專利名稱：一種降解石油的耐油耐鹽菌株及其篩選方法和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于微生物育種及生態(tài)領域，尤其是一種降解石油的耐油耐鹽菌株及其篩選方法和應用。
背景技術(shù)：
石油作為主要的能源物質(zhì)對人類社會的發(fā)展起到了至關重要的作用，但在石油開采、運輸、裝卸、加工和使用過程中不可避免的會對環(huán)境造成污染。據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界每年約有1.0 XIOki kg石油通過各種途徑進入土壤或水體，污染地下水、流入海洋，改變水生環(huán)境，使水體動植物和海洋生物都受到威脅。隨著全球環(huán)境的不斷惡化，生態(tài)環(huán)境的安全越來越受到人們的關注。石油對環(huán)境的危害主要集中在海洋和土壤。石油漂浮在海面上，迅速擴散形成油膜，可通過擴散、蒸發(fā)、溶解、乳化、光降解以及生物降解和吸收等進行遷移、轉(zhuǎn)化。油類可沾附在魚鰓上，使魚窒息；抑制水鳥產(chǎn)卵和孵化，破壞其羽毛的透水性，降低水產(chǎn)品質(zhì)量。形成的油膜阻礙水體的復氧作用，影響海洋浮游生物生長，破壞海洋生態(tài)平衡，此外，還可破壞海濱風景，影響其旅游環(huán)境等。石油進入土壤后則改變土壤的有機質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)，影響土壤中微生物的生長繁殖和分布變化；大量的石油會堵塞土壤孔隙，對土壤中酶的活性也有抑制作用；另外，石油經(jīng)過土壤生態(tài)系統(tǒng)的一系列作用后某些成分在作物中形成積累，從而影響糧食質(zhì)量，并進入食物鏈，危及人類健康。石油污染的處理方法主要有物理法、化學法、生物法及不同方法的組合。物理處理法的特點是相對簡單、安全，適用于突發(fā)溢油的回收并控制溢油的擴散。化學方法是見效快，即使在惡劣的天氣下也可以在短時間內(nèi)處理大面積的溢油，但缺點是使用消油劑等化學藥劑浪費能源，可能產(chǎn)生二次污染；凝油性能較低，生產(chǎn)工藝復雜，成本偏高，價格昂貴，難以在實際中得到應用。生物處理法，自然界中存在著大量能夠降解石油的微生物，通過人工篩選、培育，甚至 改良這些微生物，然后將其投放到受污染區(qū)。石油烴類的生物降解，具有成本低、見效快、無污染的特點。生物修復技術(shù)是國際上具有發(fā)展?jié)摿Φ沫h(huán)境污染治理技術(shù)。通過檢索，發(fā)現(xiàn)以下幾篇與本專利申請相關的專利公開文獻:1.耐低溫石油降解菌株、培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基及其應用(CN102021128A)，本發(fā)明涉及耐低溫石油降解菌株、培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基及其應用，本發(fā)明的耐低溫石油降解菌株為Paracoccus sp.D17和Paracoccus sp.D24 ;篩選上述兩種菌用液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由每1000 mL 培養(yǎng)基液體由 0.5 g NaCl, 0.1 g K2HPO4,0.1 g NH4H2PO4,0.1 g (NH4)2SO4j0.02 gMgSO4.7H20，0.3 g KNO3, 700-900 mL油田廢水和余量的超純水組成；篩選上述兩種菌用的固體培養(yǎng)基，其由液體培養(yǎng)基每1000 mL另外加入15 20 g瓊脂，再在培養(yǎng)基表面均勻涂20 30 UL滅菌原油形成；上述兩種菌應用于石油烴降解和土壤或水體石油污染的生物修復中。本發(fā)明的兩種低溫菌可應用于低溫環(huán)境中，對低溫環(huán)境中土壤石油污染的治理具有重大價值。
