本本發(fā)明屬于生物分析檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞膜定位的檢測(cè)鋅離子熒光探針、其合成方法及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熒光探針已成為細(xì)胞生物學(xué)研究中的重要工具，它使研究者能在復(fù)雜生物環(huán)境中直觀地看到特定的離子、分子以及生化反應(yīng)過程。通過亞細(xì)胞器定位，熒光探針能檢測(cè)亞細(xì)胞器中的目標(biāo)分析物，并能在細(xì)胞特定區(qū)域揭示不同的物理和化學(xué)性質(zhì)。細(xì)胞膜是防止細(xì)胞外物質(zhì)自由進(jìn)入細(xì)胞的屏障，保證了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。除了提供屏障作用外，細(xì)胞膜還是各種代謝以及信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)生的場(chǎng)所。因此，在細(xì)胞膜上對(duì)目標(biāo)分析物的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及成像有助于理解細(xì)胞中的生化反應(yīng)過程，同時(shí)也能及時(shí)地反映細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，從而進(jìn)一步對(duì)相關(guān)疾病進(jìn)行前期診斷及治療。

鋅離子已被證明影響包括增殖、分化、凋亡等多個(gè)細(xì)胞生理過程，被認(rèn)為是生物體不可或缺的微量元素。在生物體內(nèi)，鋅離子除了與蛋白結(jié)合形成金屬蛋白復(fù)合物，還存在有游離態(tài)的自由鋅離子。在生物體的不同組織中，自由鋅離子含量大不相同，以神經(jīng)系統(tǒng)，胰島組織，前列腺組織中含量最為豐富，并且這些組織的特定功能與鋅離子的存在密不可分。通過對(duì)這些組織中的自由鋅離子的檢測(cè)有助于對(duì)阿爾莫茲海默癥、糖尿病、前列腺癌的前期診斷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞膜定位鋅離子熒光探針及其制備方法與應(yīng)用，該探針在復(fù)雜環(huán)境下能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞膜定位且對(duì)鋅離子具有專一的選擇性和較高的靈敏度，其合成方法具有原料廉價(jià)易得、合成步驟簡(jiǎn)單、適合放大合成的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明提供了一種能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜定位的檢測(cè)鋅離子熒光探針，該熒光探針以1,8-萘酰亞胺為熒光母體，酰胺-二甲基吡啶胺為識(shí)別基團(tuán)，烷基長(zhǎng)鏈為定位基團(tuán)，烷基鏈長(zhǎng)度為n,熒光探針結(jié)構(gòu)通式如下：

其中4≤n≤18，并且n為整數(shù)。

本發(fā)明提供細(xì)胞膜定位鋅離子熒光探針的制備方法，該方法具體步驟如下：

1)4-硝基-1,8-萘酐的合成：將重鉻酸鈉用冰醋酸按0.1-0.5g/mL比例溶解，再加入相對(duì)于重鉻酸鈉0.1-0.5倍質(zhì)量的5-硝基苊，120-150℃下回流反應(yīng)3-8小時(shí)。將反應(yīng)液與2-5倍體積的冰水混合，過濾得到濾餅進(jìn)行重結(jié)晶，得到4-硝基-1,8-萘酐。

2)4-氨基-1,8-萘酐的合成：將4-硝基-1,8-萘酐用無水乙醇按0.1-0.5g/mL比例溶解，將相對(duì)于4-硝基-1,8-萘酐3-5倍質(zhì)量的氯化亞錫用濃鹽酸按1-2g/mL溶解后，逐滴滴入上述4-硝基-1,8-萘酐和無水乙醇中，80-100℃下回流反應(yīng)8-12小時(shí)過夜。反應(yīng)液用1-5mol/L的碳酸鈉溶液調(diào)中性使產(chǎn)物析出，過濾，濾餅重結(jié)晶，得到4-氨基-1,8-萘酐。

3)4-(2-氯乙酰)氨基-1,8-萘酐的合成：將4-氨基-1,8-萘酐用干燥的THF按0.01-0.05g/mL比例，加入相對(duì)于4-氨基-1,8-萘酐5-10倍質(zhì)量的氯乙酰氯，室溫下攪拌3-10小時(shí)后，反應(yīng)體系由渾濁變澄清。旋干溶劑，柱層析分離，旋干得到4-(2-氯乙酰)氨基-1,8-萘酐。

4)4-(2-二甲基吡啶胺基乙酰)氨基-1,8-萘酐的合成：將4-(2-氯乙酰)氨基-1,8-萘酐、DPA、DIPEA和KI按質(zhì)量比1:0.5-0.8:1.5-2:0.2-0.5混合，加入乙腈按0.01-0.05g/mL比例溶解4-(2-氯乙酰)氨基-1,8-萘酐，氮?dú)獗Ｗo(hù)下80-100℃回流8-12小時(shí)過夜。反應(yīng)結(jié)束后旋干溶劑，用旋干產(chǎn)物5-10倍質(zhì)量的甲醇重結(jié)晶，得4-(2-二甲基吡啶胺基乙酰)氨基-1,8-萘酐。

