一種體外刺激外周血γδT細胞高效增殖的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種體外刺激外周血YsT細胞高效增 殖的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 過繼細胞免疫治療是癌癥治療的一種強有力的手段，該治療采用體外方法大量擴 增T細胞。"快速擴增程序（REP)"是一種生產(chǎn)出大量的T淋巴細胞行之有效且常規(guī)使用的 方法?？焖贁U增程序是一種抗原非依賴性的方案，該方案采用過量的致死劑量伽瑪輻照異 體外周血單個核細胞（PBMC)作為飼養(yǎng)層細胞，同時使用抗CD3抗體（0KT3)和外源重組人 白細胞介素（rhIL)-2。白細胞介素-2是一種T細胞增殖和生長所需的強有力的T細胞有絲 分裂原。外周血表達Fc-yl受體（FcyRI)，它可以與抗⑶3抗體免疫球蛋白（Ig)的Fc段 相互作用。作為一種抗⑶3抗體，0KT3可綁定到T細胞表面的T細胞受體（TCR)-⑶3-復 合物上。抗⑶3-T細胞受體交聯(lián)以及通過綁定到⑶3的抗體Fc而產(chǎn)生的T細胞和外周血 單個核細胞之間的相互作用，可同時提供信號1和共刺激信號-2,導致T細胞增殖而不會引 發(fā)無能或早期凋亡。這種快速擴增程序可以致使T淋巴細胞在14天內(nèi)擴增1000倍。
[0003] 雖然快速擴增程序是一種常用的方法，但它的應(yīng)用受到材料和技術(shù)上的限制。在 臨床應(yīng)用快速擴增程序時，一個T細胞中通常會用200個外周血單核細胞來刺激。所以快 速擴增程序需要用血細胞分離機大容量白細胞單采術(shù)從多個健康的捐助者收集大量異體 外周血單個核細胞?？焖贁U增方案中所收集的外周血單個核細胞來自異體，需要經(jīng)過大量 的實驗室檢測，以確認處于無菌狀態(tài)，這可能既昂貴又費時。由于外周血單個核細胞來自于 多個捐助者，收集而來的外周血單個核細胞對T細胞擴增的維持作用在捐助者個體間可能 會表現(xiàn)出很大的差異性。所有這些問題都會對大型多中心隨機臨床試驗有所妨礙。
[0004] 為了克服以上快速擴增程序的問題，基因工程改造過的人類紅白血病細胞株K562 細胞已經(jīng)被用來取代外周血單個核細胞。K562細胞本身既不表達內(nèi)源性的HLAII類分 子（因此減少了同種異體反應(yīng)），也不表達諸如CD86、CD83、4-1BBL、0X40L、IC0SL(B7H2， B7RP1)或CD40L等共刺激分子。K562細胞也不表達抑制分子，如H)L1 (B7H1)，PDL2 (B7DC)， B7H3和B7H4 (B7X，B7S1)。在三種人類IgGFc受體中，K562細胞內(nèi)源性高表達CD32,而CD16 或⑶64并不會高表達。K562細胞表達黏附分子⑶54 (ICAM-1)和⑶58 (LFA-3)，這會增強 K562細胞與T細胞間的相互作用并提高T細胞的增值效率?；蚬こ谈脑霮562很容易進 行，轉(zhuǎn)基因在改建后的K562細胞中的表達比較穩(wěn)定。多項臨床試驗已證實使用K562為飼 養(yǎng)層細胞進行T細胞擴增是一種安全可靠的方法。
[0005] 絕大多數(shù)T淋巴細胞屬于a0T細胞。它們的T細胞受體由a和0鏈組成。一 個小部分T淋巴細胞表達T細胞受體gamma和delta異二聚體（yS)鏈。yST細胞在腫 瘤和感染的免疫監(jiān)視方面起到重要作用。YST細胞能夠滲入人體實體腫瘤內(nèi)部，影響腫 瘤生長并且殺死癌細胞。能被YST細胞滲入實體腫瘤包括腎癌、膀胱癌、卵巢癌、結(jié)直腸 癌、乳腺癌和鼻咽癌。Vy9VS2T細胞是人類外周血yST細胞的主要亞群，幾個早期階段 的過繼免疫治療癌癥的臨床試驗已經(jīng)使用了Vy9Vs2T細胞。
[0006]Vy9VS2T細胞只占外周血T細胞一小部分，大約0.5-5%。為了有足夠量的 Vy9VS2T細胞進行過繼細胞免疫治療，病人往往需要經(jīng)過大容量白細胞單采術(shù)來收集 大量外周血單核細胞。單采術(shù)技術(shù)可收集1X109個外周血單個核細胞，生產(chǎn)幾十億的 Vy9VS2T細胞用于多次注射。IPP(異戊烯焦磷酸）是人類yST細胞Vy9VS2亞群的 天然抗原，已用于yST細胞的擴增。異戊烯焦磷酸的合成類似物溴醇焦磷酸（BrHPP)及 雙膦酸鹽唑來膦酸（Zometa)也可以選擇性地激活擴增人類Vy9VS2T細胞。這些化合物 現(xiàn)在已廣泛用于Vy9VS2T細胞的體外擴增。唑來膦酸是美國食品和藥物管理局批準的， 市場上可以買到的治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的雙膦酸鹽藥物。這種藥物抑制法尼基焦磷酸合 酶（FPP)，該酶在甲羥戊酸通路中的異戊烯焦磷酸下游發(fā)揮作用，因此可以增加細胞內(nèi)的異 戊烯焦磷酸的水平。
