本發(fā)明涉及一種線粒體靶向過(guò)氧化氫分子熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

活性氧(ROS)是生物體內(nèi)在很多生理和病理過(guò)程起著非常重要作用的一些含氧原子的物質(zhì)總稱(chēng)，包括自由基(羥基自由基和超氧陰離子自由基等)和非自由基(過(guò)氧化氫和次氯酸等)。各種活性氧(ROS)中，過(guò)氧化氫是生命系統(tǒng)中最重要的一種，是大部分氧化酶過(guò)程中的產(chǎn)物并參與很多生物體內(nèi)調(diào)節(jié)過(guò)程。在正常生理濃度下，H₂O₂對(duì)生物正常的生理過(guò)程是有益的，它們參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的可逆氧化，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的磷酸化到基因表達(dá)等細(xì)胞過(guò)程。過(guò)氧化氫在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖方面起著十分重要的作用。但是，體內(nèi)異常的H₂O₂會(huì)導(dǎo)致許多疾病的產(chǎn)生，例如炎癥性疾病，癌癥，糖尿病，心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)性疾病。因此，適時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)體內(nèi)過(guò)氧化氫的含量對(duì)于相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷以及病理的研究具有十分重要的指導(dǎo)意義。

然而，目前對(duì)H₂O₂的檢測(cè)缺少靶向性，不能對(duì)細(xì)胞內(nèi)某一特定的細(xì)胞器內(nèi)的過(guò)氧化氫進(jìn)行檢測(cè)，特別缺少對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體靶向的過(guò)氧化氫探針，從而缺少研究細(xì)胞病變過(guò)程中對(duì)線粒體中過(guò)氧化氫濃度變化情況的檢測(cè)工具。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前過(guò)氧化氫分子熒光探針檢測(cè)所面臨的問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)分子設(shè)計(jì)，合成出一種具有響應(yīng)時(shí)間快以及線粒體靶向性的過(guò)氧化氫熒光探針。

本發(fā)明還提供了上述過(guò)氧化氫分子熒光探針的制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種線粒體靶向過(guò)氧化氫分子熒光探針，其結(jié)構(gòu)式如式I所示：

簡(jiǎn)記為Mito-H₂O₂。

上述的線粒體靶向過(guò)氧化氫分子熒光探針的制備方法，它包括以下步驟：

(1)將1eq的4-溴二乙胺基苯胺、0.1eq的醋酸鈀和0.3eq的三(鄰甲基苯基)磷溶于由Et₃N和DMF按照體積比5:3組成的溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下將4eq的4-乙烯基吡啶注入上述溶液中，加熱反應(yīng)；用TCL板檢測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完全后，分離提純可得到化合物1，化合物1結(jié)構(gòu)式如下所示：

(2)將1eq的化合物1和1eq的對(duì)芐基溴頻哪醇硼酸酯溶于乙腈中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回流反應(yīng)，用TCL板檢測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完全后，分離提純可以得到目標(biāo)化合物Mito-H₂O₂。

上述的過(guò)氧化氫熒光探針的合成路線如下：

所述步驟(1)中加熱反應(yīng)溫度為120℃，反應(yīng)時(shí)間為14小時(shí)。

所述步驟(1)中分離提純的具體方法為：將反應(yīng)產(chǎn)物先用二氯甲烷萃取2-3次，飽和食鹽水洗滌2-3次，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，最后用柱色譜層析進(jìn)行分離；所述柱色譜分離的洗脫劑配比為甲醇：二氯甲烷＝1:10。

所述步驟(2)中加熱反應(yīng)的溫度為85℃，反應(yīng)時(shí)間為7小時(shí)。

所述步驟(2)中分離提純的具體方法為：將反應(yīng)產(chǎn)物減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，然后柱色譜層析分離；所述柱色譜層析分離的洗脫劑配比為甲醇：二氯甲烷＝1:20。

本發(fā)明還提供了一種上述的過(guò)氧化氫分子熒光探針的應(yīng)用，所述熒光探針可以應(yīng)用于水環(huán)境和生物細(xì)胞體系中過(guò)氧化氫的含量傳感檢測(cè)；所述的傳感檢測(cè)包含熒光檢測(cè)、細(xì)胞成像檢測(cè)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：(1)探針的合成只需要兩步就可以完成，且后處理過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單；(2)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了H₂O₂分子探針的選擇性快速檢測(cè)，并且選擇性好，抗其他分子干擾能力強(qiáng)。此外，用肉眼就可以觀察到溶液顏色的變化，伴隨著紫外燈下同樣可以觀察到熒光顏色變化，是一種具有生色傳感功能的熒光探針。(3)此探針可以應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體中的過(guò)氧化氫的檢測(cè)，通過(guò)與商業(yè)化線粒體染料進(jìn)行比較，其對(duì)線粒體內(nèi)過(guò)氧化氫成像的重合率高，兩種染料的共定位系數(shù)為0.90，說(shuō)明此探針可以作為細(xì)胞內(nèi)線粒體內(nèi)過(guò)氧化氫檢測(cè)探針?；诖颂结樀奶禺愋郧绎@著的顏色變化，該試劑也可作為顯示水溶液中過(guò)氧化氫分子存在的專(zhuān)一性指示劑，可進(jìn)行對(duì)過(guò)氧化氫實(shí)時(shí)定性及定量的熒光檢測(cè)。故而，本發(fā)明是一種簡(jiǎn)單，快速，靈敏的過(guò)氧化氫分子特異性檢測(cè)試劑，在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。其性能將在實(shí)施例中結(jié)合附圖給予詳細(xì)說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例一中探針Mito-H₂O₂的¹H NMR圖譜；