5)探針分子的合成：將4-(2-二甲基吡啶胺基乙酰)氨基-1,8-萘酐、烷基胺按質(zhì)量比1:1-2混合，加入乙醇按0.01-0.05g/mL比例溶解4-(2-二甲基吡啶胺基乙酰)氨基-1,8-萘酐，加熱至70-90℃回流8-12小時(shí)過夜。旋干溶劑后，柱層析分離得到探針分子。上述步驟5)中，所述烷基胺碳鏈長(zhǎng)為4-18間的整數(shù)。

上述步驟5)中，所述柱層析的洗脫劑為二氯甲烷:甲醇＝50：1，流速10-20ml/min，溫度20-25℃。

上述步驟3)中所述柱層析的洗脫劑為二氯甲烷，，流速10-20ml/min，溫度20-25℃。

具體合成路線如下：

本發(fā)明提供的熒光探針可應(yīng)用于細(xì)胞膜定位檢測(cè)鋅離子及其在生物醫(yī)學(xué)中對(duì)鋅離子的檢測(cè)。

本發(fā)明具有以下特征：

探針分子制備原料易得，合成路線簡(jiǎn)單，后處理方便。探針對(duì)鋅離子識(shí)別能力專一，響應(yīng)速度快。與現(xiàn)有鋅離子探針相比，該探針能對(duì)細(xì)胞膜實(shí)現(xiàn)定位，監(jiān)控細(xì)胞對(duì)鋅離子的釋放，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有極其重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1本發(fā)明熒光探針的結(jié)構(gòu)式；

圖2本發(fā)明熒光探針合成路線圖；

圖3本發(fā)明實(shí)施例1制備的烷基碳鏈長(zhǎng)n＝12熒光探針C12核磁譜圖氫譜；

圖4本發(fā)明實(shí)施例2制備的烷基碳鏈長(zhǎng)n＝14熒光探針C14核磁譜圖氫譜；

圖5本發(fā)明實(shí)施例3制備的烷基碳鏈長(zhǎng)n＝18熒光探針C18核磁譜圖氫譜；

圖6本發(fā)明實(shí)施例1制備的烷基碳鏈長(zhǎng)n＝12熒光探針C12核磁譜圖碳譜；

圖7本發(fā)明實(shí)施例2制備的烷基碳鏈長(zhǎng)n＝14熒光探針C14核磁譜圖碳譜；

圖8本發(fā)明實(shí)施例4制備的烷基碳鏈長(zhǎng)n＝18熒光探針C18核磁譜圖碳譜；

圖9實(shí)施例1制備的n＝12的熒光探針加入不同金屬離子后的熒光變化情況；

圖10實(shí)施例1制備的n＝12的熒光探針與不同濃度的Zn²⁺作用后的熒光光譜圖；

圖11實(shí)施例1制備的n＝12的熒光探針在結(jié)腸癌細(xì)胞中細(xì)胞膜定位效果；

圖12實(shí)施例1制備的n＝12的熒光探針在前列腺細(xì)胞RWPE-1中共聚焦成像結(jié)果，其中，a,b,c分別為細(xì)胞的亮場(chǎng)圖，d為加入探針培養(yǎng)30分鐘后的細(xì)胞成像，e為加入Zn²⁺培養(yǎng)10分鐘后的細(xì)胞成像，e為加入EDTA后培養(yǎng)5分鐘后的細(xì)胞成像。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。

實(shí)施例1：細(xì)胞膜定位鋅離子熒光探針的制備，基本合成過程如下：

(1)4-硝基-1,8-萘酐的合成：

在單口瓶中，將11.2g(37.5mmol)重鉻酸鈉溶于50ml冰醋酸，再緩慢加入3g(15mmol)的5-硝基苊，回流反應(yīng)3小時(shí)。將反應(yīng)液與200mL冰水混合，過濾得到濾餅用水進(jìn)行重結(jié)晶，得到4-硝基-1,8-萘酐2.35g，產(chǎn)率65％。

(2)4-氨基-1,8-萘酐的合成：

在燒瓶?jī)?nèi)加入1.2g(5mmol)的4-硝基-1,8-萘酐，10mL無水乙醇作為溶劑，隨后將4g(18mmol)的氯化亞錫用3.5mL濃鹽酸溶解，逐滴滴入燒瓶?jī)?nèi)，90℃下回流反應(yīng)12小時(shí)過夜。反應(yīng)液用2mol/L的碳酸鈉溶液調(diào)中性后過濾，濾餅用水重結(jié)晶，得到4-氨基-1,8-萘酐780mg，產(chǎn)率73％。

