第10次運(yùn)行222510.8表7.試驗(yàn)性規(guī)模chop數(shù)據(jù)*在ph6.5的深度過(guò)濾后的chophccf是收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液表8.在12次試驗(yàn)性規(guī)模運(yùn)行中的平均％hmw蛋白質(zhì)降低平均％hmw蛋白質(zhì)降低0.95±0.49表9.在12次試驗(yàn)性規(guī)模中的平均％lmw蛋白質(zhì)降低平均％lmw蛋白質(zhì)降低0.19±0.08在oec后，混合物中的chodna和泄露的蛋白a低于可檢測(cè)。實(shí)施例8.以生產(chǎn)規(guī)模執(zhí)行在大小為157l的生產(chǎn)規(guī)模柱(100cm直徑×20cm高度)上執(zhí)行oec操作模式。在生產(chǎn)規(guī)模下，將柱裝載至～96g/l。生產(chǎn)規(guī)模的兩次運(yùn)行中的％產(chǎn)率都≥95％。在所有的生產(chǎn)規(guī)模運(yùn)行中，oec模式混合物chop小于17ppm(表10)，其在下游清除至小于可檢測(cè)的chop水平。平均而言，在兩此生產(chǎn)規(guī)模運(yùn)行中，hmw降低約1.1％，lmw降低0.1％而酸性物質(zhì)降低1.65％。表10.生產(chǎn)規(guī)模的chop(ppm)數(shù)據(jù)步驟第1次運(yùn)行第2次運(yùn)行hcce3050032500蛋白a混合物57496157captoadhere樹(shù)脂(oec)1617在oec后，混合物中的chodna和泄露的蛋白a低于可檢測(cè)。實(shí)施例9.oec對(duì)其他mab的適用性使用蛋白a混合物作為這些運(yùn)行的裝載物。選擇裝載和洗脫條件使得能夠進(jìn)行oec模式。下表顯示了裝載密度、％產(chǎn)率、與樹(shù)脂結(jié)合的mab(g/l)、裝載物和混合物中的雜質(zhì)(表11、12、13和14)。表11.oec對(duì)其他mab的應(yīng)用性：chop表12.oec對(duì)其他mab的應(yīng)用性：％hmw蛋白質(zhì)表13.oec對(duì)其他mab的應(yīng)用性：％泄露的蛋白a*小于可檢測(cè)的表14.oec對(duì)其他mab的應(yīng)用性：chodna實(shí)施例10.基于kp值的aex層析操作模式在完整的流通(f/t)層析中，kp<0.1且沒(méi)有蛋白質(zhì)與樹(shù)脂結(jié)合。在弱分配層析(wpc)中，kp為0.1至20，且在產(chǎn)物和層析基質(zhì)之間存在弱分配。在結(jié)合和洗脫模式下，產(chǎn)物與樹(shù)脂緊密結(jié)合，kp>100，但裝載密度限于產(chǎn)物結(jié)合容量。然而，在過(guò)載和洗脫型層析(mab3)中，裝載條件是使產(chǎn)物和雜質(zhì)kp>100，并且雖然產(chǎn)物在達(dá)到其結(jié)合容量后仍然流通，但雜質(zhì)仍保持與樹(shù)脂結(jié)合，并且沒(méi)有貫穿直到雜質(zhì)達(dá)到其結(jié)合容量，所述雜質(zhì)的結(jié)合容量高于產(chǎn)物結(jié)合容量。洗脫條件是使多肽產(chǎn)物kp<2?；厥战Y(jié)合的產(chǎn)物，但大部分雜質(zhì)仍然保持結(jié)合(雜質(zhì)kp>100)。依此，該模式能夠提供良好的雜質(zhì)清除率，同時(shí)提供非常高的產(chǎn)率(例如，～95％)(表15)。表15.mab3作為captoadhere樹(shù)脂上的模式抗體在弱分配條件(kp＝2.4)和過(guò)載和洗脫條件(kp>100)下的柱運(yùn)行的層析圖展示了增加mabkp對(duì)層析圖的產(chǎn)物貫穿區(qū)的影響(圖9)。wpc裝載條件：ph5.5，4.4ms/cm；wpc洗滌條件：20mm醋酸鹽ph5，4.4ms/cm。oec裝載條件：ph6.5，5.5ms/cm；oec洗脫條件：20mmmesph6.5,～1ms/cm。表16.在典型的流通方法條件下，分析用于結(jié)合aex樹(shù)脂的mab的aex精細(xì)純化步驟模式抗體：mab3*假定在3.5g/l滴度收獲12,500l**ca樹(shù)脂為$3500/l實(shí)施例11.不同樹(shù)脂的oec應(yīng)用性根據(jù)分子的pi，可以向下列多個(gè)模式樹(shù)脂(captoadhere、qma、mephypercel、heahypercel、ppahypercel、captommc)應(yīng)用oec。