圖2是探針Mito-H₂O₂隨過(guò)氧化氫的加入熒光譜圖的變化情況；

圖3是探針Mito-H₂O₂對(duì)不同離子和分子的選擇性熒光譜圖；

圖4是探針Mito-H₂O₂對(duì)不同離子和分子的選擇性柱狀圖數(shù)據(jù)，其中1.Blank；2.Br^-；3.Cys；4.F^-；5.Fe²⁺；6.Fe³⁺；7.GSH；8.HClO；9.Hg²⁺；10.NO；11.NO^2-；12.NO^3-；13.S^2-；14.過(guò)氧叔丁醇；15.過(guò)氧叔丁謎；16.H₂O₂；

圖5是探針Mito-H₂O₂溶液在過(guò)氧化氫加入前后溶液用紫外燈照射后熒光顏色的變化；

圖6是探針Mito-H₂O₂過(guò)氧化氫熒光探針檢測(cè)外源性過(guò)氧化氫熒光成像圖；其中a)參比樣細(xì)胞明場(chǎng)成像圖，b)參比樣綠通道熒光成像圖，c)參比樣明場(chǎng)與熒光成像圖重合圖片，d)探針濃度為10μM加入到HeLa細(xì)胞中培養(yǎng)30min后明場(chǎng)圖，e)過(guò)氧化氫50μM加入后30min后的綠通道熒光成像圖，f)明場(chǎng)與熒光成像圖重合圖片；

圖7是Mito-H₂O₂過(guò)氧化氫熒光探針檢測(cè)外源性過(guò)氧化氫熒光成像圖與商業(yè)化染料線粒體紅的共定位成像圖。a)探針濃度為10μM與線粒體紅10nM加入到HeLa細(xì)胞中培養(yǎng)30min后明場(chǎng)圖，b)加入過(guò)氧化氫并培養(yǎng)30min后綠通道熒光成像圖，c)商業(yè)染料線粒體紅熒光成像圖，d)明場(chǎng)、綠通道與紅通道疊加圖，e)綠通道與紅通道疊加圖，f)綠通道與紅通道疊加箭頭部分熒光強(qiáng)度比較，g)綠通道與紅通道疊加部分強(qiáng)度散點(diǎn)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，實(shí)施例中化合物的號(hào)碼對(duì)于上述方案中化合物的號(hào)碼。

實(shí)施例1

化合物1的合成：

將4-溴二乙胺基苯胺(1.0g，2.4mmol，1eq)，醋酸鈀(50mg，0.2mmol，0.1eq)，三(鄰甲基苯基)磷(150mg，0.5mmol，0.3eq)，溶于(體積比Et₃N：DMF＝5:3)30mL溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，然后將4-乙烯基吡啶(1.0g，9.6mmol，4eq)用注射器打入上述溶液中。120℃加熱，反應(yīng)14小時(shí)。用TCL板檢測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完全后，用二氯甲烷萃取2-3次，飽和食鹽水洗滌2-3次，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進(jìn)行分離得到化合物1，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:10?；衔?的產(chǎn)率為75％。

化合物Mito-H₂O₂的合成：

將化合物1(100mg，0.396mmol，1eq)，對(duì)芐基溴頻哪醇酯(117.6mg，0.396mmol，1eq)，溶于3mL乙腈中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，85℃加熱回流反應(yīng)7小時(shí)，用TCL板檢測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完全后，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進(jìn)行分離得到目標(biāo)終產(chǎn)物，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:20。得產(chǎn)物Mito-H₂O₂，產(chǎn)率為68％。此化合物的氫譜為：¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.03(d,J＝6.4Hz,2H),7.84(d,J＝7.9Hz,2H),7.79(d,J＝6.0Hz,2H),7.59(d,J＝16.1Hz,1H),7.53(d,J＝7.9Hz,4H),6.85(d,J＝15.7Hz,1H),6.75(s,2H),6.03(s,2H),3.10(s,6H),1.34(s,12H).具體的合成譜圖如附圖1所示。

實(shí)施例2

化合物Mito-H₂O₂過(guò)氧化氫熒光探針隨過(guò)氧化氫加入當(dāng)量的增加熒光譜圖的變化

取實(shí)施例1制備的Mito-H₂O₂過(guò)氧化氫熒光探針溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，制成1mmol/L儲(chǔ)備液。從儲(chǔ)備液中取出30μL加入到5mL的離心管當(dāng)中，加入不同當(dāng)量(0-10eq)的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液，用PBS緩沖溶液(0.1mol/L，pH＝8.3)與DMF體積比為2:1的溶液稀釋至3mL，以410nm為激發(fā)光測(cè)量其熒光性質(zhì)。熒光光譜如圖2所示。由圖2可見(jiàn)，隨著過(guò)氧化氫加入當(dāng)量的增加熒光逐漸增強(qiáng)。