(3)4-(2-氯乙酰)氨基-1,8-萘酐的合成：

在燒瓶中用30mL干燥的THF溶解430mg(2mmol)的4-氨基-1,8-萘酐，加入1mL的氯乙酰氯，室溫下攪拌3小時(shí)后，反應(yīng)體系由渾濁變澄清。旋干溶劑， 25℃下柱層析分離，旋干后得到黃色固體242mg，即4-(2-氯乙酰)氨基-1,8-萘酐，洗脫劑為二氯甲烷，產(chǎn)率42％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.25(s,1H),8.71(d,J＝7.2Hz,1H),8.69–8.60(m,2H),8.31(d,J＝8.8Hz,1H),7.94–7.90(m,1H),4.42(s,2H).

(4)4-(2-二甲基吡啶胺基乙酰)氨基-1,8-萘酐的合成：

在燒瓶中加入150mg(0.5mmol)的4-(2-氯乙酰)氨基-1,8-萘酐，94mg(0.45mmol)DPA，220mg(1.5mmol)DIPEA，40mg(0.24mmol)KI，50mL乙腈作溶劑，氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流過夜。旋干溶劑后，用1mL甲醇重結(jié)晶，得黃色蠟狀物175mg，即4-(2-二甲基吡啶胺基乙酰)氨基-1,8-萘酐，產(chǎn)率78％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.62(s,1H),9.08(d,J＝8.5Hz,1H),8.62(d,J＝7.1Hz,1H),8.55(dd,J＝17.9,8.4Hz,2H),8.40(d,J＝4.5Hz,2H),8.09–8.03(m,1H),7.75(t,J＝7.5Hz,2H),7.46(d,J＝7.7Hz,2H),7.29–7.20(m,2H),4.06(s,4H),3.66(s,2H).

(5)探針分子的合成：

在燒瓶中加入90mg(0.2mmol)的4-(2-二甲基吡啶胺基乙酰)氨基-1,8-萘酐，90mg(0.48mmol)十二烷基胺，20mL乙醇做溶劑，90℃加熱回流過夜12小時(shí)。旋干溶劑后，25℃下柱層析分離后，旋干得到黃色蠟狀固體97mg即探針分子，洗脫劑為二氯甲烷:甲醇＝50：1，產(chǎn)率80％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.73(s,1H),9.08(d,J＝8.6Hz,1H),8.69(d,J＝7.2Hz,1H),8.61(dd,J＝23.5,8.2Hz,1H),8.45(d,J＝4.2Hz,1H),7.89–7.78(m,1H),7.62(td,J＝7.6,1.6Hz,1H),7.31(d,J＝7.6Hz,1H),7.15(dd,J＝7.4,5.0Hz,1H),4.22–4.12(m,1H),4.08(s,2H),3.62(s,1H),1.77–1.69(m,2H),1.62(s,5H),1.25(s,11H),0.87(t,J＝6.7Hz,3H).

實(shí)施例2細(xì)胞膜定位鋅離子熒光探針的制備，基本合成過程如下：

用十四烷基胺替代實(shí)施例1步驟5)中的十二烷基胺，其余條件同實(shí)施例1進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)率75％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.08(d,J＝8.5Hz,1H),8.68(d,J＝7.2Hz,1H),8.60(dd,J＝27.5,8.3Hz,2H),8.45(d,J＝4.5Hz,2H),7.91–7.78(m,1H),7.62(td,J＝7.6,1.4Hz,2H),7.32(d,J＝7.7Hz,2H),7.15(dd,J＝6.9,5.3Hz,2H),4.22–4.13(m,2H),4.08(s,4H),3.62(s,2H),1.81–1.68(m,3H),1.25(s,20H),0.87(t,J＝6.7Hz,4H)..

實(shí)施例3細(xì)胞膜定位鋅離子熒光探針的制備，基本合成過程如下：

用十八烷基胺替代實(shí)施例1步驟5)中的十二烷基胺，其余條件同實(shí)施例1進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)率73％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.74(s,1H),9.09(d,J＝8.5Hz,1H),8.69(d,J＝7.0Hz,1H),8.62(dd,J＝25.9,8.3Hz,2H),8.45(d,J＝4.4Hz,2H),7.86–7.81(m,1H),7.62(t,J＝6.9Hz,2H),7.31(d,J＝7.7Hz,2H),7.18–7.12(m,2H),4.20–4.14(m,2H),4.08(s,4H),3.62(s,2H),1.73(d,J＝6.7Hz,2H),1.25(s,30H),0.88(t,J＝6.7Hz,3H).