[0007] 在本發(fā)明將K562細胞進行遺傳修飾從而產(chǎn)生可應(yīng)用于大規(guī)模擴增YST細胞的 飼養(yǎng)層細胞。經(jīng)過遺傳修飾的K562細胞穩(wěn)定表達CD64高親和力Fc受體基因，共刺激分子 ⑶86,和共刺激分子⑶137L基因（4-1BBL)。⑶137L是4-1BB受體的配體，主要表達在活化 的T細胞表面上。⑶137信號轉(zhuǎn)導參與抑制激活誘導性細胞死亡，與⑶4+T細胞相比，這會 有利于⑶8+T細胞的擴增。⑶137也會增強記憶型⑶8T細胞的發(fā)育。⑶86是⑶28共刺激 受體的配體，而⑶28在靜息和激活的T細胞中均有表達。通過⑶64與0KT3抗⑶3單克隆 抗體的Fc部分相互作用，第一信號（0KT3-⑶3)以及⑶86-⑶28和⑶137L-⑶137共刺激信 號會雙信號同時刺激T淋巴細胞。K562細胞飼養(yǎng)層細胞已用于a0T細胞擴增，但它們對 Vy9VS2T細胞的擴增能力尚待確定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中Vy9Vs2T細胞的擴增能 力差，抗腫瘤細胞毒性差的技術(shù)瓶頸，從而提出一種擴增能力高并且，具備完整的抗腫瘤細 胞毒性，可殺死實體腫瘤細胞和非實體腫瘤細胞的體外刺激外周血YST細胞高效增殖的 方法。
[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種體外刺激外周血yST細胞高效增殖的 方法，所述方法為：
[0010] 1)將目的基因⑶64,⑶86,和⑶137L插入到K562細胞的基因座中得到單克隆細 胞株；
[0011] 2)從外周血中分離單個核細胞，并用唑來膦酸和白細胞介素-2預(yù)處理外周血單 個核細胞；
[0012] 3)預(yù)處理過的外周血單個核細胞與遺傳修飾過的K562細胞共同培養(yǎng)，并加入 0KT3抗體和白細胞介素-2。
[0013] 優(yōu)選的，所述的體外刺激外周血yST細胞高效增殖的方法，其中，所述基因座為 人類第19號染色體AAVS1基因座。
[0014] 優(yōu)選的，所述的體外刺激外周血YsT細胞高效增殖的方法，其中，所述方法的步 驟1)的具體步驟為：采用鋅指核酸酶技術(shù)，以位點特異性的方式引導將目的基因插入到K562細胞人類第19號染色體AAVS1基因座；然后用嘌呤霉素對改造后的K562細胞進行篩 選，以獲得單克隆細胞株；最后用流式細胞儀分析篩選得到的高表達目的基因的單細胞克 隆株。
[0015] 優(yōu)選的，所述的體外刺激外周血yST細胞高效增殖的方法，其中，所述方法的步 驟2)的具體步驟為：先用淋巴細胞分離液通過密度梯度離心法從白細胞層將外周血單個 核細胞分離出來。再將外周血單個核細胞種植到孔板中，使用A頂-V培養(yǎng)基，并加入唑來膦 酸和人類重組白細胞介素-2刺激外周血單個核細胞。
[0016] 更為優(yōu)選的，所述的體外刺激外周血yST細胞高效增殖的方法，其中，所述唑來 膦酸為5yM;所述0KT3抗體為50ng/ml。
[0017] 優(yōu)選的，所述的體外刺激外周血yST細胞高效增殖的方法，其中，所述人類重組 白細胞介素-2為300IU/ml;外周血單個核細胞的密度2X106/ml。
[0018] 進一步的，所述的體外刺激外周血yST細胞高效增殖的方法，其中，所述方法的 步驟3)的具體步驟為：當細胞激活并擴增后，用修飾過的K562細胞，0KT3抗體，白細胞介 素2和唑來膦酸混合物共培養(yǎng)細胞，進行yST細胞擴增；共培養(yǎng)時添加0KT3抗體，重組人 白細胞介素-2和唑來膦酸促進yST細胞進一步增殖。
[0019]更為進一步的，所述的體外刺激外周血yST細胞高效增殖的方法，其中，所述K562細胞擴增使用前先經(jīng)y輻照或與混有絲裂霉素C處理滅活。
[0020] 本發(fā)明還公開了任一所述的體外