本發(fā)明涉及一種用于比率檢測抗生物素蛋白的熒光探針的合成及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)是生命科學(xué)研究的主要內(nèi)容之一，其是細(xì)胞和生物功能的重要體現(xiàn)者。各種蛋白的表達(dá)都與人的正常生理生命活動息息相關(guān)。因而，對于蛋白的檢測、功能的研究、實(shí)時的追蹤顯得極其重要?，F(xiàn)在對蛋白質(zhì)的檢測主要有凱氏定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法、酚試劑法等，這些方法較為繁瑣、費(fèi)時、需大量前期準(zhǔn)備。因此，熒光檢測技術(shù)因?yàn)槠涓哽`敏度、操作簡便、快速響應(yīng)等優(yōu)勢逐漸被成功應(yīng)用于蛋白的檢測與功能研究中。

近年來，基于小分子熒光探針的蛋白檢測方法逐漸受到生物研究工作者的重視，其能夠在蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究以及檢測中起到至關(guān)重要作用。小分子熒光探針與蛋白結(jié)合后的熒光變化能夠?qū)⒌鞍孜⒂^的變化以熒光這種宏觀形式展現(xiàn)給研究工作者，借助生物熒光成像等系統(tǒng)可以觀測到實(shí)時動態(tài)的變化。然而，現(xiàn)在對于大多檢測、標(biāo)記蛋白的熒光探針來說，其局限于單一的熒光增強(qiáng)并伴有藍(lán)移，其受到設(shè)備、樣品等外界因素影響較大。而能夠克服此類缺點(diǎn)的檢測蛋白的比率型熒光探針較為少見。

生物素是動、植物體內(nèi)廣泛存在的一種小分子生長因子，又叫維生素H。其能與抗生物素蛋白(親和素)特異性結(jié)合，且二者親和力比抗原-抗體結(jié)合力高出百萬倍。因此，生物素-親和素系統(tǒng)因?yàn)槠涓哂H和力、高穩(wěn)定性、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供種用于比率檢測抗生物素蛋白的熒光探針，該探針能夠與抗生物素蛋白特異性結(jié)合并進(jìn)行比率的識別。

本發(fā)明的另一目的是提供一類用于比率檢測抗生物素蛋白的熒光探針的合成方法，該方法具有原料低廉、簡單、易提純等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明提供一種用于檢測抗生物素蛋白的比率型熒光探針，以1,8-萘酰亞胺為熒光基團(tuán)，2-(N,N-二乙基氨基)乙?；?氨基為響應(yīng)基團(tuán)，生物素為靶向基團(tuán)，該熒光探針能夠與抗生物素蛋白特異性結(jié)合。當(dāng)向探針測試液中加入抗生物素蛋白后，～470nm的熒光峰逐漸降低而～550nm處熒光峰逐漸增強(qiáng)，該熒光探針具有如下結(jié)構(gòu)：

一種檢測抗生物素蛋白的比率型熒光探針的合成路線，如下：

合成的具體步驟如下：

(1)中間體N-Boc-乙二胺的合成：

將二碳酸二叔丁酯溶于二氯甲烷中，并在冰浴下滴加乙二胺。室溫下攪拌過夜(10-16h)，飽和食鹽水洗滌，并加入無水硫酸鈉干燥，過濾得澄清溶液，旋干得N-Boc-乙二胺無色油狀物。

(2)中間體N-Boc-N-生物素乙二胺的合成：

將EDC.HCl,HOBt.H₂O,三乙胺，生物素溶于DMF中，并向其中加入N-Boc-乙二胺，室溫攪拌18-20h，減壓除去溶劑，硅膠柱分離得N-Boc-N-生物素乙二胺白色固體。

(3)探針的合成：

將N-Boc-N-生物素乙二胺溶于二氯甲烷中，加入三氟乙酸，室溫下攪拌0.5-2h，減壓除去溶劑，殘留物溶于乙醇中，并加入4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙?；?氨基-1,8-萘酐，加熱至80-90℃，3-6h，旋干，硅膠柱分離得到淡黃色固體。