2.一株降解石油的細菌及其應用(CN1580241)，公開了一株降解石油的細菌及其應用。本發(fā)明所提供的降解石油的細菌是蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)HP CGMCCNa 1141。實驗證明，該菌株能有效地改善原油的性質(zhì)，原油酸值提高8倍以上，輕組份增加，含蠟含膠降低率30% - 50%，原油流變性變好，油水間界面張力降低，發(fā)酵液中有機酸等物質(zhì)含量增加；其代謝原油途徑為次末端氧化，產(chǎn)生了一種新型脂類表面活性劑。該菌株可廣泛應用于采油工程領域特別是微生物強化采油領域。3.一株降解石油烴的菌株及其應用(CN101691552A)，公開了一株降解石油烴的菌株及其應用。該菌株為檸檬酸桿菌(CitiObacter sp.)WTS，其保藏編號為CGMCCN0.3253。本發(fā)明的菌株具有很強的降解石油烴的能力。本發(fā)明的菌株、菌劑及其應用方法為我國進行石油污染土壤的生物修復工作提供理論依據(jù)，對我國油田地區(qū)環(huán)境保護工作以及石油運輸過程中因泄漏而造成污染的修復工作具有重大意義，加快石油污染生物修復工作的進展，具有重要的經(jīng)濟意義。通過對比，本發(fā)明專利申請與上述專利公開文獻存在本質(zhì)的不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種降解石油的耐油耐鹽性好的菌株，該菌株是一種生長速度快，能以石油為唯一碳源的菌株，可用于石油污染地的生物修復。同時，也提供了一種降解石油的耐油耐鹽菌株的篩選方法，該方法能篩選出以石油為唯一碳源的菌種，操作簡便、快捷，能顯著縮短菌株篩選時間。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:一種降解石油的耐油耐鹽菌株，名稱為SY-1，分類名稱:大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏編號為=CGMCC N0.7075，保藏日期:2012年12月31日，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心。而且，所述菌株對石油的降解率為40%_50%。而且，所述菌株使用的培養(yǎng)基配方:KH2PO43.4 g，Na2HPO4 1.5 g, (NH4)2SO4 4.0g，MgSO4 0.7 g, NaCl 1.6 g,酵母粉 0.0lg, Tween-80 0.6 mL,石油 5.0g 25.0 g，自來水1000 mL, pH 7.2 7.6，不同階段添加不同含量石油。而且，所述菌株以石油為唯一碳源。而且，所述菌株的耐鹽性為NaCl質(zhì)量濃度為7%。而且，所述菌株對石油的耐性為石油質(zhì)量濃度為10%。如上所述的降解石油的耐油耐鹽菌株的篩選方法，篩選步驟如下:⑴取樣:選取某油田儲油罐和采油井處2-10 cm的土壤，除去雜物將其裝入無菌自封袋內(nèi)備用；⑵菌株初篩:稱取土壤樣品制成土壤懸液，按體積比為1:8 12將土壤懸液加入到石油質(zhì)量濃度為0.5%的無機礦物鹽培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3 d后進行4個周期的菌種馴化，馴化步驟是:按體積比為1:8 12取上一次的培養(yǎng)液加入到含有石油的無菌無機礦物鹽培養(yǎng)液中(石油濃度從0.5-2.5 g/100mL，每次增加0.5 g石油)，取最后一次馴化菌液，梯度稀釋成10-1，10_2，10_3，10_4，10_5，10_6，10_7，分別取 10_5，10_6，10_7 稀釋菌液 0.5mL 分別加入到牛肉膏蛋白胨、PDA培養(yǎng)基、高氏I號固體培養(yǎng)基平板上，涂布均勻，于30°C培養(yǎng)2-3 d，挑取不同菌落形態(tài)的菌株，保存?zhèn)溆?；⑶菌株復篩；挑取步驟⑵中分離保存的菌株，分別接種到含有0.5 g石油/IOOmL無機礦物鹽培養(yǎng)基固體平板上，分別于30°C培養(yǎng)2-3 d，挑取在菌落周圍形成噬油斑的菌株，劃線分離為單菌株，保藏備用；⑷菌株耐油特性:將步驟⑶中待測定的菌株活化后種子液，按3%的接種量接入每100 mL含石油分別為0.5 g、l g、2 g、4 g、6 g、8 g、10 g、12 g的無機鹽礦物培養(yǎng)液中，30°C >160^200 r/min培養(yǎng)6 8 d，取培養(yǎng)液顏色改變并變渾濁的菌株進入下一步；(5)菌株耐鹽特性:將步驟⑷中待測定菌株活化后分別以3%的接種量接入每100HiL含質(zhì)量分數(shù)為1%、3%、5%、7%和9%的NaCl的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30°C，16(T200 r/min，培養(yǎng)1(T14 h，在質(zhì)量濃度為7%的NaCl中能夠生長的菌株即為降解石油的耐油耐鹽菌株。如上所述的降解石油的耐油耐鹽菌株在對石油污染地進行生態(tài)修復中的應用。如上所述的降解石油的耐油耐鹽菌株在制備石油污染地生態(tài)修復的菌種發(fā)酵劑中的應用。利用如上所述的降解石油的耐油耐鹽菌株制備得到的菌種發(fā)酵劑。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果如下:1.本發(fā)明菌株的耐油耐鹽性好，為革蘭氏陰性菌，短桿狀，有鞭毛，運動，無芽孢，檸檬酸鹽、葡萄糖銨鹽陽性，產(chǎn)過氧化氫酶，無明膠酶，該菌生長速度快，能以石油為唯一碳源生長，并具有能夠降解石油的特性。2.本發(fā)明菌株在最適培養(yǎng)溫度和pH條件下，有利于擴大培養(yǎng)，并且可以制成菌種發(fā)酵劑，投放到石油污染地進行生態(tài)修復。3.本發(fā)明篩選方法利用石油馴化和平板梯度涂布法篩選出能以石油為唯一碳源的菌種，該方法操作簡便、快捷，能顯著縮短菌株篩選的時間。