結(jié)合在captoadhere樹(shù)脂上的多肽產(chǎn)物性質(zhì)上是更疏水的，并可以通過(guò)降低洗脫緩沖液的電導(dǎo)率從柱上洗脫結(jié)合的產(chǎn)物(圖5)。然而，產(chǎn)物在樹(shù)脂上結(jié)合的模式和產(chǎn)物從樹(shù)脂上洗脫的模式不限于疏水性相互作用，因此oec操作模式還可以廣泛的用于其他的層析材料。表17展示了oec可用于其他cex樹(shù)脂和iex樹(shù)脂。除非另外指出，否則洗脫緩沖液是20mmmes。oec的潛力不限于上述樹(shù)脂，且正在進(jìn)行評(píng)估。圖10顯示了mab3在qma樹(shù)脂上的貫穿分析。圖11中顯示了mab4在captoadhere樹(shù)脂上的貫穿分析。圖12顯示了mab4在captommc樹(shù)脂上的貫穿分析。圖13顯示了mab3在captoadhere樹(shù)脂上的貫穿分析。表17.不同樹(shù)脂的oec應(yīng)用性**porosxsmab3裝載條件：ph5.5，<6ms/cm；洗脫條件：緩沖液a-50mm醋酸鹽ph5.5，～3ms/cm，緩沖液b-350mm醋酸鹽ph5.5，～24ms/cm，梯度：在10cv中20-85％，混合：1-8cv。實(shí)施例12.在oec上的梯度洗脫洗脫優(yōu)化研究的另一個(gè)目標(biāo)是評(píng)估梯度洗脫條件對(duì)captoadhere樹(shù)脂上oec模式的作用。研發(fā)了用于洗脫結(jié)合的產(chǎn)物的洗脫階段(表18)。在梯度洗脫運(yùn)行中，可以基于要求改變移動(dòng)相的離子強(qiáng)度、ph、組成和濃度。表18顯示了運(yùn)行的條件：裝載(ph和電導(dǎo)率)和洗脫(ph和電導(dǎo)率梯度)條件。表中顯示的所有數(shù)據(jù)都是從用150g/lmab3裝載密度裝載的層析運(yùn)行中獲得的。進(jìn)行這些運(yùn)行作為證實(shí)可以在oec層析模式下實(shí)施梯度洗脫以及可以優(yōu)化梯度斜率(鹽濃度(mm)/柱體積)這一概念的證據(jù)?？梢?jiàn)相比裝載物，％hmws平均降低38％(表18)。在5.5ms/cm電導(dǎo)率運(yùn)行中，chop降低至<20ppm，而在10ms/cm的更高電導(dǎo)率運(yùn)行中，獲得了～150ppm的混合物chop(表19)。表18.oec上梯度洗脫運(yùn)行：％hmw數(shù)據(jù)表19.oec上梯度洗脫運(yùn)行：chop數(shù)據(jù)本發(fā)明涉及如下實(shí)施方案：1、用于從包含多肽和一種或多種污染物的組合物中純化多肽的方法，所述方法包括a)以超過(guò)層析材料對(duì)于多肽的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量的量將組合物裝載到層析材料上，b)在一種或多種污染物仍然與層析材料結(jié)合的條件下，從層析材料上洗脫多肽，和c)混合包含步驟a)和b)的層析流出液中的多肽的級(jí)分。2、實(shí)施方案1的方法，其中多肽是抗體或免疫粘附素。3、實(shí)施方案2的方法，其中多肽是免疫粘附素。4、實(shí)施方案2的方法，其中多肽是抗體。5、實(shí)施方案4的方法，其中抗體是單克隆抗體。6、實(shí)施方案5的方法，其中單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體，或人抗體。7、實(shí)施方案5的方法，其中單克隆抗體是igg單克隆抗體。8、實(shí)施方案4的方法，其中抗體是抗原結(jié)合片段。9、實(shí)施方案8的方法，其中抗原結(jié)合片段是fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、scfv、di-scfv、bi-scfv、串聯(lián)(di,tri)-scfv、fv、sdab、三功能抗體、bite、雙抗體或三價(jià)抗體。10、實(shí)施方案1的方法，其中多肽是酶、激素、融合蛋白、含有fc的蛋白質(zhì)、免疫綴合物、細(xì)胞因子或白介素。11、實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)的方法，其中至少一種污染物是中華倉(cāng)鼠卵巢蛋白(chop)、宿主細(xì)胞蛋白(hcp)、泄露的蛋白a、羧肽酶b、核酸、dna、產(chǎn)物變體、聚集的蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)基組分、慶大霉素、多肽片段、內(nèi)毒素和病毒性污染物中的任何一種或多種。12、實(shí)施方案1-11中任一項(xiàng)的方法，其中層析材料是混合模式材料、陰離子交換材料、疏水性相互作用材料，或親和材料。