步驟(2)中所述EDC.HCl、HOBt.H₂O、三乙胺、生物素、DMF、N-Boc-乙二胺，其質(zhì)量比為1:1:1.5:1:80:1-1:2:2:100:2。硅膠柱分離，200-300目硅膠，洗脫劑為二氯甲烷：甲醇＝100:1～50:1，分離后需經(jīng)減壓除去溶劑得N-Boc-N-生物素乙二胺。

步驟(3)中所述N-Boc-N-生物素乙二胺、二氯甲烷、三氟乙酸、乙醇、4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙?；?氨基-1,8-萘酐，其質(zhì)量比為1:150:30:200:1-1:200:100:600:1。硅膠柱分離，200-300目硅膠，洗脫劑為二氯甲烷：甲醇＝50:1～20:1，分離后需經(jīng)減壓除去溶劑得淡黃色固體。

所述的檢測抗生物素蛋白的比率型熒光探針在比率識別抗生物素蛋白、蛋白檢測或在生物熒光成像中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有以下特征：

該類探針擁有合成方法操作簡便、原料低廉、產(chǎn)物易純化等優(yōu)點(diǎn)。

該類探針在該探針在水溶液中呈現(xiàn)出～470nm的藍(lán)色熒光，而在甲醇，二甲基亞砜，N,N-二甲基甲酰胺、乙醇等極性溶劑中呈現(xiàn)出～550nm的熒光。在水溶液與甲醇不同比例條件下，～470nm與550nm的熒光峰呈比率變化。

該熒光探針能夠特異性與抗生物素蛋白結(jié)合，當(dāng)向探針測試液中加入抗生物素蛋白后，～470nm的熒光峰逐漸降低而～550nm處熒光峰逐漸增強(qiáng)，從而達(dá)到比率檢測抗生物素蛋白。其可用于蛋白檢測、生物熒光成像領(lǐng)域等。

附圖說明

圖1本發(fā)明提供的熒光探針合成路線圖。

圖2實(shí)施例1制備的熒光探針核磁譜圖氫譜。

圖3中熒光探針濃度為10μm，其在水與甲醇不同比例下熒光光譜圖，橫坐標(biāo)為波長，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

圖4中熒光探針濃度為5μm，其在緩沖液中加入0-2.0當(dāng)量抗生物素蛋白的熒光光譜變化，激發(fā)光為365nm，橫坐標(biāo)為波長，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

圖5中熒光探針濃度為5μm，其在緩沖液中加入0-2.0當(dāng)量抗生物素蛋白的熒光光譜變化，激發(fā)光為405nm，橫坐標(biāo)為波長，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：一種檢測抗生物素蛋白的比率型熒光探針的合成方法。

(1)中間體N-Boc-乙二胺的合成：

將二碳酸二叔丁酯(1.2g，5.5mmol)溶于40mL二氯甲烷中，并在冰浴下滴加2.2mL(33mmol)乙二 胺。反應(yīng)液在室溫下攪拌過夜(10-16h)，飽和食鹽水洗滌三次，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾得澄清溶液，旋干得無色油狀物845mg，產(chǎn)率96％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ4.91(s,1H),3.20–3.14(m,2H),2.80(t,J＝5.9Hz,2H),1.45(s,9H),1.41(s,2H)。