圖1為本發(fā)明菌株電鏡掃描圖；圖2為本發(fā)明菌株16S rDNA鑒定分析的PCR電泳圖譜；圖3為本發(fā)明菌株系統(tǒng)進化樹；圖4為本發(fā)明降解率測定時所用標準曲線；圖5為本發(fā)明菌株石油降解前后物質(zhì)變化氣相色譜圖；其中，I為降解前石油組分；2為發(fā)明菌株降解后石油組分。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的技術(shù)路線為:將采集的土樣 用無菌生理鹽水制成溶液，在搖床上振蕩30min制成土壤懸浮液，吸取混勻后的土壤懸浮液10 mL加入到100 mL石油質(zhì)量濃度為0.5%的無菌礦物鹽培養(yǎng)液中，置搖床中培養(yǎng)(180 r/min，30°C)。3 d后進入4個周期的菌種馴化(取上一次的培養(yǎng)液10 mL加入到新配置滅菌的不同石油質(zhì)量濃度礦物鹽培養(yǎng)液中)，馴化時原油的濃度不斷升高，從0.5 -2.5 g/100 mL每次增加0.5 g。將最后一次馴化液梯度稀釋后進行涂布分離篩選，分離出利用石油效果較好的菌株，測定菌株對石油和鹽分的耐受性，用紫外及可見分光光度法測定降解率，獲得較好的降解效果。本發(fā)明對篩選的菌株進行了初步鑒定，通過生理生化及一些輔助的菌株鑒定試驗，得出SY-1菌株具有耐油、耐鹽性，革蘭氏陰性菌，短桿狀，有鞭毛，運動，無芽孢，檸檬酸鹽、葡萄糖銨鹽陽性，產(chǎn)過氧化氫酶，無明膠酶等，通過16S rDNA鑒定為大腸埃希氏菌，目前尚未有對該菌降解石油的報道。所得結(jié)果為菌株的降解機理等研究奠定了基礎。本發(fā)明篩選出的降解石油的菌株SY-1號，生長速度快，在最適培養(yǎng)溫度和pH條件下，有利于擴大培養(yǎng)，制成菌種發(fā)酵劑，投放到污染地進行生態(tài)修復。以本發(fā)明篩選出的降解石油的SY-1號菌株為出發(fā)菌株進行石油生物降解試驗，在30°C，180 r/min，遮光條件下培養(yǎng)7 d后，用石油醚進行萃取，采用紫外及可見分光光度計在225 nm處測定其吸光度值，根據(jù)不同濃度石油標準曲線計算殘余油量，由測試組與對照組計算石油的降解率。 所使用的培養(yǎng)基為:石油質(zhì)量濃度為1%的無機礦物鹽培養(yǎng)液=KH2PO4 0.34 g，Na2HPO4 0.15 g，(NH4)2S040.4 g, MgSO4 0.07 g, NaCl 0.16 g，酵母粉 0.001 g, Tween-80 0.06 mL,自來水 100mL, pH 7.2 7.6，石油 1.0 g。1.一種降解石油的耐油耐鹽菌株，名稱為SY-1，分類名稱大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏編號為=CGMCC N0.7075，保藏日期:2012年12月31日，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號 院3號，中國科學院微生物研究所，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。2.如上所述的降解石油的耐油耐鹽菌株的篩選方法，步驟如下:(I)取樣:在油田儲油罐和采油井附近選定好取樣點，先除去表層約2 cm的土壤，取2-10 cm處的土壤，除去雜物將其裝入無菌自封袋內(nèi)，并記錄好取樣地點、環(huán)境和日期等。(2)菌株初篩:稱取10 g土壤樣品加入到90 mL滅完菌的生理鹽水中，加適量無菌玻璃珠放置在搖床上振蕩30 min,制成土壤懸液。取10 mL 土壤懸液加入到100 mL石油質(zhì)量濃度為 0.5% 的無機礦物鹽培養(yǎng)液中(KH2PO4 0.34 g, Na2HPO4 0.15 g, (NH4) 2S040.4 g,MgSO4 0..07 g，NaCl 0.16 g，酵母粉 0.001 g, Tween-80 0.06 mL,自來水 100 mL，pH 7.2 7.6,石油0.5 g),置于搖床中培養(yǎng)(180 r/min, 30°C )。