實(shí)施例3

化合物Mito-H₂O₂過(guò)氧化氫熒光探針對(duì)不同分子或離子的選擇性

從實(shí)施例2中熒光探針儲(chǔ)備液中取出30μL加入到5mL的離心管當(dāng)中，分別加入等摩爾量的競(jìng)爭(zhēng)分子標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中一個(gè)加入等摩爾量的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液，1h后以410nm為激發(fā)光檢測(cè)溶液的熒光發(fā)射光譜變化，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。由圖3和圖4可以發(fā)現(xiàn)，其他金屬離子對(duì)化合物Mito-H₂O₂的熒光幾乎沒(méi)有影響，而過(guò)氧化氫溶液的加入使化合物Mito-H₂O₂的熒光顯著增強(qiáng)。

實(shí)施例4

化合物Mito-H₂O₂熒光探針對(duì)過(guò)氧化氫的可視化檢測(cè)

從實(shí)施例2中熒光探針儲(chǔ)備液中取出30μL加入到5mL的樣品管當(dāng)中，加入80摩爾量的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果如圖5所示，過(guò)氧化氫可以使化合物Mito-H₂O₂熒光探針的PBS：DMF體積比為2:1的緩沖溶液下熒光顏色發(fā)生明顯的變化，伴隨著紫外燈下肉眼可視的過(guò)氧化氫誘導(dǎo)熒光探針發(fā)出明亮的黃色熒光(圖5)，說(shuō)明是該化合物是一種具有生色傳感功能的熒光探針。

實(shí)施例5

化合物Mito-H₂O₂過(guò)氧化氫熒光探針對(duì)細(xì)胞外源性過(guò)氧化氫熒光成像

我們將本發(fā)明探針應(yīng)用于HeLa細(xì)胞中對(duì)外源性的過(guò)氧化氫進(jìn)行熒光成像應(yīng)用。具體操作步驟如下：

將育有HeLa細(xì)胞的兩個(gè)培養(yǎng)皿進(jìn)行編號(hào)，向兩個(gè)培養(yǎng)皿中分別加入10μM Mito-H₂O₂過(guò)氧化氫探針DMSO溶液，并在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后用PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌三次。一號(hào)培養(yǎng)皿作為參比不加入分析樣，向二號(hào)培養(yǎng)皿中加入50μM的過(guò)氧化氫水溶液后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。用共聚焦顯微鏡對(duì)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞進(jìn)行熒光成像。首先參比培養(yǎng)皿進(jìn)行成像。用488nm的激光進(jìn)行激發(fā)，在明場(chǎng)通道可以觀看到細(xì)胞的輪廓圖，而用綠色通道(500-550nm)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光信號(hào)采集時(shí)觀察不到熒光發(fā)射。對(duì)二號(hào)培養(yǎng)皿進(jìn)行成像研究發(fā)現(xiàn)在綠色通道下可以清醒的看到探針對(duì)H₂O₂的熒光成像圖。此實(shí)驗(yàn)可以說(shuō)明探針Mito-H₂O₂能夠在HeLa細(xì)胞內(nèi)對(duì)外源性的H₂O₂進(jìn)行熒光成像。

實(shí)施例6

化合物Mito-H₂O₂過(guò)氧化氫熒光探針對(duì)細(xì)胞外源性過(guò)氧化氫熒光成像與商業(yè)線粒體染料共定位比較

我們將本發(fā)明探針應(yīng)用與HeLa細(xì)胞中與商業(yè)化的線粒體染料進(jìn)行共定位實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明本探針可以定位到線粒體中，并對(duì)線粒體內(nèi)的外源性的過(guò)氧化氫進(jìn)行熒光成像應(yīng)用。具體操作步驟如下：將10μM Mito-H₂O₂過(guò)氧化氫探針DMSO溶液和商業(yè)化線粒體染料-線粒體紅10nM加入到育有HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)液中在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后，向體系中加入50μM的過(guò)氧化氫水溶液后，再等待30min后用共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像，此時(shí)用藍(lán)光(Ex＝488nm)進(jìn)行激發(fā)并用綠色通道(500-550nm)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光信號(hào)采集可以觀察到有熒光信號(hào)發(fā)出，此為Mito-H₂O₂過(guò)氧化氫探針與過(guò)氧化氫響應(yīng)后發(fā)射的光，用綠光(Ex＝561nm)進(jìn)行激發(fā)并用紅色通道(570-620nm)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光信號(hào)采集，可以觀察到在此通道有熒光信號(hào)發(fā)出，此為商業(yè)化染料線粒體紅發(fā)出的紅光，用軟件進(jìn)行處理可以得出兩種染料的共定位系數(shù)為0.90，說(shuō)明本探針可以對(duì)細(xì)胞線粒體中的過(guò)氧化氫進(jìn)行熒光成像，具體結(jié)果圖如圖7所示。