(2)中間體N-Boc-N-生物素乙二胺的合成：

將EDC.HCl(144mg，1.0mmol),HOBt.H2O(182mg,1.0mmol)，三乙胺(350μL，2.1mmol)，生物素(110mg，0.2mmol)溶于10mL DMF中，并向其中加入N-Boc-乙二胺(130mg，0.4mmol)，室溫攪拌20h，減壓除去溶劑，硅膠柱分離，采用200-300目硅膠，洗脫劑為二氯甲烷：甲醇＝100:1～50:1，分離后需經(jīng)減壓除去溶劑得白色固體64mg，產(chǎn)率52％。¹HNMR(400MHz,MeOD)δ4.54–4.46(m,1H),4.33(dd,J＝7.5,4.5Hz,1H),3.29–3.19(m,4H),3.16(t,J＝5.8Hz,2H),2.95(dd,J＝12.7,4.9Hz,1H),2.72(d,J＝12.7Hz,1H),2.22(t,J＝7.3Hz,2H),1.81–1.54(m,5H),1.45(s,9H),1.33(t,J＝7.3Hz,2H)。

(3)探針的合成：

將N-Boc-N-生物素乙二胺(30mg，0.78mmol)溶于4mL二氯甲烷中，加入1mL三氟乙酸，室溫下攪拌1h，減壓除去溶劑，殘留物溶于10mL乙醇中，并加入4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙?；?氨基-1,8-萘酐(25mg，0.78mmol)，加熱至85℃，3h，旋干，硅膠柱分離，采用200-300目硅膠，洗脫劑為二氯甲烷：甲醇＝100:1～50:1，分離后需經(jīng)減壓除去溶劑得淡黃色固體30mg，產(chǎn)率66％。¹HNMR(400MHz,MeOD)δ8.60(d,J＝7.2Hz,1H),8.55(d,J＝8.1Hz,1H),8.51(d,J＝8.5Hz,1H),8.33(d,J＝8.1Hz,1H),7.91–7.83(m,1H),7.81(d,J＝8.2Hz,1H),7.72(d,J＝8.2Hz,1H),7.50–7.38(m,2H),4.47(dd,J＝7.7,4.9Hz,1H),4.38–4.29(m,2H),4.20(d,J＝4.1Hz,2H),3.69–3.49(m,4H),3.32–3.24(m,4H),3.12–3.02(m,1H),2.89(dd,J＝12.8,4.9Hz,1H),2.67(d,J＝12.7Hz,1H),2.06(t,J＝7.3Hz,2H),1.58–1.35(m,10H),1.28–1.17(m,2H).。

將該探針溶于DMSO溶液中，配制成2mM母液；抗生物素蛋白溶于PBS緩沖液中配置成2mM的母液。根據(jù)不同比例配制成所需濃度，測試其熒光光譜變化。

實(shí)施例2：實(shí)施例1制備的熒光探針在水與甲醇不同比例下熒光響應(yīng)情況。

圖3中實(shí)施例1制備的熒光探針濃度為10μM，激發(fā)光為405nm，在水溶液中探針呈現(xiàn)出波長為～470nm的熒光，在甲醇呈現(xiàn)出波長為～550nm熒光，當(dāng)甲醇比例逐漸增加時，波長為～550nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，而波長為～470nm處熒光強(qiáng)度逐漸降低。

實(shí)施例3：實(shí)施例1制備的熒光探針對0-2.0當(dāng)量抗生物素蛋白的響應(yīng)。

圖4中熒光探針濃度為5μM，激發(fā)光為365nm，取10.0μL探針母液溶于4mL PBS緩沖液(pH＝7.4,20 mM)，配制成熒光探針濃度為5μM的測試液。當(dāng)測試液逐漸加入相對于探針0，0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.5，2.0當(dāng)量的抗生物素蛋白(0,1.0，2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,15.0,20.0μL)后，～470nm的熒光強(qiáng)度逐漸降低，而～550nm處熒光逐漸增加。

圖5中熒光探針濃度為5μM，激發(fā)光為405nm，取10.0μL探針母液溶于4mL PBS緩沖液(pH＝7.4,20mM)，配制成熒光探針濃度為5μM的測試液。當(dāng)測試液中逐漸加入0，0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.5，2.0量抗生物素蛋白(0,1.0，2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,15.0,20.0μL)后，波長為～470nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低，而波長為～550nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增加。