3 d后進行4個周期的菌種馴化(取上一次的培養(yǎng)液10 mL加入到100 mL新配置的不同質(zhì)量濃度石油無菌礦物鹽培養(yǎng)液中，馴化時石油濃度不斷升高，從0.5 -2.5 g/100 mL每次增加0.5 g)。取最后一次馴化菌液ImL加入到9 mL無菌生理鹽水中，混勻，制成1:10稀釋液，依次梯度稀釋成10_2，10_3，10_4，10_5，10_6，10_7菌液，分別取10_5，10' 10_7稀釋菌液0.5 mL，分別加入到制備好的固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g, NaCl 5.0 g，自來水1000 mL, pH7.2-7.4,瓊脂25 g，121°C滅菌20 min)、PDA培養(yǎng)基(稱取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加入I 000mL自來水煮沸30 min，用六層紗布濾成清液。加水至I 000 mL，加入20 g蔗糖完全溶解，PH自然，瓊脂25 g，121°C滅菌20 min)、高氏I號固體培養(yǎng)基平板(可溶性淀粉20 g，KNO31.0 g, K2HPO4 0.5 g, MgSO4.7H20 0.5 g, NaCl 0.5 g, FeSO4.7H20 0.01 g，瓊脂 25 g,pH7.4，121 °C滅菌20 min)上，用玻璃涂布器涂布均勻，每個稀釋度涂布三個平板，將平板放置于30°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2-3 d，挑取不同菌落形態(tài)的菌株進行保存?zhèn)溆谩?3)菌株復篩:挑取(2)中分離保存的菌種，分別劃線接種到含質(zhì)量濃度0.5%石油為唯一碳源的無機礦物鹽培養(yǎng)基固體平板上(KH2PO4 3.4 g, Na2HPO41.5 g, (NH4)2SO4 4.0g，MgSO4 0.7 g, NaCl 1.6 g，酵母粉 0.01 g, Tween-80 0.6 mL，自來水 1000 mL, pH 7.2 7.6，石油5.0 g，瓊脂25 g)上，分別放置于30°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2-3 d，挑取生長較快的菌株(在菌落周圍形成明顯噬油斑，且噬油斑越大說明菌株利用石油的能力越強)，從中篩選出能以石油為唯一碳源生長的菌種，經(jīng)多次劃線分離為單菌落，保藏。(4)菌株耐油特性:在250mL三角瓶中裝入100 mL無機礦物鹽培養(yǎng)液(KH2PO4 0.34g, Na2HPO4 0.15 g, (NH4)2SO40.4 g, MgSO4 0.07 g，NaCl 0.16 g,酵母粉0.001 g, Tween-800.06 mL,自來水 100 mL, pH 7.2 7.6，石油添加量分別為 0.5 g、l g、2 g、4 g、6 g、8 g、10 g，12 g)121°C滅菌20 min后將待測定的菌株活化后種子液按3%的接種量接入各培養(yǎng)瓶，在搖床上(30°C，180 r/min)培養(yǎng)7 d后觀察各測試瓶變化情況(菌株生長良好的培養(yǎng)液顏色會發(fā)生改變并變渾濁，否則石油將漂浮在上層，培養(yǎng)液比較澄清)。(5)菌株耐鹽特性:在250 mL三角瓶中裝入100 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液(牛肉膏，
0.3 8，分別按1%，3%，5%，7%，9%的質(zhì)量分數(shù)添加似(:1，蛋白胨，1.0 g，自來水，100 mL，pH為7.0-7.2)，將待測定菌株活化后以3%的接種量接入NaCl質(zhì)量分數(shù)不同的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30°C，180 r/min，培養(yǎng)12 h，測定OD6tltl值，結(jié)果見表I。表I SY-1菌株在不同鹽度下生長情況
權(quán)利要求