13、實(shí)施方案1-12中任一項(xiàng)的方法，其中裝載密度在約50g/l至約2000g/l之間。14、實(shí)施方案13的方法，其中裝載密度在約200g/l至約1000g/l之間。15、實(shí)施方案1-14中任一項(xiàng)的方法，其中以約層析材料對(duì)于一種或多種污染物的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量將組合物裝載到層析材料上。16、實(shí)施方案1-15中任一項(xiàng)的方法，其中以層析材料對(duì)于多肽的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量的20倍將組合物裝載到層析材料上。17、實(shí)施方案1-16中任一項(xiàng)的方法，其中層析材料對(duì)多肽的分配系數(shù)大于30。18、實(shí)施方案17的方法，其中層析材料對(duì)多肽的分配系數(shù)大于100。19、實(shí)施方案1-18中任一項(xiàng)的方法，其中方法還包括使用裝載緩沖液和洗脫緩沖液。20、實(shí)施方案19的方法，其中洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的電導(dǎo)率的電導(dǎo)率。21、實(shí)施方案20的方法，其中裝載緩沖液具有約4.0ms至約7.0ms的電導(dǎo)率。22、實(shí)施方案20的方法，其中洗脫緩沖液具有約0.0ms至約7.0ms的電導(dǎo)率。23、實(shí)施方案19的方法，其中洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的電導(dǎo)率的電導(dǎo)率。24、實(shí)施方案23的方法，其中裝載緩沖液具有約4.0ms至約10.0ms的電導(dǎo)率。25、實(shí)施方案23的方法，其中裝載緩沖液具有約4.0ms至約7.0ms的電導(dǎo)率。26、實(shí)施方案23的方法，其中洗脫緩沖液具有約5.5ms至約17.0ms的電導(dǎo)率。27、實(shí)施方案19的方法，其中洗脫緩沖液的電導(dǎo)率在約10倍柱體積(cv)中以從約5.5ms至約1.0ms的梯度減少。28、實(shí)施方案19的方法，其中洗脫緩沖液的電導(dǎo)率在約15cv中以從約5.5ms至約1.0ms的梯度減少。29、實(shí)施方案19的方法，其中洗脫緩沖液的電導(dǎo)率在約5cv中以從約10.0ms至約1.0ms的梯度減少。30、實(shí)施方案19的方法，其中洗脫緩沖液的電導(dǎo)率在約10倍cv中以從約10.9ms至約1.0ms的梯度減少。31、實(shí)施方案19的方法，其中洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的ph的ph。32、實(shí)施方案31的方法，其中裝載緩沖液具有約4至約9的ph。33、實(shí)施方案31的方法，其中洗脫緩沖液具有約4至約9的ph。34、實(shí)施方案19的方法，其中洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的ph的ph。35、實(shí)施方案34的方法，其中裝載緩沖液具有約4至約9的ph。36、實(shí)施方案34的方法，其中洗脫緩沖液具有約4至約9的ph。37、實(shí)施方案1-36中任一項(xiàng)的方法，其中組合物是來(lái)自親和層析、陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析或疏水性相互作用層析的洗出液。38、實(shí)施方案37的方法，其中親和層析是蛋白a層析。39、實(shí)施方案1-38中任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)一步純化多肽。40、實(shí)施方案39的方法，其中通過(guò)病毒過(guò)濾進(jìn)一步純化多肽。41、實(shí)施方案39的方法，其中通過(guò)親和層析、陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析和疏水性相互作用層析中的一種或多種進(jìn)一步純化多肽。42、實(shí)施方案1-41中任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)一步濃縮多肽。43、實(shí)施方案42的方法，其中通過(guò)超濾、滲濾或超濾和滲濾的組合濃縮多肽。44、實(shí)施方案39-43中任一項(xiàng)的方法，還包括組合多肽與可藥用的運(yùn)載體。當(dāng)前第1頁(yè)12