圖3-5分別為n＝12,14,18探針的核磁氫譜。

圖6-8分別為n＝12,14,18探針的核磁碳譜。

實(shí)施例4：實(shí)施例1制備的n＝12的熒光探針對(duì)Zn²⁺的選擇性檢測(cè)

圖9中的數(shù)據(jù)是在HEPES(濃度20mM，pH＝7.4):CH₃CN混合溶液(體積比5:5)中測(cè)試所得，激發(fā)波長(zhǎng)為365nm。探針濃度為10μM，再每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中分別加入其它金屬離子(濃度分別均為30μM)Ag⁺,Au⁺,Ca²⁺,Cd²⁺,Co²⁺,Cr³⁺,Cu⁺, Cu²⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,Hg²⁺,K⁺,Mg²⁺,Mn²⁺,Na⁺,Ni²⁺,Pb²⁺,Pd²⁺,Pt²⁺,Zn²⁺。結(jié)果顯示，只有在鋅離子和鉻離子存在條件下發(fā)生熒光增強(qiáng)，且鋅離子存在下發(fā)生的是明顯的紅移增強(qiáng)變化，鉻離子發(fā)生的是藍(lán)移增強(qiáng)變化，而其它金屬離子沒有太明顯變化，因此在上述干擾離子存在的條件下，探針對(duì)鋅離子仍具有較好的選擇性和靈敏度。圖9橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度；

實(shí)施例3：實(shí)施例1制備的n＝12的熒光探針對(duì)鋅離子測(cè)定的響應(yīng)情況

圖10中的數(shù)據(jù)是在HEPES(濃度20mM，pH＝7.4):CH₃CN混合溶液(體積比5:5)中測(cè)試所得，激發(fā)波長(zhǎng)為365nm。探針濃度為10μM，當(dāng)鋅離子的濃度為0,0.1,1,1.5,2,3,4,5,6,8,10,20,30μM依次增加時(shí)，其熒光光譜逐漸發(fā)生明顯紅移增強(qiáng)變化。圖10中橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

實(shí)施例4：實(shí)施例1制備的n＝12的熒光探針在結(jié)腸癌細(xì)胞中細(xì)胞膜定位效果

圖11中細(xì)胞為結(jié)腸癌細(xì)胞，探針濃度為5μM，鋅離子濃度為25μM。在共聚焦小皿中以2萬細(xì)胞/培養(yǎng)皿的濃度接種結(jié)腸癌細(xì)胞，1640培養(yǎng)基培養(yǎng)5天后。吸去培養(yǎng)基，PBS緩沖溶液洗兩遍后，加入2mL新鮮1640培養(yǎng)基，再加入2mM濃度的熒光探針溶液，使其在培養(yǎng)基中濃度為5μM，CO₂培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)30min后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入2mL新鮮培養(yǎng)基，再加入10mM濃度的鋅離子溶液，使其在培養(yǎng)基中濃度為25μM。CO₂培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)5min后，共聚焦顯微鏡405nm激光激發(fā)下成像拍照。可明顯觀測(cè)到探針聚集在細(xì)胞膜上，并與細(xì)胞膜上的鋅離子結(jié)合引起熒光強(qiáng)的增大和波長(zhǎng)紅移。

實(shí)施例5：實(shí)施例1制備的n＝12的熒光探針在前列腺細(xì)胞RWPE-1中共聚焦成像效果

圖12中細(xì)胞為前列腺正常細(xì)胞株RWPE-1，探針濃度為5μM，鋅離子濃度為25μM。在共聚焦小皿中以2萬細(xì)胞/培養(yǎng)皿的濃度接種RWPE-1細(xì)胞，1640培養(yǎng)基培養(yǎng)5天后。吸去培養(yǎng)基，PBS緩沖溶液洗兩遍后，加入2mL新鮮1640培養(yǎng)基，再加入2mM濃度的熒光探針溶液，使其在培養(yǎng)基中濃度為5μM，CO₂培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)30min后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入2mL新鮮培養(yǎng)基，共聚焦顯微鏡下觀察拍照。再加入10mM濃度的鋅離子溶液，使其在培養(yǎng)基中濃度為25μM，共聚焦顯微鏡下觀察拍照。再加入20mM濃度的EDTA溶液，使其在培養(yǎng)基中的濃度為50μM，共聚焦顯微鏡下觀察拍照。其中，a,b,c分別為細(xì)胞的亮場(chǎng)圖，d為加入探針培養(yǎng)30分鐘后405nm激光激發(fā)下的細(xì)胞成像，e為加入Zn²⁺培養(yǎng)10分鐘后405nm激光激發(fā)下的細(xì)胞成像，e為加入EDTA后培養(yǎng)5分鐘后405nm激光激發(fā)下的細(xì)胞成像；可明顯觀測(cè)到加入探針的細(xì)胞在不存在鋅離子的條件下，熒光值很低，當(dāng)加入鋅離子后，熒光大幅提高，之后加入EDTA熒光消失，說明探針存在于細(xì)胞膜上。