1.一種降解石油的耐油耐鹽菌株，其特征在于:名稱為SY-1，分類名稱:大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏編號為=CGMCC N0.7075，保藏日期:2012年12月31日，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解石油的耐油耐鹽菌株，其特征在于:所述菌株對石油的降解率為40%-50%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解石油的耐油耐鹽菌株，其特征在于:所述菌株使用的培養(yǎng)基配方=KH2PO4 3.4 g, Na2HPO4 1.5 g, (NH4) 2S04 4.0 g, MgSO4 0.7 g, NaCl 1.6 g，酵母粉 0.0lg, Tween-80 0.6 mL，石油 5.0 25.0 g，自來水 1000 mL，pH 7.2 7.6，不同階段添加不同含量石油。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的石油的耐油耐鹽菌株，其特征在于:所述菌株以石油為唯一碳源。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解石油的耐油耐鹽菌株，其特征在于:所述菌株的耐鹽性為NaCl質(zhì)量濃度為7%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解石油的耐油耐鹽菌株，其特征在于:所述菌株對石油的耐性為石油質(zhì)量濃度為10%。
7.—種如權(quán)利要求1至6任一項所述的降解石油的耐油耐鹽菌株的篩選方法，其特征在于:篩選步驟如下: ⑴取樣:選取某 油田儲油罐和采油井處2-10 cm的土壤，除去雜物將其裝入無菌自封袋內(nèi)備用； ⑵菌株初篩:稱取土壤樣品制成土壤懸液，按體積比為1:8 12將土壤懸液加入到石油質(zhì)量濃度為0.5%的無機礦物鹽培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3 d后進行4個周期的菌種馴化，馴化步驟是:按體積比為1:8 12取上一次的培養(yǎng)液加入到含有石油的無菌無機礦物鹽培養(yǎng)液中(石油濃度從0.5-2.5 g/100mL,每次增加0.5 g石油)，取最后一次馴化菌液，梯度稀釋成10—1，10_2，10_3，10_4，10_5，10_6，10_7，分別取10_5，10_6，10_7稀釋菌液0.5mL分別加入到牛肉膏蛋白胨、PDA培養(yǎng)基、高氏I號固體培養(yǎng)基平板上，涂布均勻，于30°C培養(yǎng)2-3 d，挑取不同菌落形態(tài)的菌株，保存?zhèn)溆茫? ⑶菌株復篩；挑取步驟⑵中分離保存的菌株，分別接種到含有0.5 g石油/IOOmL無機礦物鹽培養(yǎng)基固體平板上，分別于30°C培養(yǎng)2-3 d，挑取在菌落周圍形成噬油斑的菌株，劃線分離為單菌株，保藏備用； ⑷菌株耐油特性:將步驟⑶中待測定的菌株活化后種子液，按3%的接種量接入每100mL含石油分別為0.5 g、l g、2 g、4 g、6 g、8 g、10 g、12 g的無機鹽礦物培養(yǎng)液中，30°C、160^200 r/min培養(yǎng)6 8 d，取培養(yǎng)液顏色改變并變渾濁的菌株進入下一步； (5)菌株耐鹽特性:將步驟⑷中待測定菌株活化后分別以3%的接種量接入每100 mL含質(zhì)量分數(shù)為1%、3%、5%、7%和9%的NaCl的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30°C，16(T200 r/min，培養(yǎng)1(T14 h，在質(zhì)量濃度為7%的NaCl中能夠生長的菌株即為降解石油的耐油耐鹽菌株。
8.如權(quán)利要求1至6任一項所述的降解石油的耐油耐鹽菌株在對石油污染地進行生態(tài)修復中的應用。
9.如權(quán)利要求1至6任一項所述的降解石油的耐油耐鹽菌株在制備石油污染地生態(tài)修復的菌種發(fā)酵劑中的應用。
10.一種利用如權(quán)利要求1至6任一項所述的降解石油的耐油耐鹽菌株制備得到的菌種發(fā) 酵劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降解石油的耐油耐鹽菌株，名稱為SY-1，分類名稱大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏編號為CGMCC No.7075，保藏日期2012年12月31日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發(fā)明菌株的耐油耐鹽性好，為革蘭氏陰性菌，短桿狀，有鞭毛，運動，無芽孢，檸檬酸鹽、葡萄糖銨鹽陽性，產(chǎn)過氧化氫酶，無明膠酶，該菌生長速度快，能以石油為唯一碳源進行生長，并具有降解石油的特性。
文檔編號B09C1/10GK103205378SQ201310095318
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者王昌祿, 張麗紅, 王玉榮, 李貞景, 陳勉華 申請人:天津科技大學